聚乳酸-聚羟基乙酸神经导管和骨髓间充质干细胞构建组织工程神经

[目的]用聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly lactide-co-glycolide acid,PLGA)为原料制备新型神经导管,同时对兔骨髓间充质干细胞与PLGA构建组织工程神经的可行性进行观察.[方法]以聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物和壳寡糖为原料,采用静电纺丝工艺制备中空的PLGA神经导管.通过扫描电镜观察材料的微观结构,排水法测定材料的孔隙率.将兔的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养后与导管共培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况,MTT方法检测细胞在材料上的增殖活性.[结果]PLGA神经导管管壁具有疏松多孔结构,管壁纤维直径为18 μm左右,孔隙率为85.4%±1.6%,MTT结果显示导管无细胞毒性.兔骨髓间充质干细胞在导管表面生长良好.[结论]PLGA神经导管具有良好的孔隙率,生物相容性好,是构建组织工程神经的良好材料.     

静电纺丝壳聚糖-明胶复合纤维的制备和体外生物相容性评价

目的采用静电纺丝技术制备壳聚糖-明胶复合纤维,体外评价其生物相容性。方法采用扫描电镜(SEM)观察纤维支架的表面形貌,考察纺丝溶液浓度、黏度以及壳聚糖/明胶质量比对纤维直径和结构的影响。将人成纤维细胞接种在纤维支架表面,绘制细胞生长曲线,观察细胞在支架表面的形态。结果通过静电纺丝技术,制备的壳聚糖-明胶复合纤维均匀、光滑,无珠状结构,纤维平均直径为600 nm～1.6μm。随着纺丝溶液浓度和黏度增加,纤维平均直径增大;随着壳聚糖/明胶质量比增加,纤维直径也随之增大。成纤维细胞在复合纤维支架上生长良好,增殖快,并且保持较好的成纤维细胞形态。结论通过静电纺丝技术制备的壳聚糖-明胶复合纤维具有良好的生物相容性,有望作为皮肤组织工程的支架材料。     

静电纺丝聚乳酸/聚己内酯共混纳米纤维的体外细胞相容性

目的 利用脂肪干细胞(ADSCs)检测不同混合比例静电纺丝聚乳酸/聚己内酯共混支架的生物相容性.方法 聚乳酸(PLA)和聚己内酯(PCL)按3∶1、2∶1、1∶1的重量比混合后经静电纺丝技术制成3种比例的纳米纤维支架(NFS).将兔皮下脂肪分离出的ADSCs接种于NFS上,显微镜观察培养1、3、7d时ADSCs在3种支架上的形态;噻唑蓝(MTT)比色法检测接种后1～7dADSCs在NFS上的增殖和接种后6、24 h的黏附细胞百分率;活死细胞染色比较接种7d时不同NFS上ADSCs的活死细胞数量.结果 3∶1、2∶1、1∶1支架纤维直径分别为(973±65)、(617 ±44)、(432±24) nm;1∶1 NFS上的ADSCs数量明显多于其他两种支架;ADSCs在1∶1 NFS上增殖较快,接种后第6、7天时,较3∶1 NFS及2∶1 NFS组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);1∶1 NFS上黏附的ADSCs数量最多,较另外两组差异有统计学意义(P＜0.05);ADSCs在3种支架上的活细胞百分率分别为(65.60±7.80)％、(69.16±8.30)％、(82.20 ±10.20)％.结论 PLA∶ PCL为1∶1的静电纺丝NFS具有较好的生物相容性.     

PLGA/PEG可吸收电纺聚合膜对大鼠腹腔术后粘连的预防作用研究

目的采用聚乳酸/乙醇酸共聚物(poly-L-lactic/glycolic acid,PLGA)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)以静电纺丝技术制备PLGA/PEG可吸收电纺聚合膜,探讨其对大鼠腹腔术后粘连的预防作用。方法将PLGA和PEG按照19∶1(M/M)混合后溶解于有机溶剂中,采用静电纺丝技术制备PLGA/PEG可吸收电纺聚合膜,并行大体及扫描电镜观察。取SD大鼠54只,体质量180~200 g,随机分为3组,其中正常对照组6只,不进行任何处理;模型组及PLGA/PEG组各24只,采用盲肠浆膜机械损伤方法制备腹腔粘连模型,术中PLGA/PEG组盲肠创面局部覆盖PLGA/PEG可吸收电纺聚合膜,模型组不进行任何处理。术后3 d及1、2、8周,大体观察腹腔粘连情况并参照自定标准对腹腔粘连程度进行评级,PLGA/PEG组观察PLGA/PEG可吸收电纺聚合膜降解情况;各时间点取标本进行组织学观察;以上指标均与正常对照组进行比较。结果采用静电纺丝技术成功制备PLGA/PEG可吸收电纺聚合膜,呈白色、不透明状,质地柔软;扫描电镜观察示,PLGA/PEG可吸收电纺聚合膜主要由纤维无序交错堆积而成,具备微孔结构。术后大鼠均存活至实验完成。大体观察示,PLGA/PEG可吸收电纺聚合膜植入大鼠体内后,随时间延长逐渐降解;PLGA/PEG组腹腔粘连程度较模型组显著降低,各时间点粘连分级比较差异均有统计学意义(P0.05),但尚未达正常对照组水平(P0.05)。组织学观察示,各时间点与模型组相比,PLGA/PEG组盲肠纤维结缔组织增生明显减缓,粘连程度明显降低,仅见少量炎性细胞浸润;但尚未达正常对照组水平。结论 PLGA/PEG可吸收电纺聚合膜能有效预防大鼠术后腹腔粘连,并具有良好生物降解性。     

聚羟基丁酸酯/聚乙二醇纳米复合支架的生物相容性研究

目的:采用聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)/聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)纳米复合生物材料构建三维培养支架并与大鼠髁突软骨细胞(condylar chondrocytes)复合培养,评价其生物相容性。方法:应用静电纺丝法制备PHB/PEG纳米复合生物支架,将大鼠髁突软骨细胞接种于PHB/PEG支架上,分别于复合培养4h,72h时利用荧光显微镜及扫描电子显微镜观察细胞在三维支架上的粘附、铺展及生长情况,并应用MTT四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测细胞的增殖活性,评价其生物相容性。结果:荧光显微镜及扫描电子显微镜观察显示复合培养4h时细胞已粘附于支架表面,部分细胞开始铺展,培养72h细胞在支架表面增殖及生长良好,MTT结果显示PHB/PEG纳米三维支架复合培养大鼠髁突软骨细胞较对照组具有更高的增殖活性。结论:静电纺丝法制备的PHB/PEG纳米复合生物支架可以促进大鼠髁突软骨细胞的粘附、生长和增殖,具有良好生物相容性,为组织工程软骨再生奠定一定的实验基础。     

多孔CPC组织工程肋骨支架制备及BMSCs在其表面增殖黏附的实验研究

目的 通过形态学观察、细胞黏附和细胞增殖实验观察多孔CPC材料作为组织工程肋骨支架的可行性. 方法 取幼猪骨髓分离培养BMSCs并传代,另自制5 mm×5 mm×5 mm大小的多孔CPC材料,micro-CT观察孔径、孔隙率及羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)含量,并与人正常松质骨作对比.取24孔培养板,于孔内置入多孔CPC材料1块,共15块,调整第1代BMSCs浓度为6×10s个/mL,将细胞悬液150 μL滴加到多孔CPC材料上,置于孵育箱中复合培养4、12、24 h后,收集细胞并计数,计算细胞黏附率:行倒置相差显微镜观察、MTT法检测多孔CPC材料表面BMSCs的生长情况:扫描电镜观察接种BMSCs 7 d的多孔CPC材料,并与单纯多孔CPC材料和正常人松质骨对比. 结果 BMSCs与多孔CPC材料复合培养4、12、24 h的细胞黏附率分别为28.00%±0.98%、46.70%4±1.14%和48.50%±1.18%.MTT法检测细胞与材料复合培养1、2、3、4、5、6 d的吸光度(A)值分别为1.103 ±0.214、1.557 ±0.322、1.920 ±0.178、2.564 ±0.226、2.951 ±0.415和3.831 ±0.328,呈明显上升趋势.倒置相差显微镜下可见细胞生长旺盛,贴壁良好,未出现毒性反应.micro-CT检查示多孔CPC材料的孔径均衡,且互相连通,HA含量为(1 101.222 8 ±0.618 4)mg/ccm,孔隙率为70.26%±0.45%;人正常松质骨HA含量为(1 072.552 3 ±0.744 2)mg/ccm,孔隙率为72.82%±0.51%;两组比较差异无统计学意义(P>0.05).扫描电镜观察单纯多孔CPC材料孔径与正常人松质骨孔径大小、结构相似,且互相连通;BMSCs在多孔CPC材料表面排列有序,细胞呈片状,部分呈簇状,细胞形态呈多边形,细胞间可见较多细胞间质. 结论 多孔CPC材料结构和成分均接近正常人松质骨,BMSCs在其表面生长良好,适合作为组织工程肋骨支架材料,但其对细胞的黏附性有待进一步改善.     

纳米PLLA膜复合内皮生长晕细胞的相容性研究

目的 通过观察内皮生长晕细胞(EOCs)与纳米聚-L-乳酸(PLLA)有序纤维膜体外复合培养的生物相容性及黏附、增殖情况,为构建组织修复材料提供理论依据.方法 通过静电纺丝技术制备的纳米PLLA纤维支架,行低温等离子体技术改性及 Ⅰ 型胶原表面涂覆,与EOCs复合培养,测定细胞黏附率及增殖率,观察细胞生长曲线,荧光显微镜及扫描电镜下观察支架材料与种子细胞EOCs形态特征和生物相容性.结果 制备的纳米PLLA膜孔径在300～400 nm之间,孔隙率>90%.各组(单纯细胞组、无序膜组、有序膜组及超级有序膜组)吸光度(A)值均随共培养时间的增加而逐步升高; 从第5天起,有序膜和超级有序膜组A值与无序膜和单纯细胞组比较,差异有统计学意义(P＜0.05); 单纯细胞组和无序膜组各检测时间点A值差异无统计学意义(P>0.05 ).复合培养12 h及24 h后有序膜组和超级有序膜组黏附率则明显高于无序膜组,差异有统计学意义(P＜0.01).复合培养1 d、3 d及7 d后,有序膜组和超级有序膜组的增殖率明显高于无序膜组(P＜0.05,P＜0.01).细胞在支架膜上生长良好,纳米无序膜的细胞生长较散在、杂乱; 有良好空间定向效果的有序膜及超级有序膜支架有利于细胞沿纤维定向附着、伸展、增殖,以超级有序膜更有利于保持其结构.结论 EOCs是理想的组织工程种子来源细胞; 纳米PLLA有序及超级有序膜支架能促进种子细胞在材料表面的黏附、增殖,并能较好地保持细胞的形态,是一种理想的组织修复材料.     

取向蚕丝蛋白支架与间充质干细胞的复合培养

目的探讨不同表面结构的蚕丝蛋白纳米纤维对间充质干细胞生长增殖及分化的影响。方法运用静电纺丝技术制备具有不同取向度的蚕丝蛋白纳米纤维支架,检测不同材料结构的力学性质,分离并纯化骨髓间充质干细胞与取向／非取向纳米纤维支架共培养,以纯蚕丝蛋白膜作对照。测定其细胞毒性及细胞增殖率;扫描电镜观察细胞形态、生长、分布及与材料黏附情况。免疫荧光显微镜观察细胞核形态及细胞骨架排列情况。结果扫描电镜观察显示采用静电纺丝法制备的取向蚕丝蛋白纳米纤维支架呈交互编织的多孔网状结构,取向及非取向两种纳米材料生物相容性好,可促进骨髓间充质干细胞的稳定增殖,并沿纤维长轴分布排列。力学测试中取向蚕丝蛋白纳米纤维材料展示出较强的力学各向异性。结论取向蚕丝蛋白纳米纤维具有独特的生物学和力学性质,是一种在骨缺损修复方面具有潜力的组织支架材料。     

软骨细胞接种小孔径聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架的方法选择

目的 探讨软骨细胞接种小孔径聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架的最佳接种方法. 方法 实验分3组(n=9):注射组、负压组、振荡组,取纤维蛋白原溶液混悬第2代软骨细胞,采用上述3种方法对孔隙率为92％、孔径为50 ～ 100 μm的PLGA支架进行细胞接种.48 h后,Hoechst33258法检测支架内DNA含量;接种并观察支架内含异硫氰酸荧光素的无细胞纤维蛋白原凝胶的分布;硬组织切片、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察支架内细胞分布.7d后,扫描电镜观察支架表面及内部的细胞形态.各组部分支架(n=3)植入裸鼠皮下,以无细胞PLGA支架为空白对照组,术后8周取出支架行甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,并计算累积吸光度(IOD)值. 结果 注射组、负压组、振荡组平均DNA含量分别为(755.79±80.50)、(657.32±89.68)、(650.18±106.33)ng/mg,各组比较差异均无统计学意义(F=1.214,P=0.361).无细胞纤维蛋白凝胶在各组中都均匀分布,DAPI染色显示注射组细胞分布较其他两组均匀.扫描电镜显示负压组和振荡组外周细胞较注射组多,而支架孔隙内仅注射组可见细胞黏附.注射组甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色的IOD值均优于其他3组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 对于50 ～ 100 μm的小孑L径PLGA支架,注射法是一种快捷、高效的细胞接种方法.     

骨髓间充质干细胞与聚乳酸-羟基乙酸支架材料相容性研究

目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其分化的神经样细胞与聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架材料的相容性,并探讨两者复合修复周围神经损伤的效果.方法 (1)在体外,通过荧光显微镜、流式细胞仪、扫描电镜等技术观察BMSCs在PLGA上的生长及分化成神经样细胞的情况;(2)在体内,取右侧坐骨神经损伤的SD大鼠,随即分为4组,分别移植单纯PLGA、BMSCs-PLGA、神经样细胞-PLGA及直接缝合神经,术后斜板试验观察4组动物下肢功能情况;60d后处死大鼠,取神经标本做病理切片.结果 (1)在体外,BMSCs在PLGA上生长良好,与同期培养板里面的细胞比较,吸光度值(A)差异无统计学意义(P＞0.05);(2)在体内,BMSCs及其神经样细胞复合PLGA后能修复损伤的坐骨神经,促进大鼠下肢运动功能的恢复.术后3周,各组大鼠斜板试验的角度分别是:直接缝合组(38.32 ±5.51)度、单纯PLGA组(40.27 ±2.74)度、BMSCs-PLGA组(45.14±3.43)度、神经样细胞-PLGA组(60.56±4.70)度,且神经样细胞-PLGA组显著高于其他组(P＜0.01);病理切片显示支架与宿主神经组织有良好的生物相容性.结论 BMSCs能诱导分化生成神经样细胞,而PLGA与两者有良好的生物相容性.     

组织扩张术囊上皮肤来源、扩张率和回缩率研究

目的探讨恒压持续快速扩张的可行性。方法用白色小家猪１２只（１７．５±２．７１ｋｇ）、长方形硅胶扩张器（１８０ｍｌ）２４只作持续快速扩张术（ＣＴＥ）和常规间断扩张术（ＩＴＥ）对比研究。结果ＣＴＥ组６天完成扩张，ＩＴＥ组２７天完成扩张，两组扩张囊内平均实际液体量、扩张囊外皮肤总面积和皮肤回缩率相同（Ｐ＞０．０５）。ＣＴＥ组的皮肤净增面积和皮肤组织扩张率小于ＩＴＥ组（Ｐ＜０．０１）；ＣＴＥ组皮肤移行面积明显大于ＩＴＥ组（Ｐ＜０．０１）。结论恒压持续扩张术具有速度快的优势和某些与ＩＴＥ相似的性质，可用于局部皮肤病变或缺损的修复，但广泛性皮肤病的治疗仍应选择常规间断扩张术     

扩张后皮肤软组织收缩机理的实验研究

目的 研究扩张后皮肤软组织的收缩机理。方法 用白色小家猪制作皮肤扩张动物模型，扩张后采集组织标本，作组织收缩率测量和病理学观察。结果 真皮和纤维包膜是导致收缩率增加的主要部位。扩张后皮肤软组织中弹力纤维、肌成纤维细胞增生，肌上皮细胞和血管内皮细胞内平滑肌肌动蛋白明显增加。结论 弹力纤维、肌成纤维细胞、多种细胞内平滑肌肌动蛋白增加是引起组织收缩特性增强的主要原因。结果提示，扩张后皮瓣保持一定张力有利于对抗组织回缩。     

Current concepts and applications in the musculoskeletal and peripheral nervous systems

Biotechnology and tissue engineering have broad applications over several medical disciplines. The advances in the fields of biotechnology and tissue engineering offer new possibilities in the repair or regeneration of tissue lost to disease or injury. Consequently, a major portion of the research effort has focused on applications in orthopaedics with emphasis on the development of techniques for developing bone, articular cartilage, ligaments, tendons and nerve. Tissue engineering represents a multidisciplinary approach to solving some of the most demanding medical problems, particularly the creation of new tissues similar to those in the living organism. These new technical approaches include strategies in using new synthetic polymer formulations and various alternatives in tissue regeneration. This paper will examine the possible impact of biomolecular medicine in areas critical to the future of hand surgery, including tissue replacement, tissue regeneration, wound healing, and bone, tendon, cartilage, ligament and nerve repair.     

生物反应器在组织工程中的应用

目的 阐述生物反应器对组织工程学发展的重要性，并进一步探讨生物反应器研究的发展方向。方法 大量查阅国内外相关文献，分析近年来生物反应器在组织工程中应用所取得的最新成果，并在此基础上进行总结。结果 生物反应器极大地推动了组织工程学在理论和实践上的进步。成为组织工程中的四大关键环节之一。结论 生物反应器是组织工程中不可或缺的重要部分，其发展方向应是集成化、自动化和智能化，应用贯穿于整个组织工程过程的始终。     

组织器官工程实验研究进展

组织工程学是一个涉及细胞生物学、材料科学、反应器工程和临床医学的多学科交叉研究领域,其最终目的是在实验室内建造人体的组织和器官.组织工程学研究主要包括种子细胞筛选、生物支架材料研制以及利用生物反应器进行体外组织构建.近年来,虽然组织器官工程研究在组织工程化软骨、气管、膀胱、生物人工肝、生物人工肾、心脏瓣膜、内分泌器官等领域取得了进展与突破,但临床应用还将是一个漫长的过程.组织器官工程产品的开发与应用将极大促进医疗卫生事业乃至国民经济的发展.     

组织瓣移位修复肢体软组织缺损

目的：分析应用组织瓣移位修复肢体软组织缺损的效果。方法：对我院1990年1月－2000年10月采用组织瓣移位修复肢体软组织缺损84例，创面处理，手术方法及疗效进行评价。结果：临床应用84例，皮瓣全部成活，随访1－2年，功能及外形满意。结论：组织瓣移位是修复肢体软组织缺损的理想方法。     

多种组织移植修复组织缺损与功能重建

目的探讨游离组织移植在组织缺损修复与功能重建中的临床应用效果. 方法 2001年11月～2004年9月,应用14种78块组织瓣游离移植和(或)组合组织移植,修复四肢与颌面部组织缺损和功能重建69例.其中男53例,女16例,年龄18～56岁,平均31岁.部位:足踝部皮肤缺损5例,小腿皮肤缺损22例,手部、前臂皮肤缺损和手指再造36例,尺、桡骨缺损3例,面部肿瘤切除致软组织缺损2例,下颌骨及口底皮肤缺损1例.开放创面55例,其中感染创面16例,骨髓炎及化脓性关节炎6例;无菌创面14例.皮瓣切取范围2.0 cm×1.5 cm～43.0 cm×12.0 cm,骨移植长度10～15 cm.均为择期手术,其中延期组织移植8例. 结果术后发生动脉危象2例,静脉危象2例.移植组织全部成活76块,部分成活2块,行皮片移植后愈合.修复创面Ⅰ期愈合52例;Ⅱ期愈合13例,愈合时间20～30 d;化脓性感染4例,愈合时间3～11个月.指再造骨愈合时间6～8周,腓骨移植骨愈合时间4～6个月.修复后功能、外形均满意,各种组织移植供区无功能障碍. 结论组织移植与组合组织移植可使复杂创面修复一期完成,且效果好,虽风险较高,仍是修复足、小腿、面颈、手部组织缺损和功能重建的一种较理想方法.     

微型组织瓣在手外科修复中的应用

目的 回顾性研究应用微型组织和部组织缺损的治疗缺损的治疗效果。方法 临床应用１０种微型组织瓣移位或移植修复手部皮肤、骨、关节缺损１０２例。结果 随访１￣１８年,皮瓣全部存活、外形良好,手指屈伸功能尚可,痛、温、触觉恢复;骨愈合时间３￣４个月,关节功能满意。结论 应用显微外科技术修复手部皮肤缺损,疗程短、疗效好。凡手指、虎口外皮肝缺损合并骨、关节、肌妥外露者,应争取一期应用微型皮瓣修复;腕舟骨骨折不     

胆管癌新鲜组织标本库建立与鉴定

目的利用解放军总医院肝胆外科的医疗优势,摸索一套合理的操作方法,有计划地建立胆管癌新鲜组织标本库,为系统开展胆道肿瘤研究做好准备。方法选取2000年1月～2001年6月解放军总医院肝胆外科以胆道肿瘤为主要诊断而行手术切除的患者的手术标本21例,包括肿瘤组织、正常组织和(或)癌旁组织,将切取的组织块分割后装入编号的灭菌贮藏管,迅速放入液氮转移罐,深低温冰柜保存。全部组织标本均经常规病理组织学检查予以鉴定,并取其中部分组织使用Trizol试剂提取总RNA鉴定以判断组织成分的完整性。结果21例标本中肝内胆管癌4例,肝门胆管癌6例,肝外胆管癌7例,壶腹癌4例。由于肿瘤标本大小不同,所切取的组织块数目各异;因手术难度及人为因素的影响使得组织留取平均时间为(47.60±43.87)min。所取组织经Trizol试剂提取后,可见离心管底部沉淀的呈黄白薄片状的RNA,经紫外分光光度计分析得出其A260/A280=1.6～1.8,总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳后可见明显的28s和18s条带,而且28s条带的亮度大约是18s的2倍;2例超过2h的标本的A260/A280<1.6,且电泳显示28s和18s条带不清、消失及拖尾。结论人类遗传资源库的建设是开展疾病相关基因研究的重要的基础性工作,本实验建立的胆管癌组织标本留取操作流程可保证标本库质量。标本的留取必须在知情同意和保证留有足够的用于病理诊断的组织前提下,由有经验的相对固定的医护人员完成;标本离体时间应掌握在1h之内,应常规将标本分割多管保存。     

Tissue factor and tissue factor pathway inhibitor

The classical 'cascade/waterfall' hypothesis formulated to explain in vitro coagulation organised the amplification processes into the intrinsic and extrinsic pathways. Recent molecular biology and clinical data indicate that tissue factor/factor-VII interaction is the primary cellular initiator of coagulation in vivo. The process of blood coagulation is divided into an initiation phase followed by a propagation phase. The discovery of tissue factor pathway inhibitor further supports the revised theory of coagulation. Tissue factor is also a signalling receptor. Recent evidence has shown that blood-borne tissue factor has an important procoagulant function in sepsis, atherosclerosis and cancer, and other functions beyond haemostasis such as immune function and metastases.