HEK293细胞上表达的人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2和亚型4的电生理

目的将人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2（hHCN2）和亚型4（hHCN4）的基因表达于HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点。方法包含目的基因hHCN2或hHCN4的cNDA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,穿梭载体和病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌重组,病毒经过包装和扩增后分别转染HEK293细胞。利用全细胞膜片钳技术,记录分别转染了hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上的超极化激活钾电流（If）。结果转染hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上产生超极化激活的内向电流。两种通道的半数最大激活电压分别为-114．8mV±3．3mV和-125．9mV±2．9mV,反向曲线斜率分别为11．1mV±1．2mV和13．7mV±1．3mV。两者的激活动力学明显不同,刺激电压为一110mV时,通道的激活时间常数分别为0．99s±0．21s和8．47s±2．85s。两种通道对钠离子和钾离子的相对通透性分别为0．40和0．34。两种电流均可被2mmol／L的氯化铯（CsCI）阻断。结论目的基因hHCN2和hHCN4在HEK293细胞上成功表达,形成的两种通道具有明显不同的激活动力学。     

大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征

目的 研究大鼠心室肌细胞超极化环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)基因瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293)表达和通道电流特征.方法 利用脂质体介导大鼠HCN4基因pTracer-CMV-GFP穿梭载体,转染HEK293细胞进行扩增,用逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)检测HCN4 mRNA表达,采用全细胞膜片钳技术记录HEK293细胞上HCN4电流.结果 大鼠起搏通道基因瞬时转染HEK293细胞,记录到一系列超极化内向离子流,该电流呈电压、时间依赖性,没有明显的失活,在-150 mV时电流幅值为(540±24.1)pA,电流密度为(9.6±0.7)pA/pF(n＝12),半激活电压(V1/2)为(-105.7±12.0)mV,稳态激活曲线斜率(k)为-15.7mV,HCN4电流翻转电位为(-84.0±7.9)mV.结论 应用脂质体转染方法成功进行了起搏通道HCN4基因的异源性表达.     

急性缺氧对豚鼠肠系膜动脉平滑肌细胞电生理特性的影响

目的 观察急性缺氧对豚鼠肠系膜动脉平滑肌细胞电生理特性的影响.方法 直径＜100 μm的豚鼠肠系膜动脉进一步去除结缔组织后,应用全细胞膜片钳技术观察急性缺氧对微动脉段上平滑肌细胞膜电流、膜电位、膜电容、膜电导或膜电阻的影响.结果当钳制电压为-40 mV时,急性缺氧引起一个反应幅度(76 ±23)pA的外向电流,细胞静息膜电位从(-22.5±1.2)mV超级化到(-42.0 ±2.8)mV(P ＜0.01).急性缺氧可以电压依赖地增强细胞外向电流,且主要增强0～+40 mV电压区间的电流,激活电流幅度0 mV时从(140±18)pA增加到(660±124)pA(P ＜0.01),+20 mV时从(282±23)pA增加到(1120±186)pA(P ＜0.01),+40 mV时从(423±40)pA增加到(1800±275)pA(P ＜0.01).背景灌流1 mmol/L大电导Ca2+激活K+通道(BKca)阻断剂四乙胺后,这一增强作用显著减弱.急性缺氧使细胞膜电阻从(446 ±55)MΩ增加到(2187±290)MΩ(P＜0.01),膜电容从(184.3±75.0)pF减少至(17.6±2.2)pF(P＜0.01).联合应用30 μmoL/L缝隙连接阻断剂18β-甘草次酸和10 mmol/L四乙胺后,急性缺氧对细胞膜电流的影响基本消失.结论 急性缺氧通过激活肠系膜动脉平滑肌细胞膜上BKca通道,引起K+外流,细胞超极化,血管舒张,保证肠系膜微循环的血液供应.同时通过抑制细胞间缝隙连接使其产生的伤害信息局限化.     

槲寄生黄酮苷对大鼠心室肌细胞钾离子通道的作用

目的观察槲寄生黄酮苷对大鼠心室肌细胞钾离子通道的作用,探讨槲寄生黄酮苷抗心律失常作用机制。方法应用全细胞膜片钳技术记录槲寄生黄酮苷对大鼠单个心室肌细胞内向整流钾电流(IK1)、瞬时外向钾电流(Ito)的影响。结果应用50μg/ml和250μg/ml两种浓度的槲寄生黄酮苷分别使大鼠单个心室肌细胞内向整流钾电流(IK1)在实验电压-120mV时从给药前(-26.23±9.52)pA/pF减少到(-20.82±7.88)pA/pF,(-18.11±7.89)pA/pF(n=7,P<0.05);使大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)在实验电压+50mV时,从给药前(26.14±6.67)pA/pF减少到(16.41±6.23)pA/pF,(13.25±3.78)pA/pF(n=4,P<0.05)。结论槲寄生黄酮苷抑制大鼠心室肌细胞IK1,Ito可能是其抗心律失常作用的一个机制。     

人心房肌Kv1.5钾通道稳定表达细胞系的建立

目的:建立稳定表达人心房肌细胞Kv1.5钾通道的细胞系. 方法:将编码人心房Kv1.5钾通道的hKv1.5基因转染HEK 293细胞,用1 g/L G418筛选2 wk后采用膜片钳方法筛选具有抗G418抗性的细胞克隆,电流记录模式为全细胞记录. 结果:hKv1.5通道基因被成功转入HEK 293细胞并稳定表达;稳定表达的hKv1.5电流是具有明显电压依赖性和超快激活特点的外向电流,其电流大小为(3.20±0.60)nA,其激活电压在-30 mV左右. 结论:成功构建稳定表达人心房Kv1.5钾通道蛋白的HEK 293细胞系,其电流特性与人心房肌IKur相似,可以作为体外研究人心房IKur的细胞模型.     

异丙酚对人肠系膜小动脉平滑肌细胞膜外向钾通道电流的影响

目的 :研究异丙酚对人肠系膜小动脉平滑肌细胞膜外向钾通道电流的影响。方法 :用酶消化法获得急性分离的人肠系膜小动脉平滑肌细胞 ,采用全细胞膜片钳技术记录外向钾通道电流。结果 :在刺激电压 (Vt)- 70mV～ +70mV条件下 ,引发一外向钾电流 ,该电流可被 3mmol/LTEA阻滞 6 1%± 5 % ,异丙酚 (4 3μmol/L、86 μmol/L)分别增加外向钾通道电流幅值达 (13± 3) %和 (36± 7) %。 结论 :异丙酚增强人肠系膜小动脉平滑肌细胞外向钾通道电流 ,提示钾通道开放增加可能介导异丙酚引发的血管扩张。     

新生大鼠海马神经元原代培养及钾离子通道特性研究

目的建立大鼠海马神经元原代培养方法,记录钾电流并观察其特性。方法无血清培养法进行海马神经元原代培养,从形态学和电生理学方面鉴定细胞活性;全细胞膜片钳技术记录钾电流,从药理学和动力学观察钾通道特性。结果经5～7d培养,获得胞膜完整、胞质均匀的海马神经元,并记录到典型的全细胞电压依赖性钾电流(IK)、延迟整流钾电流(IKDR),IK和IKDR均为外向电流,激活电压分别为-50mV和-40mV,随着去极化程度增加而增加,能被已知的钾通道的阻断剂4-AP和TEA-Cl阻断,IK和IKDR的半数最大激活膜电位(V1/2)分别为(22.1676±2.1778)mV(n=6)和(17.8457±1.7767)mV(n=6),斜率因子(κ)分别为(-6.1541±3.0541)mV(n=6)和(-6.5193±2.1894)mV(n=6)。结论在该实验条件下培养的海马神经元形态和生理特性良好,较好的表达了电压依赖性钾离子通道特性,适合电生理研究。     

参松养心胶囊对心室肌细胞钾通道的影响

目的观察参松养心胶囊干粉提取溶液对大鼠单个心室肌细胞内向整流钾电流(IK1)、瞬时外向钾电流(Ito)以及豚鼠心肌细胞延迟整流钾电流(Ik)的影响。方法用酶解法分离单个心室肌细胞,并用全细胞膜片钳记录技术。结果当药物浓度0.5%时,可以使大鼠心肌细胞IK1内向成分降低,使-100mV时IK1电流密度从(-10.8±1.8)pA/pF降至(-7.2±2.1)pA/pF,平均抑制率为(33.1±16.9)%(n=11,P<0.05),但不改变电流的翻转电位及整流特性。药物同时对Ito电流的瞬时成分有抑制作用,60mV时Ito电流密度从(-19.8±7.1)pA/pF降至(-10.0±3.9)pA/pF,平均抑制率为(50.6±10.8)%(n=6,P<0.05),稳态失活曲线左移,失活后恢复时间常数增大。药物浓度0.5%时,对Ik有电压依赖性抑制作用,50mV时对尾电流峰值的抑制率为(30.8±1.1)%(n=5,P<0.05)。结论参松养心胶囊干粉提取溶液对IK1,Ito和Ik均具有不同程度的阻滞作用。这种多离子通道阻滞作用不仅使参松养心胶囊具有广谱的抗心律失常疗效,减少致心律失常的副作用,对Ito的阻滞效应还将显示其独特的抑制2相折返的作用,值得对其作更深入和广泛的研究。     

同型半胱氨酸对自发性高血压大鼠脑动脉平滑肌细胞BKca的增强作用

目的 探讨同型半胱氨酸(Hcy)对自发性高血压大鼠(SHR)和Wistar大鼠脑动脉平滑肌细胞电生理特性的影响.方法 应用全细胞膜片钳记录技术观察1 mmol/L Hcy对SHR和Wistar大鼠脑动脉平滑肌细胞膜电流的作用.结果 ①SHR脑动脉平滑肌细胞外向电流幅度远大于Wistar大鼠.②1 mmol/L Hcy电压依赖性的增强SHR与Wistar大鼠脑动脉平滑肌细胞的外向电流.Hcy主要增强SHR和Wistar大鼠脑动脉平滑肌细胞0～+60 mV区间的电流幅度.Hcy增强SHR脑动脉平滑肌细胞膜电流的幅度大于Wistar大鼠,两者间有统计学差别.③1 mmol/L TEA可以有效抑制Hcy对脑动脉平滑肌细胞外向电流的增强作用,而1 mmol/L4-AP对其没有明显影响.结论 1 mmol/L Hcy能够电压依赖的增强SHR及Wistar大鼠脑动脉平滑肌细胞BK.通道电流,且SHR比Wistar大鼠增强幅度明显.     

蛋白激酶C对慢性吸烟大鼠支气管平滑肌细胞膜电压门控钾通道的作用

目的 探讨蛋白激酶C对慢性吸烟大鼠支气管平滑肌细胞（bronchial smooth muscle cells, BMSCs）膜电压门控钾通道（Kv通道）的作用,为慢性阻塞性肺疾病的防治提供理论依据。方法 建立大鼠的慢性吸烟模型。大鼠随机分为吸烟组（A组）和对照组（B组）。采用急性酶分离法获得单个大鼠的支气管平滑肌细胞。用全细胞膜片钳技术测定其膜电位和Kv通道电流。比较用蛋白激酶C激动剂12-佛波醇脂（PMA）和抑制剂GFX前后两组细胞Kv通道电流的不同变化。结果 慢性吸烟大鼠BSMC的静息膜电位和Kv通道电流明显低于对照组。PKC可抑制正常大鼠BSMC+50 mV刺激时的峰值Kv通道电流（从78.3±10.5 pA/pF 下降到50.4±8.6 pA/pF, n=10 cells, P<0.05）。该抑制作用可被GFX抵消（77.9±7.8 pA/pF vs 70.4±9.6 pA/pF, n=10 cells, P>0.05）。但是PKC对慢性吸烟大鼠的BSMC的Kv通道电流无抑制作用（58.3±7.6 pA/pF vs 56.4±6.3 pA/pF, n=10 cells, P>0.05）。结论 慢性吸烟可抑制大鼠BMSC膜电压门控钾通道（Kv通道）的电流。PKC活化后对正常大鼠的BSMC有抑制作用,但对慢性吸烟大鼠的BSMC则无抑制作用。 【关键词】吸烟 支气管 钾通道     

体外培养视网膜神经元电压门控钾离子通道特性的研究

目的探讨体外培养不同时期新生小牛视网膜神经元电压门控钾离子通道的特性。方法分别取培养2、4、6周的视网膜神经元,进行全细胞膜片钳记录,并进行统计学分析。结果去极化刺激可诱导3组细胞产生IK电流,各组检出率差异无统计学意义(P>0.05);随培养时间延长,IK电流平均峰值增高(P<0.05)。超极化刺激可诱导培养6周的部分细胞产生内向整流钾电流。结论体外培养新生小牛视网膜神经元表达不同电压门控钾电流。某些神经元的电生理学特性在不同培养阶段发生变化。     

High extracellular potassium ion concentration attenuates the blockade action of ketanserin on Kv1.3 channels expressed in xenopus oocytes

Background Ketanserin （KT）, a selective serotonin （5-HT） 2-receptor antagonist, reduces peripheral blood pressure by blocking the activation of peripheral 5-HT receptors. In this study electrophysiological method was used to investigate the effect of KT and potassium ion on Kv1.3 potassium channels and explore the role of blocker KT in the alteration of channel kinetics contributing to the potassium ion imbalances. Methods Kv1.3 channels were expressed in xenopus oocytes, and currents were measured using the two-microelectrode voltage-clamp technique. Results KCI made a left shift of activation and an inactivation curve of Kv1.3 current and accelerated the activation and inactivation time constant. High extracellular [K^＋] attenuated the blockade effect of KT on Kv1.3 channels. In the presence of KT and KCI the activation and inactivation time constants were not influenced significantly no matter what was administered first. KT did not significantly inhibit Kv1.3 current induced by tetraethylammonium （TEA）. Conclusions KT is a weak blocker of Kv1.3 channels at different concentrations of extracellular potassium and binds to the intracellular side of the channel pore. The inhibitor KT of ion channels is not fully effective in clinical use because of high [K^＋]. and other electrolyte disorders.     

缺血再灌注小鼠心肌细胞Na~+/Ca~(2+)交换电流的改变

目的观察缺血再灌注损伤对小鼠心肌细胞Na+/Ca2+交换蛋白电流的直接影响,探讨缺血再灌注损伤中Ca2+超载的机制。方法采用全细胞打孔膜片钳技术,观察缺血再灌注损伤对急性分离的小鼠心室肌细胞Na+/Ca2+交换蛋白电流(INa/Ca)的影响。细胞外灌流代谢抑制剂(5 mmol/L氰化钠和10 mmol/L脱氧葡萄糖)模拟化学性心肌细胞缺血状态。结果缺血8m in明显抑制了小鼠心室肌细胞钠钙交换蛋白内向和外向电流〔在-100 mV,电流从(-0.04±0.01)nA减小到0 nA;在+50mV,电流从(0.25±0.08)nA减小到(0.11±0.03)nA〕。而随后的再灌注则导致钠钙交换蛋白电流迅速而明显的增大,尤以外向电流增大更加显著〔在+50 mV,电流从(0.25±0.08)nA增大到(0.49±0.12)nA〕。结论缺血再灌注直接影响小鼠心室肌细胞Na+/Ca2+交换蛋白的功能及状态,使Na+/Ca2+交换蛋白的反向转运功能明显增强,这种改变可能是导致缺血再灌注损伤中Ca2+超载的关键因素。     

多巴胺引起大鼠结肠黏膜离子转运的节段异质性

目的探究多巴胺(DA)引起的大鼠远端结肠黏膜离子转运在不同节段的异质性及其可能的原因。方法用短路电流技术(ISC)探测DA引起的大鼠远端结肠黏膜离子转运在不同节段的差异及其介导受体;用realtime-PCR方法检测介导DA反应的受体在大鼠结肠黏膜不同节段的表达是否具有差异性。结果DA在结肠近肛门端(结直肠交界处,DC1)引起的短路电流(ΔISC)为(-14.32±3.14)μA/cm2,明显高于远端结肠的其他部位(-3.19±1.44)μA/cm2(P<0.01)。多巴胺D1样、D2样受体拮抗剂及α受体拮抗剂phentolamine均不能抑制该反应。但β1和β2肾上腺素能受体拮抗剂atenolol和ICI118、551却明显抑制多巴胺产生的反应,抑制程度分别为63.79%(P<0.05),87.27%(P<0.01)。realtime-PCR结果显示,在远端结肠黏膜上,介导该反应的β1和β2受体的mRNA在远离肛门处的远端结肠(DC4)的表达为DC1表达量的48.6%(P<0.001)和56.5%(P<0.05)。结论DA在大鼠远端结肠引起的黏膜离子转运具有异质性,即在DC1的反应明显高于远端结肠的其他部位,这可能与为介导该反应的β1和β2肾上腺素能受体在DC1的高表达有关。     

大鼠消化道平滑肌细胞KATP通道的牵张敏感性

目的探讨大鼠结肠平滑肌细胞上是否存在ATP敏感K+通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)及其牵张敏感性。方法用RT-PCR方法检测SD大鼠结肠平滑肌组织KATPmRNA的表达;联合应用单通道膜片钳技术和压力钳技术,采用inside-out模式记录大鼠结肠平滑肌细胞上KATP通道的电活动。结果在大鼠结肠平滑肌组织中可检测出较高水平的KATPmRNA的表达;用inside-out模式在大鼠结肠平滑肌上可记录到KATP通道的电活动,该通道在膜电位钳制电压为+60 mV时电导值为(44.5±1.5)pS。KATP通道特异性阻断剂——glibenclamide能抑制该通道的活动。且该KATP通道在负压刺激下开放概率增加。结论大鼠结肠平滑肌细胞上分布有KATP通道,该KATP通道对牵张刺激敏感。     

HIV-1 Nef重组重叠肽诱导小鼠免疫保护作用研究

目的探讨HIV-1 Nef重组重叠肽诱导小鼠细胞免疫应答的效果。方法以HIV-1 LAI Nef重组重叠肽和相应蛋白免疫接种BALB/c和C57BL/10小鼠,每组5例,分离小鼠脾单个核细胞(spleen mononuclear cell,SMC),以ELISPOT和流式细胞术检测特异性细胞应答,以大剂量Nef重组痘苗病毒攻击试验检测重组重叠肽对免疫小鼠的保护作用。结果在C57BL/10小鼠中,佐剂组ELISPOT为阴性,重叠肽组和相应蛋白组LAI Nef特异性细胞免疫应答分别为(145.7±36.2)SFU/106SMC和(24.2±10.2)SFU/106SMC(P=0.001),在BALB/c小鼠中分别为(148.8±50.4)SFU/106SMC和(19.8±9.0)SFU/106SMC(P=0.004),而NL4-3 Nef特异性细胞免疫应答分别为(104.0±33.8)SFU/106SMC和(20.7±9.5)SFU/106SMC。重组重叠肽疫苗诱导的Nef特异性CD4+和CD8+细胞的百分比分别为1.53和0.80。在攻毒试验中,重叠肽组、蛋白组、佐剂组和空白对照组的生存率分别为80%、40%、20%和0%。结论重组重叠肽免疫小鼠可产生具有保护作用的较强的广谱特异性细胞免疫应答,对于不同株系的Nef具有交叉反应,重组重叠肽的免疫接种效果强于相应蛋白。     

单侧前组鼻窦病变对鼻腔通气功能的影响

目的探讨单侧前组鼻窦病变对鼻腔通气功能的影响。方法用Acoustic Rhinometer A1鼻声反射仪和Rhinomanometer NR6-2鼻阻力计测量25例单侧鼻窦病变患者的健侧和患侧鼻腔通气功能,将二者进行对比研究。结果鼻腔0～7 cm,2～5 cm和5～7 cm的鼻腔容积(V0-7,V2-5和V5-7),距离前鼻孔2 cm、4 cm、6 cm处的鼻腔截面积(A2、A4、A6),鼻腔两处最小截面积(MCA1、MCA2)及距前鼻孔的距离(D1、D2),健侧与患侧相比较,两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。压差为75 Pa、150 Pa、300 Pa的健侧和患侧的鼻腔气体流量和平均阻力,健侧与患侧相比较,两者之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论前组鼻窦窦口阻塞和鼻窦炎性反应对鼻声反射和鼻阻力的测量结果无明显影响。     

急性多发性神经根神经炎外周血T淋巴细胞亚群的研究

用抗人T细胞单克隆抗体OKT_3、OKT_4,OKT_8检测急性多发性神经根神经炎(AP)患者T淋巴细胞细胞亚群。共检测AP患者23例,正常对照20例,并观察不同病情、病型患者的T细胞亚群的改变。结果表明AP患者OKT_a~+、KT_4~+细胞百分率与正常对照组相同,但OKT_8~+细胞百分率明显低于对照组(P<0.05),OKT_4~+/OKT_a~+细胞比率相应升高(P相似文献   

小肠黏膜下层作为组织工程支架材料的免疫原性研究

目的检测小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)的免疫原性,探讨其作为组织工程支架材料的可行性。方法取SIS材料制备成体积为10mm×4mm×3mm的组织块,埋植于新西兰大白兔背部一侧骶脊肌内,以术前情况作自身对照,以新鲜SIS组作为阳性对照。分别于SIS材料植入前及植入后1、4、8周从兔耳缘静脉取血,用流式细胞仪检测家兔外周血中CD4+T和CD8+T细胞亚群的动态变化。结果流式细胞仪检测结果显示,脱抗原处理后的SIS植入兔体内后,其外周血CD4+T和CD8+T细胞较术前均有不同程度升高,术后一周达最高峰,与术前相比差异有统计学意义(P<0.05)。术后逐渐回落,至第4周时基本恢复正常。而植入新鲜SIS组的兔外周血CD4+T和CD8+T细胞较术前升高明显,与术前及实验组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论SIS植入后T细胞亚群反应初始结果显示SIS有较低的免疫原性,提示其具有作为组织工程支架材料的可行性和可能性。     

K<Superscript>+</Superscript> channels and their effects on membrane potential in rat bronchial smooth muscle cells

Summary In order to investigate the K⁺ channels and their effects on resting membrane potential (Em) and excitability in rat bronchial smooth muscle cells (BSMCs), the components of outward K⁺ channel currents and the effects of K⁺ channels on Em and tension in rat bronchial smooth muscle were observed by using standard whole-cell recording of patch clamp and isometric tension recording techniques. The results showed that under resting conditions, total outward K⁺ channel currents in freshly isolated BSMCs were unaffected by ATP-sensitive K⁺ channel blocker. There were two types of K⁺ currents: voltage-dependent delayed rectifier K⁺ channel (K_v) and large conductance calcium-activated K⁺ channel (BK_Ca) currents. 1 mmol/L 4-aminopyridine (4-AP, an, inhibitor of K_V) caused a significant depolarization (from −8.7±5.9 mV to −25.4±3.1 mV,n=18,P<0.001). In contrast, 1 mmol/L tetraethylammonium (TEA, an inhibitor of BK_Ca) had no significant effect on Em (from −37.6±4.8 mV to −36.8±4.1 mV,n=12,P>0.05). 4-AP caused a concentration-dependent contraction in resting bronchial strips. TEA had no effect on resting tension, but application of 5 mmol/L TEA resulted in a left shift with bigger pD₂ (the negative logarithm of the drug concentration causing 50% of maximal effect) (from 6.27±0.38 to 6.89±0.54,n=10,P<0.05) in the concentration-effect curve of endothine-1, and a right shift with smaller pD₂ (from 8.10±0.23 to 7.69±0.08,n=10,P<0.05) in the concentration-effect curve of isoprenaline. It was suggested that in rat BSMCs there may be two types of K⁺ channels, K_v and BK_Ca, which serve distinct roles. K_v participates in the control of resting Em and tension. BK_Ca is involved in the regulation of relaxation or contraction associated with excitation. LIU Xiansheng, male, born in 1969, M. D., Ph. D. This project was supported by a grant from the National Natural Sciences Foundation of China (No. 30270583).