实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑神经干细胞的增殖

目的通过建立实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型,检测EAE神经干细胞的增殖。方法以豚鼠脑脊髓匀浆加完全弗氏佐剂作为抗原．给予Wistar大鼠四足垫皮内注射,建立EAE模型,对正常组、免疫后7d组、EAE发病后3,7,14,21d组,分别进行5一溴脱氧尿嘧啶（BrdU）免疫组织化学染色,以观察正常大鼠脑内Brdu、EAE免疫损伤后BrdU的变化规律。结果在正常组大鼠,Brdu阳性细胞主要分布在室管膜下区（SVz）及海马齿状回的颗粒层（SGZ）;Brdu阳性细胞教在免疫后呈现先上升后下降的变化趋势,于发病后3d达高峰,21d恢复正常。结论EAE可以诱导大鼠脑内神经干细胞的增殖。     

人脐血干细胞移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究

目的研究人脐血干细胞(HUCBCs)移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的效果以及HUCBCs在EAE大鼠脑和脊髓的状况。方法从新生儿脐带血分离出单个核细胞,体外培养并予5-溴脱氧嘧啶尿苷(Brdu)标记48h。用豚鼠全脊髓匀浆免疫Wistar大鼠制备EAE模型。在免疫后14d将3×106HUCBCs经尾静脉注射移植入EAE大鼠(移植组)体内,观察大鼠移植后不同时间的神经功能缺损评分、脑和脊髓脱髓鞘病灶数的变化;用免疫组化技术观察移植后的HUCBCs在EAE大鼠脑和脊髓内存活、迁徙、分化的状况,并与对照组比较。结果移植组大鼠移植后21d、28d的神经功能缺损评分显著低于对照组(均P<0.05);移植后7d、14d、21d、28d脑和脊髓中均可见Brdu染色阳性细胞,移植后21d、28d明显多于移植后7d、14d(均P<0.05);植入的HUCBCs在大鼠脑和脊髓内能向损伤区域迁徙并能分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。移植后14d、21d、28d脑和脊髓内脱髓鞘病灶数明显少于对照组(均P<0.05)。结论HUCBCs移植能显著改善EAE大鼠的神经功能,并能在其脑和脊髓内存活、迁徙和分化,减少脱髓鞘...     

苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠血清干扰素-γ及肿瘤坏死因子-α表达的影响

背景：大量文献证实实验性自身免疫性脑脊髓炎的发生发展与干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的表达增高有关。 目的：验证不同剂量的苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠血清中干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α表达的影响。设计、时间及地点：对比观察实验,于2008-07/12在河南省中医药研究院和郑州大学第一附属医院完成。材料：清洁级Wistar大鼠40只,鼠龄6~8周,体质量180~220 g,建立实验性自身免疫性脑脊髓炎模型;苦参素注射液为正大天晴药业股份有限公司产品。方法：40只大鼠随机分成4组,每组大鼠均10只。应用豚鼠全脊髓匀浆和完全弗氏佐剂制成的抗原乳剂免疫Wistar大鼠建立实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型。模型组以6.7 mL/（kg•d）生理盐水16d腹腔注射,低剂量苦参素组以终浓度100mg/（kg•d）16d腹腔注射,高剂量苦参素组以终浓度150mg/（kg•d）16d腹腔注射,正常对照组干预方式同模型组。主要观察指标：造模后第16天应用苏木精-伊红染色观察实验大鼠脊髓组织病理学改变;酶联免疫吸附法检测实验大鼠血清中干扰素-γ的表达,放射免疫分析法检测实验大鼠血清中肿瘤坏死因子-α的表达;自造模当日起每日进行临床体征评分。结果：与模型组相比较,低剂量苦参素组和高剂量苦参素组大鼠临床体征评分降低（P<0.01）,脊髓内的炎性细胞浸润程度有所减轻,大鼠血清干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的表达水平均降低(P<0.01)。结论：苦参素能有效抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎与其下调干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的表达有关。     

黄芩苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠髓鞘的保护作用

目的观察黄芩苷(BAC)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠髓鞘的保护作用。方法将大鼠随机分为正常对照(NC)组、EAE组、地塞米松(DXM)组和BAC组。抗原免疫1周后分别予以DXM组和BAC组大鼠DXM和BAC治疗7d;观察免疫后14d各组动物发病情况、脊髓病理变化及髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。结果(1)EAE组、DXM组和BAC组大鼠于抗原免疫后8～10d发病,发病潜伏期分别为9.62d、11.0d、9.85d,DXM组较EAE组潜伏期显著延长(P<0.05),BAC组与EAE组间差异无统计学意义;各组发病率分别为75.0%、66.7%、80%,各组间差异无统计学意义。(2)病程中EAE组和DXM组质量较BAC组明显下降(均P<0.05);DXM组和BAC组神经功能评分明显优于EAE组(均P<0.05)。(3)与EAE组比较,DXM组脊髓病灶数明显减少(P<0.05),BAC组病灶数有所减少,但差异无统计学意义。(4)与EAE组比较,DXM组和BAC组脊髓MBP阳性数显著增多(均P<0.05)。结论BAC对缓解EAE大鼠的临床症状、减轻髓鞘脱失的作用与DXM相似,而没有质量降低的不良反应。     

骨髓间充质干细胞干预治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)干预治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠的效果及其机制,以及最佳的治疗时机。方法 36只健康雌性SD大鼠随机分为正常对照组、EAE模型组和免疫后当天、第5 d、第10 d、第15 d注入BMSCs干预治疗组(d0、d5、d10、d15 BMSCs组)。用MBP68-86作免疫原制作EAE大鼠模型,分别在免疫后相应时间点静脉注入Wistar大鼠的BMSCs或生理盐水。观察大鼠的发病状况、神经功能缺损评分(NDS)和脑、脊髓组织病理改变。用流式细胞仪检测周围血T细胞亚群,ELISA法检测血干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、白介素(IL)-4和IL-10水平。结果正常对照组大鼠均正常。与EAE模型组比较,d0 BMSCs组和d5 BMSCs组大鼠的发病数减少,发病时间延迟,高峰期和平均NDS降低,外周血CD4+T细胞明显降低,Treg细胞明显升高,IFN-γ和TNF-α水平明显降低,IL-10水平明显升高(P0.05~0.01),脑、脊髓组织的病变明显减轻;d10 BMSCs组CD4+/CD8+比值明显降低(P0.05)。结论预先用BMSCs干预治疗EAE大鼠有显著的效果,其机制可能为BMSCs通过上调IL-10表达来调节T细胞的增殖活化及功能,抑制异常免疫反应。而在发病后给予BMSCs则无明显效果。     

雄激素在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的保护作用

多发性硬化(multiple sclerosis, MS)及其动物模型即实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)都具有性别差异,但其确切机制仍不清楚.近年来,大量研究发现雄激素与EAE的发病和病程有一定关系.此文就EAE存在的性别差异及雄激素在其中的作用做一综述.     

实验性自身免疫性脑脊髓炎的视神经病理改变

目的 研究实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的视神经病理改变.方法 足垫皮下注射豚鼠脊髓匀浆和完全弗氏佐剂(CFA)混合物制作Wismr大鼠EAE模型,于发病后第6d将大鼠处死,取视神经、脑和脊髓,行HE和LFB染色,光镜和电镜下观察其病理改变.结果 病理检查发现EAE模型组大鼠脑、脊髓有不同程度的炎症反应和脱髓鞘改变;均有视神经病变,光镜主要表现为炎症反应和脱髓鞘,视神经髓鞘脱失重于炎症反应;电镜主要表现为髓鞘稀疏,少突胶质细胞数量减少、胞核固缩,其周围包裹的髓鞘板层松解,轴突髓鞘分离.结论 EAE大鼠存在明显的视神经病变,主要为视神经炎症反应和脱髓鞘改变.     

实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠模型脑组织硫化氢的变化

目的 观察实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型大鼠脑组织中硫化氢(H2S)动态变化,探讨H2S与多发性硬化(MS)的关系. 方法 按随机区组设计方法将SD大鼠分成对照组及模型组,每组78只.模型组制备EAE模型,对照组用生理盐水代替诱导乳剂,余措施相同.采用HE染色、尼氏染色观察2组大鼠脑组织病理变化;比较不同时间点(建模后5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d和65 d)2组大鼠平均临床评分;采用比色法检测各时间点H2S和丙二醛(MDA)水平. 结果 (1)HE和尼氏染色显示模型组中可见明显的炎性细胞浸润现象及血管袖套形成,对照组未发现明显改变.(2)模型组于建模后第20天及第50天出现2次发病高峰,临床评分分别为(4.0±0.55)分和(3.5±0.25)分;对照组的评分为0分.(3)模型组大鼠各时间点脑组织中H2S表达量随着发病呈逐渐下降趋势,从第10天开始低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).相反,模型组大鼠各时间点脑组织中MDA呈逐渐增加趋势,从第10天开始高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).对照组大鼠H2S和MDA水平无明显变化.(4)模型组大鼠脑组织中H2S水平的变化与临床评分、MDA水平呈负相关(r=0.960,P=0.000;r=-0.920,P=0.000);临床症状评分和MDA水平呈正相关(r=0.910,P=0.000). 结论 H2S在EAE模型中表达明显降低,在MS中的作用机制有待进一步研究.     

实验性自身免疫性脑脊髓炎的历史和现状

<正> 多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种中枢神经系统(central nervous system,CNS)炎性脱髓鞘性自身免疫性疾病,其确切的发病机制仍不清楚,研究MS的实验动物模型成为探索该病病因学的最佳途径和方法。MS的实验动物模型主要分为免疫介导模型和病毒诱导模型两种,其中以免疫介导模型多用,该模型主要是通过注射CNS髓鞘蛋白(或分子肽段)与抗原佐剂的乳化复合物诱导动物对抗原反     

一氧化氮供体对实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用

目的探讨一氧化氮供体3-吗啉-斯德酮亚胺(3-morpholinosydnonimine,SIN-1)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠的作用。方法应用豚鼠髓鞘碱性蛋白68-86(myelin basic protein 68-86,MBP68-86)主动免疫制作EAE实验动物模型。将大鼠随机分为SIN-1组和对照组,SIN-1组大鼠于致敏后第0~7天给予SIN-1药物干预,动态观察两组大鼠的临床症状及体质量变化,致敏后第14天采用ELISA方法检测各组大鼠单个核细胞(mononuclear cells,MNC)培养上清中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)水平,并观察大鼠脑组织病理变化。结果与对照组比较,SIN-1组大鼠发病时间延迟,恢复时间提前,体质量明显增加,临床症状明显减轻;疾病症状最高评分明显降低。SIN-1组大鼠MNC培养上清中IFN-γ水平为(90.29±9.07)pg/mL,较对照组的(121.57±10.44)pg/mL明显降低(P<0.05);IL-4水平为(18.14±3.98)pg/mL,较对照组的(8.14±1.95)pg/mL明显增加(P<0.05)。SIN-1组大鼠组织病理损伤较对照组明显减轻。结论一氧化氮供体SIN-1可抑制EAE大鼠病情发展,对EAE具有保护作用。     

体外三步法诱导胚胎干细胞定向生成神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的方法。方法 模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境，以脑星形胶质细胞为支持细胞，用全反式维甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)等分三阶段诱导ESCs定向生成NSCs。形态学观察及畸胎瘤形成试验对ESCs的全能性进行鉴定；形态学观察结合免疫组织化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志OCT-4和神经干细胞标志Nestin蛋白和(或)基因表达对诱导全过程进行动态监测；NSCs分化试验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测。结果(1)体外培养的小鼠ESC-D3细胞在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养，仍保持向三胚层分化的能力；(2)随着诱导的进行，OCT-4表达逐渐减弱并消失，而Nestin表达逐渐增强，经三步法最终可诱导形成纯度高达90％以上的Nestin阳性细胞；(3)所诱导生成的细胞在NSCs选择性培养基中反复传代，仍表现为Nestin阳性和具有生成神经球的能力，在含血清培养基中可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞。结论采用星形胶质细胞作为诱导基质，模拟体内神经分化过程的三步诱导法，可诱导ESCs生成较高纯度的NSCs，并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力。     

人脑脊液对鼠神经干细胞增殖分化的影响

目的:研究脑外伤血性脑脊液和脑积水清亮脑脊液对神经干细胞增殖分化的影响.方法:从大鼠脑组织中分离堵养神经干细胞,分别用人的两种脑脊液培养,分为试验组(血性脑脊液组)和对照组(脑积水清亮脑脊液组),于不同时问观察神经干细胞在两组脑脊液中的生长及增殖分化情况;并应用免疫细胞化学技术对两组脑脊液中神经干细胞的分化进行鉴定和比较.结果:神经干细胞在两种脑脊液中均能存活并分化,部分细胞悬浮生长达十余天之久.加脑脊液培养第二天试验组NSE阳性细胞(神经元)的比例比对照组高,有统计学意义(P<0.05);培养第十天试验组GFAP阳性细胞(星形胶质细胞)的比例比对照组高,NSE阳性细胞的比例比对照组低,有统计学意义(P<0.05).结论:神经干细胞在脑外伤血性脑脊液和脑积水清亮脑脊液中均能存活、增殖和分化.两组脑脊液对神经干细胞分化的种类上有差异.     

胚胎大鼠神经干细胞分离培养的实验研究

目的探讨胚胎大鼠神经干细胞的分离培养方法,并对其进行鉴定。方法从胚胎大鼠脑组织中分离神经干细胞,采用无血清培养技术,在生长因子的作用下使其在体外不断增殖克隆,同时利用免疫荧光染色的方法对培养的细胞进行鉴定。结果体外培养的细胞增殖成细胞克隆球并能稳定传代,经鉴定,均为nestin染色阳性细胞。结论利用无血清技术和特定生长因子,可以使来源于胚胎大鼠的神经干细胞在体外扩增并稳定传代。     

脑缺血再灌注神经干细胞原位激活的研究

目的 探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同时间、不同脑部位神经干细胞(NSC)原位激活的变化规律。方法 建立一侧大脑中动脉闭塞缺血再灌注模型,用5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记脑内增殖细胞,免疫组化(SP法)技术检测大鼠缺血再灌注不同时间段缺血周边皮质、双侧侧脑室下区(SVZ)、海马齿状回下区(SGZ)具有增殖能力细胞BrdU表达变化。结果 对照组脑组织双侧SVZ、SGZ可见少量BrdU阳性标记细胞;单纯脑缺血2 h组脑组织BrdU阳性细胞数未见明显增加;再灌注3天组,缺血侧皮质、双侧SVZ和SGZBrdU阳性细胞明显增多(P<0.05),7天时达到高峰(P<0.001),11天时下降,且缺血侧与对侧相比,双侧SVZ呈对称分布,而SGZ以缺血侧增加为主(P<0.05)。结论 一侧大脑中动脉闭塞缺血再灌注可致成年大鼠脑内NSC原位激活,且NSC增殖于缺血后1周达到高峰,激活部位以双侧SVZ、缺血侧海马和周边皮质为主。     

神经干细胞移植治疗大鼠创伤性脑外伤的实验研究

目的 将神经干细胞(NSCs)移植于大鼠创伤性脑损伤部位,观察NSCs对创伤性脑损伤的治疗作用.方法 首先进行NSCs的体外培养,同时采用5-2-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记,脑外伤模型采用自由落体撞击大鼠左侧大脑皮质运动感觉区来制作,脑外伤后24h内移植NSCs,分别于脑外伤前、脑外伤后1、2、3周时行神经运动行为学评分(NMFE)和免疫组织化学染色检测BrdU、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷酯(GalC)蛋白表达和TUNEL原位杂交染色,经计算机图像分析系统处理.结果 大鼠自由落体撞击伤后,右下肢神经运动功能障碍明显.神经运动行为学评分在第1周时,实验组与对照组无明显差异,而在第2、3周时,实验组的评分明显低于对照组,有统计学意义(P＜0.05).第2、3周时实验组NSE、GFAP和GalC染色阳性细胞数要多于对照组,nestin染色在第1周时表达最高,而后逐渐下降.BrdU阳性细胞在损伤灶中心区最多,在损伤灶的远隔部位也有少许发现,而TUNEL染色则对照组明显比NSCs组高,有统计学意义(P＜0.05).结论 脑外伤移植NSCs可以在损伤区存活、增殖及分化,并在损伤的远隔部位有少许NSCs迁移、分化.NSCs移植有利于大鼠脑自由落体撞击伤后期的功能恢复.     

异体骨髓间充质干细胞对EAE大鼠神经再生保护作用的研究

目的观察异体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植后在EAE大鼠体内存活、增殖、分化,探讨BMSCs对EAE的神经再生的修复作用及迁徙分化情况。方法 SD雌性大鼠45只,随机分为3组,其中EAE模型组20只,正常对照组5只,EAE模型BMSCs移植组20只。重组免疫蛋白MBP68-86诱导建立EAE的动物模型,在免疫后早期第5天静脉输注Wistar大鼠的BMSCs(4×106/只,0.4mL)。观察输注后大鼠神经功能变化和组织学变化,利用免疫组化方法检测不同时间脑脊髓神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、2’,3’-环腺苷酸-3’-磷酸二酯酶(CNPase)表达,观察BMSCs移植后EAE大鼠体内神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞数量。结果 EAE大鼠免疫后早期移植BMSCs,神经功能评分无论是高峰期评分还是平均评分显著低于EAE模型组。BMSCs移植组在第7天NSE阳性细胞数较EAE模型组表达水平增多,但并无显著性差异,而第15天、第21天和第30天NSE阳性细胞数明显高于EAE模型组的表达水平(P0.05)。BMSCs移植组各时间点CNPase染色阳性细胞数明显高于EAE模型组的表达水平(P0.05),随着时间迁移,BMSCs移植组CNPase染色阳性细胞数表达逐渐增加。BMSCs移植组各个时间点GFAP阳性细胞数与EAE模型组比较无显著性差异。病理检查显示EAE大鼠免疫后早期移植BMSCs可使脑组织炎症反应减轻,脱髓鞘病灶的数目也明显少于EAE模型组。结论预防性静脉输注BMSCs可能通过免疫调节,抑制免疫反应所致的神经细胞损伤,减少神经元和少突胶质细胞的凋亡,从而发挥神经保护作用,但不能排除仍有部分BMSCs在局部微环境信号的诱导下向脱髓鞘区迁徙并分化为髓鞘形成细胞的可能。     

A neuropathological analysis of experimental autoimmune encephalomyelitis with predominant brain stem and cerebellar involvement and differences between active and passive induction

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an autoimmune demyelinating disease that can be induced in a variety of animal species and which is commonly used as an animal model of multiple sclerosis. In rodent EAE models, the clinical disease is typified by ascending paralysis; however, other clinical patterns can also be observed by inducing disease with particular peptides of myelin proteolipid protein (PLP) or myelin oligodendrocyte glycoprotein. Here we describe EAE induced in C3H/HeJ mice by inoculation with residues 190–209 of PLP. This form of EAE is manifested clinically by a movement disorder, with axial rotation of the head and trunk. Histologically, this form of EAE is characterized by predominant cerebellar or brain stem involvement, depending on whether EAE is induced by active immunization with the PLP peptide, or by passive transfer of T cells specific for the peptide. The inflammatory cell infiltrate is composed of polymorphonuclear cells and mononuclear cells. This rotatory form of EAE may be a useful model for studying the neuropathological characteristics of multiple sclerosis affecting the brain stem and cerebellum. Received: 23 June 1999 / Revised, accepted: 25 October 1999