SH-SY5Y细胞α7尼古丁受体蛋白抑制对tau蛋白及p38 MAPK通路的影响及其与AD发病机制的关系

目的研究α7尼古丁受体(nAChR)蛋白抑制对SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化水平的影响及其与p38 MAPK通路的关系,探讨α7 nAChR调节tau蛋白磷酸化的相关机制。方法用α7 nAChR阻断剂MLA阻断SH-SY5Y细胞α7 nAChR蛋白的活化及其表达,用p38 MAPK阻断剂SB203580阻断SH-SY5Y细胞p38 MAPK信号通路蛋白的活化及其表达,Western blotting方法测定tau蛋白、p-tau(S404)、p-tau(S214)、α7 nAChR、p38 MAPK及p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白表达水平。结果细胞经MLA处理后,p-tau(S404)和p-tau(S214)蛋白水平明显升高(P0.01),p-p38 MAPK和α7 nAChR蛋白水平明显降低(P0.01),tau蛋白和p38 MAPK蛋白水平保持不变;经SB203580处理后,SB203580及MLA共同处理后均引起p-tau(S404)、p-tau(S214)、p-p38 MAPK和α7nAChR蛋白水平显著降低(P0.01),tau蛋白和p38 MAPK蛋白水平无变化。结论α7 nAChR可通过阻断p38MAPK信号传导通路抑制tau蛋白过度磷酸化。     

SH-SY5Y细胞α7神经型尼古丁受体基因沉默对突触相关蛋白的影响

目的研究神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)α7神经型尼古丁受体基因(α7 nAChR)表达沉默后对细胞突触相关蛋白的影响,探讨α7 nAChR神经保护作用机制及在阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的发病机制中的作用。方法用Real-time PCR法和蛋白免疫印迹(Western blot)法分别测定细胞中囊泡相关蛋白(synaptophysin)和突触后膜蛋白(PSD-95)mRNA蛋白表达水平的变化。结果α7 nAChR沉默组的突触相关蛋白PSD-95、SYPmRNA及蛋白表达都有明显的减少。结论沉默SH-SY5Y细胞α7 nAChR水平能够使细胞突触相关蛋白水平减少。这可能提示了α7 nAChR与细胞突触密切相关,并且α7 nAChR对突触有一定的保护作用,进一步说明α7nAChR在阿尔茨海默病的发病中起着重要作用。     

雌激素阻抑OA诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化

目的研究雌激素对冈田酸(OA)诱导的人神经母细胞瘤系(SH-SY5Y)细胞tau蛋白磷酸化的影响。方法 MTT观察OA对SH-SY5Y细胞活力的影响,制备AD时tau蛋白过度磷酸化的细胞模型;Western blot检测OA及雌激素对Thr231位点tau蛋白磷酸化的影响。结果 MTT结果表明:当OA浓度大于40nmol/L时,细胞活力受到明显抑制,低于此浓度的OA对细胞活力的影响不明显;Western blot结果表明,SH-SY5Y细胞经OA(40nmol/L 12h)处理后,tau蛋白磷酸化水平明显增加,这种作用可被雌激素所抑制。结论雌激素抑制了OA诱导的SH-SY5Y细胞的tau蛋白过度磷酸化。     

SH-SY5Y神经细胞中α7神经型尼古丁受体基因过表达对CaMK Ⅱ和CREB的影响

目的研究SH-SY5Y神经细胞中α7 nAChR基因过表达对CaMKⅡ和CREB的影响。方法复苏稳定转染α7 nAChR-pc DNA3.1质粒及空载质粒的SH-SY5Y神经细胞后,用含G418的培养液进行筛选培养;应用实时荧光定量PCR法和蛋白印迹法(Western blot)检测α7 nAChR基因过表达组、空载质粒组和正常对照组细胞中CaMKⅡ、CREB mRNA及蛋白表达水平的变化。结果与对照组相比,α7 nAChR基因过表达细胞组的CaMKⅡ、CREB mRNA表达水平分别增加了116.8%和114.7%(P0.01);及CaMKⅡ、CREB蛋白表达水平分别增加了8.7%(P0.05)和41.4%(P0.05)。结论α7 nAChR的神经保护作用可能与上调细胞CaMKⅡ、CREB水平有关。     

MAPK信号通路与阿尔茨海默病中tau蛋白磷酸化的关系

阿尔茨海默病(AD)是一类神经退行性疾病,tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结为其主要病理特征之一,是AD发病的重要因素.促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一类脯氨酸依赖的蛋白激酶,在AD病人体内参与诱导tau蛋白的过度磷酸化.MAPK的三条途径ERK、JNK、p38都参与诱导tau蛋白过度磷酸化,且与Aβ、氧化应激、炎性因子及蛋白磷酸酯酶等因素相关,由此阐述MAPK在AD进程中的重要作用,并提示MAPK可成为AD治疗中的新靶点.     

SH-SY5Y神经细胞中α7神经型尼古丁受体基因沉默对CaM、CaMKⅡ蛋白水平的影响

目的构建稳定的α7 n AChR沉默的神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)细胞,研究α7神经型尼古丁受体(n AChR)基因沉默对钙调蛋白(Ca M)、钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca MKⅡ)水平的影响,了解α7 n AChR神经保护作用及其与阿尔茨海默病(AD)发病机制的关系。方法将α7 n AChR shRNA重组质转染到SH-SY5Y,用含嘌呤霉素的培养液筛选,挑选阳性克隆后采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法(Western-blot)检测细胞中α7n AChR mRNA及蛋白表达水平的变化;Western-blot方法测定Ca M、Ca MKⅡ蛋白表达水平。结果获得稳定转染α7 n AChR shRNA重组质粒的细胞克隆株,与对照组相比,α7 n AChR mRNA及蛋白表达量分别减少了95%和80%。Ca M、Ca MKⅡ蛋白表达量分别减少了48.5%和35%。结论成功构建了α7 n AChR mRNA沉默的SH-SY5Y细胞细胞株,α7 n AChR沉默降低了Ca M、Ca MKⅡ的蛋白水平,可能影响信号通路转导,这可能与阿尔茨海默病(AD)的发病有一定的关系。     

p38MAPK基因对胶质瘤细胞C6生长周期的影响

目的 研究p38MAPK基因对大鼠胶质瘤细胞C6生长周期的影响。方法 利用脂质体将p38MAPK基因导入C6细胞中，用免疫细胞化学染色检测其在转染前后的表达，用HE染色、流式细胞仪、TUNEL等研究其对细胞形态、粘着状况和生长周期的影响。结果 pCMV5-p38MAPK组P38MAPK蛋白表达阳性，细胞形态发生变化，贴壁性降低，G1期百分比增加，而S期和G2期百分比减低，并出现凋亡峰。结论 p38MAPK基因可影响C6细胞的生长周期，并诱导C6细胞凋亡。     

VPA对OA处理的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化水平的影响

目的研究丙戊酸钠(VPA)对冈田酸(OA)处理的人神经母细胞瘤系(SH-SY5Y)细胞中tau蛋白磷酸化的影响。方法 MTT观察OA对SH-SY5Y细胞活力的影响,制备tau蛋白过度磷酸化的细胞模型;Western blot检测OA及VPA对Thr231位点tau蛋白磷酸化的影响。结果 MTT结果显示,当OA浓度大于40 nmol/L时,细胞活力受到明显抑制,而低于此浓度的OA对细胞活力的影响不明显;Western blotting结果显示,SH-SY5Y细胞经OA(40 nmol/L,12 h)处理后,Tau蛋白磷酸化的水平明显增加,给予VPA(10 mmol/L)作用12 h后,Tau蛋白磷酸化的水平明显下降。结论 VPA可以抑制OA处理的SH-SY5Y细胞的tau蛋白过度磷酸化。     

tau蛋白和磷酸化tau蛋白对神经系统疾病的影响

tau蛋白是一种神经元微管相关蛋白,参与轴突微管组装的调节。其磷酸化水平的增高与多种神经退行性疾病息息相关,如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆、亨廷顿病,等。有研究表明其与脑血管病的发生发展密不可分。而昼夜节律作为维持机体日常生命活动以及体内稳态的重要调节器,受昼夜节律因子的调节,其紊乱可诱发神经退行性疾病相关致病蛋白的积累和相关致病激素的异常分泌,从而加剧疾病的进展。文中主要围绕磷酸化tau蛋白和昼夜节律对神经系统疾病的影响进行论述。     

α-硫辛酸对电点燃致痫大鼠行为学及海马p38MAPK表达的影响

目的探讨α-硫辛酸(α-LA)对电点燃致痫大鼠行为及海马p38MAPK表达的影响。方法将雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、α-LA组、假手术组、ES组、电低α-LA组、电高α-LA组。检测点燃前、后发放阈值(ADT)及达到每个发作等级所需的累积刺激数和累积后发放持续时间(ADD),应用Western blot检测海马p38MAPK及p-p38MAPK表达水平,碘化丙啶(PI)染色检测海马神经元凋亡率。结果与ES组相比:电高α-LA组达到第一次Ⅴ级发作所需的累积电刺激数明显增多(P<0.05)、点燃后ADT明显增高(P<0.05);电低α-LA组和电高α-LA组海马p-p38MAPK表达水平和神经元凋亡率明显降低(P<0.05)、达到第一次Ⅴ级发作所需的累积ADD明显缩短(P<0.05)。各组点燃后ADT较点燃前均明显降低(P<0.05)。结论癫痫可导致海马组织中pp38MAPK表达上调、神经元凋亡率明显增加;α-LA能够有效降低癫痫发作等级、缩短ADD、下调p-p38MAPK表达水平并降低神经元凋亡率,从而推测α-LA可通过抗凋亡途径来发挥神经保护作用。     

α3神经型尼古丁受体基因上调对SH-SY5Y细胞突触素水平的影响

目的构建使α3nAChR基因上调的重组质粒α3nAChR-pcDNA3.1并转染至神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),研究α3nAChR基因上调对细胞突触素(SYP)水平的影响。方法设计α3nAChR上下游引物,通过逆转录PCR的方法获取人α3nAChR特异核苷酸序列,并将其克隆到质粒载体pcDNA3.1上,构建重组质粒α3nAChR-pcDNA3.1;瞬时转染至SH-SY5Y细胞后,用Real-time法和蛋白免疫印迹法分别α3nAChR及蛋白水平,并检测上调细胞中SYPmRNA和蛋白水平的变化。结果成功构建了使α3nAChR基因上调的重组质粒α3nAChRpcDNA3.1;将α3nAChR-pcDNA3.1质粒转染到SH-SY5Y细胞后,与空载质粒组及正常对照组相比,α3nAChRmRNA及蛋白表达水平分别增加了422%和106%(P0.05);SYPmRNA及蛋白表达水平分别增加了115%和43%(P0.05)。结论α3nAChR表达的上调可使细胞SYP的表达增加,说明了α3nAChR与SYP密切相关,在AD的发生中可能起着重要作用。     

p38MAPK信号通路与应力介导成肌细胞的凋亡*

背景：在体内条件下,细胞力学的功能研究因其所处生理环境的复杂性、实验条件的不易控制而很难得到满意结果。 目的：在成功构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型的基础上,研究p38MAPK信号通路在成肌细胞凋亡中的作用及其机制。 方法：将体外培养的C2C12细胞分为对照组和SB203580组,SB203580组中加入 20 mmol/L的p38MAPK抑制剂SB203580。应用细胞应力加载装置Flecell Strain Unit-5000T给细胞提供15%的力值,分别施加0,6,12,24 h的周期性张应力。每分钟10个循环,每循环包括3 s牵张,3 s松弛。Hoechst 33258染色观察细胞的形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;RT-PCR法检测促凋亡基因bax mRNA的表达;Western blot检测信号通路中p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达。 结果与结论：随着加力时间的延长,细胞逐渐出现核固缩及凋亡小体,凋亡率增加(P < 0.05),bax mRNA表达增多(P < 0.05);细胞p38MAPK和p-p38MAPK蛋白均在加力6 h达到最低,此后逐渐升高。p38MAPK抑制剂SB203580可抑制加力引起的细胞凋亡,减少bax mRNA及p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达(P < 0.05)。说明p38MAPK信号通路在应力介导的成肌细胞凋亡中起到重要的作用。     

p38MAK基因诱导胶质瘤细胞凋亡机制的初步研究

目的 初步探讨p38MAPK基因诱导大鼠胶质瘤细胞C6发生凋亡的机制。方法 利用脂质体介导法将p38MAPK基因导入C6细胞中,用夹心法ELISA检测细胞培养液中sTNF-α水平的变化,用流式细胞仪检测膜TNF-α和膜TNFRI水平的变化。结果 转染pCMV5-p38MAPK后,细胞培养液中sTNF-α水平明显升高,膜TNF-α水平无明显变化,膜TNFRI表达升高。结论 p38MAPK可能通过上调sTNF-α和膜TNFRI水平而诱导C6细胞凋亡。     

抑制p38 MAPK信号通路对海马神经元毒性损伤的保护作用

目的通过观察细胞表面形态的三维构像变化,探讨抑制p38 MAPK通路对减轻红藻氨酸(KA)毒性作用引起大鼠海马神经元所造成损害的作用和机制。方法原代培养10 d的海马神经元给予SB203580(0.2μmol/L),p38MAPK特异性抑制剂)预处理.30min后再予不同浓度(0μmol/L,25μmol/L和250μmol/L)KA分别作用10 min和100 min,利用原子力显微镜(AFM)对细胞表面结构进行纳米级水平扫描和观测。结果正常海马神经元表面光滑,起伏均匀、规律;KA作用后神经元呈退行性改变,表现为胞体肿胀,胞膜表面粗糙,出现隆起和“孔洞”样胞膜破裂结构,并且其变化程度分别与作用时间和KA浓度呈量-效关系;预先给予SB203580处理,以上变化有所减轻。结论KA毒性作用后海马神经元胞膜表面超微结构所产生明显变化;p38MAPK信号通路参与这种损害过程;抑制该信号转导通路,对海马神经元的毒性损害起一定保护作用。     

丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠磷酸化p38MAPK和MMP-9表达及细胞凋亡的影响

目的 探讨丹参酮ⅡA(Tanshinone,TanⅡA)对缺血再灌注(IR)损伤大鼠细胞凋亡和血脑屏障通透性的影响及与p38MAPK通路的关系.方法 60只大鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)、TanⅡA低剂量治疗组、TanⅡA高剂量治疗组,线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型.TanⅡA高、低剂量组于术前连续灌胃给予高、低剂量TanⅡA3d,每日1次.各组于脑缺血120min再灌注24h,采用免疫组化法观察大鼠额顶部皮质磷酸化p38 MAPK和MMP-9表达;TUNEL法检测神经细胞凋亡,检测伊文斯蓝(EB)含量变化.结果 (1)与Sham组相比,IR组磷酸化p38MAPK和MMP-9明显升高(P＜0.05);与IR组比较,TanⅡA高、低剂量治疗组磷酸化p38MAPK和MMP-9表达均降低,且高TanⅡA组明显低于低TanⅡA组(P均＜0.05);(2)与Sham组相比,IR组凋亡细胞明显增加;与IR组比较,TanⅡA高、低剂量治疗组凋亡细胞均减少,且高TanⅡA组明显低于低TanⅡA组(P均＜0.05).(3)与Sham组比较,IR组脑组织EB含量明显升高;与IR组比较,TanⅡA高、低剂量治疗组脑组织EB含量明显降低(P＜0.05),且高TanⅡA组明显低于低TanⅡA组(P均＜0.05).结论 TanⅡA减少脑缺血再灌注后细胞凋亡,抑制MMP-9表达降低血脑屏障通透性,可能与抑制p38 MAPK信号通路有关.     

NOS、p38MAPK、Caspase-3介导大鼠脑缺血神经细胞凋亡可能通路的实验研究

目的探讨脑缺血后细胞凋亡发生的可能机制以及神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated proteinkinasep38,p38MAPK)和半光氨酸蛋白酶-3(caspase-3)在脑缺血后神经细胞凋亡中的共同作用机制。方法采用线栓法闭塞大鼠大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion,MACO)建立脑缺血SD大鼠模型,应用透射电镜观察脑缺血对脑组织超微结构的影响,流式细胞仪方法(FCM)分别定量检测细胞凋亡率,半定量RT-PCR检测nNOS、iNOS,p38MAPK和Caspase-3mRNA表达水平。结果透视电镜下脑缺血6h出现核固缩,缺血12h出现细胞核分裂,缺血24h出现凋亡小体;FCM检测细胞凋亡百分率随着缺血时间延长而增加,缺血72h达到高峰,约70.37%;RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示nNOS、iNOS、p38MAPK和Caspase-3mRNA的特异性片段大小分别为501、342、250和342bp,但mRNA表达量不一致,nNOS mRNA主要在缺血早期表达,iNOS、p38MAPK和Caspase-3mRNA在缺血中晚期表达,并在缺血3~5d,后三种基因的表达量达到高峰。结论脑缺血区域发生典型的神经细胞凋亡现象,nNOS来源的NOS在缺血早期发挥神经毒性作用,iNOS来源的NOS在缺血晚期发挥神经毒性作用;NOS,p38MAPK和Caspase-3三种基因的相互关系可能构成介导缺血神经细胞凋亡的通路之一。     

p38 MAPK、Caspase-s介导PTH诱导PC12细胞凋亡机制的研究

目的甲状旁腺激素(PTH1-34)对PC12细胞作用和p38MAPK、Caspase-s在PTH1-34对PC12细胞凋亡中作用机制。方法应用CCK-8法测定PTH对PC12细胞生长抑制率,通过细胞形态学、乳酸脱氢酶(LDH)和流式细胞仪方法检测细胞损伤,RT-PCR测定p38 mRNA的表达,通过Western blot检测细胞中p38磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及caspase-3蛋白的变化。结果 CCK-8法测定PTH抑制PC12细胞生长;透射电镜可见细胞核呈固缩状、凋亡小体出现等典型的凋亡形态学改变;流式细胞仪可见细胞凋亡率增多;LDH渗出量增多等。PTH1-34可明显上调p38 mRNA的表达,并可明显地促进PC12细胞磷酸化p38MAPK与Caspase-3的蛋白表达。结论 PTH可诱导PC12细胞凋亡,p38MAPK和Caspase-s共同介导参与PTH致PC12细胞凋亡。     

β淀粉样蛋白对SH-SY5Y细胞内胆固醇代谢的影响

目的 探讨β淀粉样蛋白（Aβ）单体和寡聚体对SH-SY5Y细胞内胆固醇代谢的影响及其意义.方法 用不同浓度的Aβ40、Aβ42的单体及寡聚体处理SH-SY5Y细胞,荧光分光光度法分析细胞内总胆固醇（TC）、游离胆固醇（FC）和释放到胞外的胆固醇浓度,油红O染色观察细胞内脂质含量.结果 用浓度为0.004,0.4,4μg/ml的Aβ10寡聚体处理细胞时,胞内总胆固醇的浓度（95.164±8.080）,（80.408±15.893）,（70.329±4.054）μg/mg相较于对照组（109.144±10.061）μg/mg显著减少,差异有统计学意义（f分别为2.654,3.742,8.767;P＜0.05）.当Aβ40寡聚体浓度为4μg/ml时,释放到细胞外的胆固醇浓度为（5.675±0.436）μg/mg,相较于对照组（3.743±0.162）μg/mg显著增多,差异有统计学意义（t=-10.161,P＜0.01）.但Aβ42寡聚体对游离胆固醇的浓度影响差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 Aβ40寡聚体使SH-SY5Y细胞内的总胆固醇减少,释放到胞外的胆固醇增多,可能是Aβ40抑制了胆田醇合成或流出的结果.脂代谢异常可能是阿尔茨海默病的病理机制之一.     

TLR4-P38MAPK信号通路在LPS诱导BV2细胞中的表达及意义

目的观察LPS诱导小胶质细胞后信号通路Toll样受体4(TLR4)-p38蛋白激酶(p38MAPK)的表达及意义。方法体外培养BV2小胶质细胞,分为对照组、LPS诱导组(LPS刺激12h及24h)及SB203580干预组(LPS+SB203580诱导12h及24h),应用ELISA法检测各组TNF-α、IL-6水平,RT-PCR法检测各组TLR4mRNA和p38MAPK mRNA的表达变化。结果 LPS诱导组细胞分泌TNF-α、IL-6水平显著提高,诱导24h后细胞上清液含量分别为(513.67±14.05)pg/mg和(396.84±15.41)pg/mg。给予SB203580抑制剂后TLR4mRNA和p38MAPK mRNA表达明显减弱,细胞分泌TNF-α、IL-6含量表达与感染组比较也明显降低。结论 LPS刺激小胶质细胞可引起TLR4-p38MAPK信号通路的活化并释放炎性细胞因子,而SB203580则对其有明显的抑制作用,证明TLR4-p38MAPK信号通路与小胶质细胞的炎性活化密切相关。