自噬在视网膜母细胞瘤Y79细胞顺铂耐药中的作用及其机制

目的 研究自噬在视网膜母细胞瘤Y79细胞顺铂耐药中的作用及其机制。方法 CCK-8法检测细胞IC50;将Y79细胞随机分为对照组（Control）、顺铂组（Cis）和顺铂联合应用自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤组（Cis+3-MA）,Western blot法、细胞自噬染色检测试剂盒（MDC法）和透射电子显微镜观察细胞自噬情况;CCK-8法检测顺铂对细胞的抑制率变化,Annexin V/PI双染流式法检测细胞凋亡变化,q-PCR检测相关耐药基因转录水平,Fluo-4 AM钙离子荧光探针染色检测细胞内钙离子变化,Western blot法检测CaMKK2、p-AMPK、mTORC1、LC3Ⅱ的表达。结果 视网膜母细胞瘤Y79细胞在顺铂的诱导下发生自噬,加入自噬阻断剂3-MA后细胞自噬水平下调。与顺铂组相比,Cis+3-MA组顺铂抑制率增加,凋亡率增加,相关耐药基因转录水平下调。细胞加入顺铂后,细胞内钙离子水平增加,CaMKK2、p-AMPK、LC3Ⅱ表达上调,mTORC1表达下调。结论 顺铂诱导肿瘤细胞产生的自噬对视网膜母细胞瘤细胞Y79耐药起保护作用,抑制自噬可以改善肿瘤细胞对顺铂的耐药性。顺铂可能是通过Ca2+激活CaMKK2/AMPK/mTORC1通路诱导Y79细胞自噬。     

维生素E琥珀酸酯处理人胃癌细胞过程中自噬与内质网应激的交互作用

目的:探讨维生素E琥珀酸酯(VES)处理人胃癌SGC-7901细胞过程中自噬与内质网应激的交互作用。方法:用不同剂量(0、5、10、15、20 μg/mL)VES处理人胃癌SGC-7901细胞24 h后,激光共聚焦显微镜观察细胞内自噬标志蛋白微管相关蛋白l轻链3(LC3)荧光强度和分布情况,Western blot分别检测内质网应激标志物葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、葡萄糖调节蛋白94(GRP94)和LC3、Beclin-1的表达情况;在分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和氯喹(CQ)以及内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)预处理2 h后,以20 μg/mL VES处理人胃癌SGC-7901细胞24 h,Western blot分别检测内质网应激标志物GRP78、GRP94及自噬标志蛋白LC3、Beclin-1的变化。结果:与阴性对照组比较,随着VES剂量的增加,激光共聚焦显微镜观察到LC3在细胞内点状分布逐渐聚集和增强,GRP78和GRP94表达先降低后升高(P均<0.05),LC3和Beclin-1表达逐渐升高(P均<0.05);VES+3-MA组及VES+CQ组的GRP78和GRP94蛋白表达均高于单独VES组(P均<0.05);VES+4-PBA组的LC3和Beclin-1蛋白表达均低于单独VES组(P均<0.05)。结论:VES处理人胃癌细胞过程中自噬与内质网应激可以相互调节,具有交互作用。     

p53凋亡刺激蛋白2对饥饿诱导的大肠癌HCT116 p53+/+细胞凋亡、周期和自噬的影响

目的 探讨p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)对饥饿诱导的大肠癌HCT116 p53+/+(p53野生型)细胞凋亡、周期和自噬的影响.方法 实验分6组:①对照组;②绿色荧光蛋白腺病毒(rAd-GFP)感染组;③ASPP2腺病毒(rAd-ASPP2)感染组;④饥饿处理组;⑤rAd-GFP+饥饿组;⑥rAd-ASPP2+饥饿组.利用rAd-ASPP2感染使细胞过表达ASPP2基因.无血清培养基培养24h诱导凋亡、自噬和细胞周期改变.钙黄绿素(Calcein)/碘化丙啶(PI)吸收试验观察各组细胞调亡水平.细胞转染红色荧光蛋白标记的CFP-Lc3自噬质粒,荧光显微镜下观察各组细胞自噬水平.流式细胞术观察细胞周期改变.组间比较采用单因素方差分析进行统计学分析.结果 ASPP2过表达显著促进了饥饿诱导的细胞凋亡、自噬及G2-M期阻滞,各组细胞的凋亡率为:rAd-GFP+饥饿组10.00％±1.42％,rAd-ASPP2+饥饿组18.44％ ±2.06％(q=9.548,P=0.000);各组细胞的自噬发生率为:rAd-GFP+饥饿组35.00％±5.34％,rAd-ASPP2+饥饿组57.61％ ±6.06％(q=7.657,P=0.000).但无饥饿诱导时ASPP2过表达使G0-G1、G2-M期都发生阻滞.结论 ASPP2过表达促进饥饿诱导的大肠癌HCT116 p53+/+细胞凋亡和自噬,显著改变细胞周期进程.     

二甲双胍逆转人卵巢癌细胞株对顺铂耐药的实验研究

目的 探讨二甲双胍对人卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3／DDP的耐药逆转作用及机制。方法 将人卵巢癌细胞株SKOV3细胞设为亲本组,耐顺铂细胞株SKOV3／DDP细胞分为空白对照组、顺铂组、二甲双胍组和联合用药组（顺铂+二甲双胍组）;采用CCK-8法检测不同浓度二甲双胍对SKOV3／DDP细胞的作用,RT-PCR和Western blotting检测各组细胞中内质网应激相关蛋白的表达。结果 不同浓度二甲双胍作用24h后,对SKOV3细胞和SKOV3／DDP细胞均有抑制作用,且呈浓度依赖性（P＜0.05）;当二甲双胍＞5 mmol／L时,其对SKOV3／DDP细胞的增殖抑制率高于SKOV3细胞（P＜0.05）。顺铂对SKOV3细胞和SKOV3／DDP细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为15.25 μg／ml和118.68 μg／ml,SKOV3／DDP的耐药倍数为7.78。联合用药组SKOV3／DDP细胞IC50为 73.45 μg／ml,耐药倍数为4.81。二甲双胍对SKOV3／DDP细胞对顺铂耐药性的逆转倍数为1.62。亲本组中GRP78 mRNA和蛋白的相对表达水平分别为0.38±0.02和0.24±0.04;顺铂组、二甲双胍组和联合用药组的GRP78 mRNA的相对表达水平分别为0.93±0.02、0.68±0.02、0.49±0.07,与空白对照组的0.83±0.04比较,联合用药组明显降低,其次为二甲双胍组,顺铂组升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）;GRP78蛋白在各组中表达与其mRNA表达趋势一致,差异均有统计学意义（P＜0.05）。顺铂组、二甲双胍组、联合用药组CHOP蛋白的表达量分别为0.42±0.03、0.69±0.03、0.84±0.01,均高于空白对照组的0.39±0.05,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 二甲双胍对人卵巢癌顺铂耐药细胞的耐药性有调节作用,其可能作用机制为通过降低GRP78表达,提高CHOP蛋白表达的内质网应激途径促进细胞凋亡来降低耐药细胞对顺铂的耐药性。     

顺铂耐受胶质瘤细胞株诱导和细胞自噬的观察

背景与目的:明确胶质瘤耐药相关分子机制,有助于寻找新的治疗对策。我们将诱导对顺铂耐药的脑胶质瘤细胞株,探讨细胞自噬和胶质瘤细胞顺铂耐受的关系。方法:应用人胶质瘤细胞株U251,采用顺铂剂量梯度爬升筛选方法,诱导耐药胶质瘤细胞株;用MTT法测定该耐药细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC50);电镜和GFP-LC3荧光染色检测细胞内自噬体;AnnexinV-FITC染色检测细胞凋亡;Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1以及凋亡分子Caspase-3水平。结果:我们诱导获得的耐药胶质瘤细胞株U251/CP2对顺铂半数抑制浓度(IC50)较亲代U251增加了62.7倍(分别是1.2±0.4μg/ml和76.5±22.5μg/ml)。电镜和GFP-LC3荧光染色观察表明胶质瘤细胞呈现典型的自噬特征,表现为电镜下广泛的自噬性空泡的出现和GFP-LC3斑点状分布,且能够被自噬抑制剂3-MA和ERK抑制剂PD98059抑制。凋亡检测表明,经顺铂处理后,U251/CP2较U251凋亡率低,3-MA和PD98059能够显著增强顺铂对U251/CP2的凋亡诱导作用。Western blot检测表明,U251/CP2较U251具有显著上调的LC3和Beclin1水平,而Caspase-3水平较低。结论:U251胶质瘤细胞能够通过自噬作用保护细胞免受化疗药物顺铂的杀伤,从而免于发生细胞凋亡。     

奥沙利铂诱导的人肝癌细胞株HepG2自噬潮增加及其对细胞生存率的影响

目的:研究奥沙利铂(oxaliplatin,Oxa)对人肝癌HepG2细胞自噬功能的影响,并初步探讨自噬在Oxa诱导细胞死亡中的作用.方法:体外常规培养的人肝癌细胞HepG2,分别以Oxa单药和Oxa+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或氯喹(chloroquine,CC)联合作用后,采用CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞活力的变化;透射电子显微镜下观察Oxa作用后HepG2细胞内自噬体的形成;蛋白印迹法检测自噬标志蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转变.结果:Oxa可引起HepG2细胞死亡并呈现出剂量依赖关系,当与3-MA或CQ联用时均能对HepG2细胞的生长产生明显的抑制作用;Oxa作用后可诱导HepG2细胞内自噬小体的形成,并出现自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达的增多,CQ抑制自噬降解通路后LC3-Ⅱ蛋白则明显增加(自噬潮增加);3-MA则可以抑制HepG2细胞自噬体的形成.结论:Oxa可以增强HepG2细胞的自噬功能,诱导自噬体形成增加;不同靶点的自噬抑制剂3-MA或CQ均可明显增加Oxa对肝癌细胞的生长抑制作用,增强Oxa的肿瘤杀伤作用.     

干扰Plexin-B1对卵巢癌SKOV3细胞自噬和顺铂敏感性的影响

目的:探讨干扰丛状蛋白B1(Plexin-B1)对卵巢癌SKOV3细胞自噬和顺铂敏感性的影响。方法:合成Plexin-B1的siRNA序列和NC序列,转染至卵巢癌SKOV3细胞,qRT-PCR检测转染效率。将细胞分为对照组、NC组和si-Plexin-B1组,CCK8检测细胞活性,qRT-PCR法检测细胞中Plexin-B1 mRNA的表达,Western blot法检测细胞中Plexin-B1、Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ、CALR和PRKDC蛋白的表达。不同浓度的顺铂(1、2、4、8、16、32μg/mL)处理细胞,CCK8检测各组细胞增殖情况,评估干扰Plexin-B1对顺铂敏感性的影响。结果:与对照组相比,干扰Plexin-B1后卵巢癌SKOV3细胞活性、细胞中Plexin-B1 mRNA和蛋白表达水平及Akt蛋白的磷酸化水平均显著降低(P<0.05),细胞中LC3-Ⅱ、CALR和PRKDC蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。CCK8检测结果显示,卵巢癌SKOV3细胞增殖能力随着顺铂浓度的升高逐渐降低,且干扰Plexin-B1后卵巢癌SKOV3细胞的增殖能力较...     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷诱导乳腺癌细胞自噬与DNA损伤相关联

目的:探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷对乳腺癌细胞自噬的影响及其可能的机制.方法:用依托泊苷、顺铂和5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理乳腺癌细胞后,采用彗星实验测定细胞DNA损伤,蛋白质印迹法检测p53和p21蛋白表达;细胞自噬测定用3种方法:(1)蛋白质印迹法检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ (microtubule-associated protein1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)蛋白的表达;(2)用单丹磺酰戊二胺对乳腺癌细胞染色后,在荧光显微镜下计数自噬泡阳性细胞,并计算自噬泡阳性细胞百分比;(3)将pEGFP-LC3质粒转染至乳腺癌细胞后,在荧光显微镜下计数含绿色荧光蛋白的阳性细胞,并计算绿色荧光蛋白阳性细胞的百分比.结果:依托泊苷和顺铂均可诱导乳腺癌细胞DNA损伤和自噬,与对照组比较,药物处理组细胞的彗星长度增长(P＜0.01),p53、p21和LC3-Ⅱ蛋白表达上调.5-氮杂-2’-脱氧胞苷也可诱导乳腺癌细胞DNA损伤和自噬,与对照组比较,处理组细胞的彗星长度增长(P＜0.01),p53、p21和LC3- Ⅱ蛋白表达上调,自噬泡阳性细胞百分比和绿色荧光蛋白阳性细胞百分比上升,差异均有统计学意义(P＜0.05和P＜0.01).结论:5-氮杂-2’-脱氧胞苷可诱导乳腺癌细胞自噬,其机制可能与其所诱导的DNA损伤有关.     

自噬抑制剂促进紫杉醇耐药卵巢癌细胞对化疗敏感性的研究

目的 探讨自噬激活在紫杉醇(paclitaxel, PTX)耐药卵巢癌(ovarian cancer)细胞中的作用及自噬抑制对耐药细胞化疗的影响。方法 以卵巢癌细胞系SKOV3和紫杉醇耐药卵巢癌细胞(SKOV3/PTX)为研究对象;利用MTT实验检测细胞活力变化;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;免疫印迹(Western blot, WB)法检测蛋白表达变化;利用脂质体瞬时转染法使细胞表达LC3-GFP-RFP荧光蛋白;利用激光共聚焦显微镜检测细胞荧光蛋白定位及表达。结果 相比SKOV3细胞,相同剂量的PTX对SKOV3/PTX细胞的活力抑制能力明显降低,紫杉醇对SKOV3细胞和SKOV3/PTX细胞的半数抑制浓度((inhibitory concentration 50%,IC50)分别为(41.91±2.92)μM和(114.6±17.6)μM。此外,在凋亡水平上,PTX对SKOV3/PTX细胞的诱导凋亡作用显著降低。通过LC3-GFP-RFP过表达和LC3、p62蛋白检测,证明SKOV3/PTX细胞的自噬激活程度增高。采用自噬抑制剂氯喹(chloroquine, CQ)...     

氯喹促进顺铂诱导胃癌SGC7901细胞凋亡及其机制

  目的  研究自噬对顺铂（cisplatin,DDP）诱导的胃癌SGC7901细胞凋亡的影响,并初步探讨其可能机制。  方法  DDP和（或）氯喹处理胃癌SGC7901细胞,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,MDC染色后荧光显微镜观察自噬囊泡,West. ern Blot检测自噬和凋亡相关蛋白。  结果  5 mg/L的顺铂作用于胃癌SGC7901细胞24 h,细胞凋亡率为21.07%±2.12%,同时观测到自噬囊泡增多和LC3-Ⅱ蛋白表达升高;氯喹特异性抑制自噬活性后,提高了顺铂诱导的细胞凋亡率（30.16%±3.54%,P < 0.05）;检测到凋亡相关蛋白Caspase-3和P53表达增加,Bcl-2蛋白表达下降。  结论  自噬在顺铂诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的过程中起保护作用,氯喹抑制自噬后,可能通过激活P53蛋白及灭活Bcl-2蛋白的表达来促进细胞凋亡,联合应用顺铂和氯喹有望成为胃癌治疗的新策略。      

雷帕霉素增强卵巢癌细胞系对顺铂敏感性的机制研究

目的：研究雷帕霉素对卵巢癌细胞系顺铂敏感性的影响,以及PI3K/AKT/mTOR信号通路（简称mTOR信号通路）与卵巢癌细胞系顺铂耐药的相关性;初探雷帕霉素增强卵巢癌细胞系顺铂敏感性的分子机制。方法采用CCK-8法检测卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP的耐药指数（resistance index,RI）、细胞增殖抑制率;采用克隆平板实验观察不同用药方案对卵巢癌顺铂非耐药细胞系及SKOV3细胞系两种细胞系克隆形成的影响;采用蛋白质印迹法（Western blot）检测两种细胞系的蛋白表达差异。结果①SKOV3/DDP细胞系的RI为6.10,属中度耐药。②在SKOV3细胞系中,顺铂联合雷帕霉素作用24 h、48 h后的细胞增殖抑制率明显高于单用顺铂组,差异有统计学意义（P＜0.01）,两组间的72 h细胞增殖抑制率无明显的统计学意义（P＞0.05）;顺铂联合雷帕霉素作用于SKOV3/DDP细胞系24 h、48 h、72 h后的细胞增殖抑制率均明显高于单用顺铂组,差异有统计学意义（P＜0.01）。③雷帕霉素联合顺铂作用于SKOV3细胞系4 h后,其克隆形成抑制率明显高于单用顺铂组,差异有统计学意义（P＜0.01）。④SKOV3/DDP细胞系比SKOV3细胞系p-mTOR、p-AKT的表达升高,而mTOR、AKT的表达则相似。⑤联合用药组比单用顺铂组的PARP断裂增加。⑥雷帕霉素作用SKOV3细胞系24 h ,BCL2表达下调,LC3B由LC3BⅠ向LC3BⅡ转化增加;在SKOV3/DDP细胞系中未发现这两种作用。结论①在体外培养条件下,雷帕霉素能增强SKOV3及SKOV3/DDP细胞系对顺铂的敏感性。②mTOR信号通路激活可能在卵巢癌细胞系顺铂耐药机制中起重要作用。③雷帕霉素增强SKOV3细胞系对顺铂敏感性的分子机制包括：增强顺铂所致的DNA断裂、下调抗凋亡蛋白BCL2及引起细胞自噬;雷帕霉素增强SKOV3/DDP对顺铂敏感性分子机制可能与增强顺铂所致的DNA断裂有关。     

miR-30a对卵巢癌细胞PTEN/PI3K/AKT/mTOR自噬通路及顺铂耐药性的影响

目的:探究miR-30a对人卵巢癌SKOV3细胞自噬及顺铂耐药性的影响,并初步研究其作用机制。方法:体外培养人卵巢癌SKOV3细胞和人卵巢癌细胞（耐药）细胞（SKOV3/DDP）;将SKOV3/DDP细胞随机分为对照组、miR-30a 阴性对照（NC）组和miR-30a模拟（mimics）组,SKOV3细胞作为正常组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞miR-30a表达情况;CCK-8法检测各组细胞顺铂耐药性;Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞凋亡情况;蛋白印迹分析法检测各组细胞微管相关蛋白轻链3 I/II（LC3I/II）、p62、磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（p-AKT）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）表达情况;双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-30a与PTEN的靶向关系。结果:与对照组和miR-30a NC组相比,miR-30a mimics组SKOV3/DDP细胞miR-30a表达水平、凋亡率、p62、p-PI3K、p-AKT及p-mTOR水平显著升高（P＜0.05）,IC50值、LC3II、PTEN蛋白表达水平及LC3II/LC3I比值显著降低（P＜0.05）;与正常组相比,对照组SKOV3/DDP细胞上述各指标变化趋势完全相反;mirbase数据库预测显示,miR-30a与PTEN mRNA 3' UTR区有结合位点,与PTEN-3' UTR-WT+miR-30a NC组比较,PTEN-3' UTR-WT+miR-30a inhibitor组荧光素酶活性降低（P＜0.05）。结论:miR-30a可能通过靶向抑制PTEN表达,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路调控人卵巢癌细胞自噬,降低卵巢癌细胞的顺铂耐药性。     

Inhibition of autophagy enhances cisplatin cytotoxicity through endoplasmic reticulum stress in human cervical cancer cells

The function of autophagy in cisplatin-treated cancer cells is not fully understood. Cisplatin treatment induced degradation of ubiquitinated proteins by autophagy, which reduced apoptosis induced by endoplasmic reticulum (ER) stress and downregulated the mitochondrial pathway of apoptosis. Inhibition of autophagy using 3-methyladenine (3-MA) or chloroquine (CQ) increased the levels of intracellular misfolded proteins, which enhanced cellular apoptosis. We found that tunicamycin, an ER stress inducer, augmented cisplatin cytotoxicity by upregulating ER stress-mediated apoptosis. Our data indicates that autophagy plays an important role in preventing cisplatin-induced apoptosis in HeLa cells, thus inhibition of autophagy may improve cisplatin chemotherapy.     

NAC1 modulates sensitivity of ovarian cancer cells to cisplatin by altering the HMGB1-mediated autophagic response

Nucleus accumbens-1 (NAC1), a nuclear factor belonging to the BTB/POZ gene family, is known to have important roles in proliferation and growth of tumor cells and in chemotherapy resistance. Yet, the mechanisms underlying how NAC1 contributes to drug resistance remain largely unclear. We report here that autophagy was involved in NAC1-mediated resistance to cisplatin, a commonly used chemotherapeutic drug in the treatment of ovarian cancer. We found that treatment with cisplatin caused an activation of autophagy in ovarian cancer cell lines, A2780, OVCAR3 and SKOV3. We further demonstrated that knockdown of NAC1 by RNA interference or inactivation of NAC1 by inducing the expression of a NAC1 deletion mutant that contains only the BTB/POZ domain significantly inhibited the cisplatin-induced autophagy, resulting in increased cisplatin cytotoxicity. Moreover, inhibition of autophagy and sensitization to cisplatin by NAC1 knockdown or inactivation were accompanied by induction of apoptosis. To confirm that the sensitizing effect of NAC1 inhibition on the cytotoxicity of cisplatin was attributed to suppression of autophagy, we assessed the effects of the autophagy inhibitors 3-methyladenosine and chloroquine, and small interfering RNAs (siRNAs) targeting beclin 1 or Atg5 on the cytotoxicity of cisplatin. Treatment with 3-methyladenosine, chloroquine or beclin 1 and Atg5-targeted siRNA also enhanced the sensitivity of SKOV3, A2780 and OVCAR3 cells to cisplatin, indicating that suppression of autophagy indeed renders tumor cells more sensitive to cisplatin. Regulation of autophagy by NAC1 was mediated by the high-mobility group box 1 (HMGB1), as the functional status of NAC1 was associated with the expression, translocation and release of HMGB1. The results of our study not only revealed a new mechanism determining cisplatin sensitivity but also identified NAC1 as a novel regulator of autophagy. Thus, the NAC1-mediated autophagy may be exploited as a new target for enhancing the efficacy of cisplatin against ovarian cancer and other types of malignancies.     

p62/SQSTM1 involved in cisplatin resistance in human ovarian cancer cells by clearing ubiquitinated proteins

Mechanisms of cisplatin resistance in cancer cells are not fully understood. Here, we show a critical role for the ubiquitin-binding protein p62/SQSTM1 in cisplatin resistance in human ovarian cancer cells (HOCCs). Specifically, we found that cisplatin-resistant SKOV3/DDP cells express much higher levels of p62 than do cisplatin-sensitive SKOV3 cells. The protein p62 binds ubiquitinated proteins for transport to autophagic degradation, reducing apoptosis induced by endoplasmic reticulum (ER) stress in SKOV3/DDP cells. Knockdown of p62 or inhibition of autophagy using 3-methyladenine resensitises SKOV3/DDP cells to cisplatin. Collectively, our data indicate that p62 acts as a receptor or adaptor for autophagic degradation of ubiquitinated proteins, and plays an important role in preventing ER stress-induced apoptosis, leading to cisplatin resistance in HOCCs.     

刀豆蛋白A联合淋巴细胞对卵巢癌细胞SKOV3影响观察

目的：体外研究刀豆蛋白A（Concanavalin A,Con A）联合淋巴细胞对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞形态、活力、凋亡以及顺铂敏感性的影响。方法：应用密度梯度离心法分离健康成人新鲜血中的单个核细胞,培养3～5d待单核细胞完全贴壁后分离出悬浮的淋巴细胞,与SKOV3细胞混合培养,并设对照组（未处理的SKOV3）、实验组1（SKOV3培养体系中仅加入5μg/mL Con A）、实验组2（SKOV3和淋巴细胞混合培养）和实验组3（SKOV3和淋巴细胞混合培养体系中加入5μg/mL Con A）。培养7d后将SKOV3分离出继续培养,并进行以下实验,在光学显微镜下观察细胞形态变化;CCK8检测24和48h细胞活性;流式细胞术检测24和48h细胞凋亡情况;用浓度0和60μmol/L顺铂处理SKOV3细胞24和48h后,流式细胞术检测细胞凋亡率以判断细胞对顺铂的敏感性。结果：与对照组比较,实验组1和实验组2中细胞无明显改变,而实验组3中SKOV3与淋巴细胞混合培养后发生明显改变,如细胞突起减少,细胞变圆。与对照组比较,实验组1中24和48h细胞存活率分别为（105.68±7.12）%（z=-1.256,P=0.30）和（111.90±8.28）%（z=-1.766,P=0.13）,实验组2分别为（101.05±5.92）%（z=-0.215,P=0.79）和（109.72±6.54）%（z=-1.766,P=0.13）,差异均无统计学意义;而实验组3分别为（25.08±7.71）%（z=-2.087,P=0.004）和（14.6±4.41）%（z=-3.431,P=0.001）,差异有统计学意义。与对照组比较,实验组1中24和48h细胞凋亡率分别为（4.43±1.49）%（z=-2.78,P=0.61）和（10.95±1.09）%（z=-1.982,P=0.08）,实验组2分别为（4.79±0.83）%（z=-1.349,P=0.28）和（10.59±1.03）%（z=-1.349,P=0.28）,差异均无统计学意义;实验组3分别为（13.88±1.00）%（z=-2.247,P=0.003）和（21.37±2.35）%（z=-2.137,P=0.006）,差异有统计学意义。顺铂处理各组SKOV3细胞后,与对照组比较,实验组1中24和48h细胞凋亡率分别为（11.25±1.86）%（z=-0.361,P=0.59）和（33.     

重组性融合蛋白TAT-OSBP-MKK6（E）对耐顺铂卵巢癌细胞增殖与侵袭转移的影响

目的 观察重组性融合蛋白TAT-OSBP-MKK6（E）对卵巢癌顺铂（DDP）耐药细胞株SKOV3／DDP增殖及侵袭转移的影响。方法 采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测SKOV3／DDP细胞经融合蛋白处理后的增殖抑制率及采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）后融合蛋白对DDP敏感性的影响,单丹磺酰尸胺染色法检测融合蛋白诱导的自噬情况,QPCR和Western blotting检测SKOV3／DDP细胞Beclin 1的表达情况,Transwell体外迁移和重组基底侵袭实验研究融合蛋白对SKOV3／DDP细胞的侵袭和迁移能力。结果 DDP对SKOV3／DDP细胞的半数抑制浓度（IC50）为（37.62±2.63）μg／ml,10、20、40 μg／ml 融合蛋白作用后,DDP的IC50分别降低至（17.07±0.88）、（11.08±0.57）和（1.96±0.31）μg／ml（P＜0.001）;以3-MA抑制细胞自噬,可阻断融合蛋白诱导SKOV3／DDP细胞对DDP的敏感性;SKOV3／DDP自噬情况的比较：融合蛋白组、融合蛋白+3 MA组的荧光强度分别为824±107、459±128,均高于对照组的306±143,差异有统计学意义（P＜0.05）。Beclin 1 mRNA和蛋白的表达水平随融合蛋白的浓度增加（10、20、40 μg/ml）,其表达水平升高,各浓度组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。空白对照组、DDP组、融合蛋白组和DDP+融合蛋白组中SKOV3／DDP细胞的Beclin 1蛋白表达亦不同,差异有统计学意义（P＜0.05）,其中DDP+融合蛋白组蛋白表达量最高,为0876±0023,其次为融合蛋白组的0.564±0.021。融合蛋白能明显抑制SKOV3／DDP细胞的侵袭和迁移能力,DDP+融合蛋白组和融合蛋白组分别与空白对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,DDP组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 融合蛋白可抑制SKOV3／DDP细胞的增殖、侵袭和转移,可能与诱导自噬及上调Beclin 1的表达有关。     

沉默二氢叶酸还原酶基因对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响

背景与目的：二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)在卵巢上皮癌铂类耐药细胞中高表达。该研究旨在探讨DHFR基因沉默对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响,为卵巢癌铂类耐药的治疗奠定基础。方法：设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA,筛选出最佳siRNA沉默片段,构建携带有目的基因的慢病毒载体细胞即转染组(DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞)及阴性对照组细胞(pGCSIL-SKOV3细胞)。采用流式细胞仪检测3组细胞在不同的顺铂质量浓度(2.5、5.0、10.0和20.0μg/mL)下不同时间段(24、48及72 h)的凋亡情况以及IC50顺铂质量浓度(4.4μg/mL)的周期变化;采用高效液相色谱法检测不同顺铂质量浓度(2.5、5.0和7.5μg/mL)不同时间段(24和48 h)药物作用后3组细胞内的顺铂浓度。采用透射电镜观察IC50顺铂质量浓度(4.4μg/mL)3种细胞的超微结构变化。结果：将退火后的双链寡核苷酸片段连接到pGCSIL/GFP载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,蛋白[质]印迹法(Western blot)鉴定干扰效果。在给药24、48和72 h后,DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3三组细胞的凋亡率随着顺铂质量浓度(2.5、5.0、10.0和20.0μg/mL)的上升而升高, DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞给药48和72 h后的凋亡率明显高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。3组细胞在IC50顺铂质量浓度(4.4μg/mL)给药24和48 h后,转染组G0/G1期细胞比例较阴性及空白对照组明显增多,G2/M、S期则反之;而给药72 h后,3组细胞以G2/M及S期为主,转染组低于阴性及空白对照组。采用高效液相法检测细胞内顺铂质量浓度时,转染组在2.5和5.0μg/mL顺铂质量浓度给药24和48 h后,其细胞内顺铂浓度均明显高于对照组。转染组在7.5μg/mL顺铂质量浓度给药24 h后,其细胞内顺铂浓度均明显低于对照组细胞,在48 h后却又高于对照组,差异有统计学意义(P=0.034,P=0.014)。未给药时,转染组细胞的微丝明显多于对照组,线粒体亦改变明显。IC50(4.4μg/mL)给药24和48 h后3组细胞均未见微丝;而给药72 h后微丝明显增多,且排列紊乱。结论：成功构建携带DHFR基因的pGCSIL干扰慢病毒载体的卵巢癌细胞。通过对DHFR下调后耐药性能研究得知,DHFR的下调与经过铂类药物作用的体外卵巢癌细胞的药物耐药性有一定的联系,卵巢癌细胞中下调DHFR基因可以考虑作为多药耐药的逆转机制。