人骨髓基质细胞在骨组织工程临床应用中的探讨

目的研究人骨髓基质干细胞经体外诱导表达成骨细胞表型,作为骨组织工程临床应用种子细胞的可行性。方法人骨髓中密度梯度法分离骨髓基质干细胞,诱导组予条件培养液,对照组予单纯DMEM培养液,分别培养至第3代细胞,计算各代倍增时间和3代总的扩增倍数,经相差显微镜观察,钙结节茜素红染色,四环素荧光,免疫荧光检测骨钙蛋白,成骨细胞转录因子RT-PCR检测Ⅰ型胶原,骨钙蛋白mRNA表达。结果诱导组骨髓基质干细胞(MSC)经体外诱导,三代平均扩增163.4倍后,形成钙结节,骨钙蛋白(OCN),成骨细胞转录因子(cbfa1)免疫荧光结果阳性,RT-PCR证实Ⅰ型胶原,骨钙蛋白mRNA的表达;对照组未能形成钙结节,无成骨细胞特征性蛋白OCN,cbfa1的表达。结论人MSC体外经条件培养液诱导培养三代后仍可表达成骨细胞表型,可以满足骨组织工程临床应用对种子细胞质和量的需要。     

大鼠骨髓基质干细胞的成骨诱导及鉴定

目的：研究大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）在体外培养、诱导后的形态学改变及生物活性．探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性。方法：通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠BMSCs，经条件培养液诱导培养后，进行形态学观察和碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）的测定。结果：经过体外成骨诱导的BMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征，同时在诱导2周后表达ALP活性，在结节期和矿化期OCN表达呈阳性。结论：体外成骨定向诱导的BMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

多孔碳酸钙陶瓷与干细胞源性成骨细胞的相容性

背景：国内外的研究证实普通碳酸钙陶瓷作为骨替代材料时具有细胞支架作用。目的：观察多孔碳酸钙陶瓷与成骨细胞的相容性,及作为骨组织工程支架的可能性。方法：SD大鼠骨髓基质干细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔碳酸钙陶瓷支架、普通羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养。结果与结论：骨髓基质干细胞经体外诱导形成成骨细胞,钙结节、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。多孔碳酸钙陶瓷支架材料与羟基磷灰石陶瓷材料皆有细胞附着生长,但多孔碳酸钙陶瓷支架材料细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于羟基磷灰石陶瓷材料。提示多孔碳酸钙陶瓷支架材料与SD大鼠骨髓基质干细胞源性成骨细胞有良好相容性。     

多孔碳酸钙陶瓷与干细胞源性成骨细胞的相容性

背景:国内外的研究证实普通碳酸钙陶瓷作为骨替代材料时具有细胞支架作用。目的:观察多孔碳酸钙陶瓷与成骨细胞的相容性,及作为骨组织工程支架的可能性。方法:SD大鼠骨髓基质干细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔碳酸钙陶瓷支架、普通羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养。结果与结论:骨髓基质干细胞经体外诱导形成成骨细胞,钙结节、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。多孔碳酸钙陶瓷支架材料与羟基磷灰石陶瓷材料皆有细胞附着生长,但多孔碳酸钙陶瓷支架材料细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于羟基磷灰石陶瓷材料。提示多孔碳酸钙陶瓷支架材料与SD大鼠骨髓基质干细胞源性成骨细胞有良好相容性。     

脐血来源的间充质干细胞生物学特性与向成骨细胞分化能力的研究

目的研究人脐血来源的间充质干细胞（UCBMSC）的免疫表型、生物学特性及其向成骨细胞分化的能力。方法分离脐血单个核细胞，以干细胞培养液培养间充质干细胞（MSC），观察其体外生长特性；用流式细胞术进行免疫表型测定和细胞周期分析；以含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的诱导液定向诱导向成骨细胞分化；以碱性磷酸酶染色、矿化结节染色、骨桥蛋白mRNA的表达以及I型胶原表达鉴定MSC向成骨细胞分化的潜能。结果从脐血中可以培养出MSC，为成纤维细胞样的贴壁细胞。免疫表型分析显示CD45、CD34、CD11a、CD14、HLA．DR阳性细胞占1％～3％；CD166、CD44、CD106、CD29、CD105、CD49e、CD90、CD73表达率达91％～98％。细胞周期分析显示95％以上的细胞处于G0／G1期。定向成骨细胞诱导后，可以检测到碱性磷酸酶、I型胶原的表达，矿化结节的形成和骨桥蛋白mRNA的表达。结论UCBMSC是基质细胞的祖细胞，在合适的条件下可被诱导向成骨细胞分化，因此有可能作为有潜力的骨组织工程的种子细胞来源。     

Transwell小室环境下兔成骨样细胞与骨髓基质干细胞的共培养及成骨分化

背景:以往在体外采用地塞米松、生长因子或用成骨样细胞与骨髓间充质干细胞按1∶1混合培养诱导成骨均存在种种局限。目的:观察在 Transwell小室环境下成骨样细胞与骨髓基质干细胞体外共培养及成骨样细胞定向诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的可行性。方法:取第 3代乳兔成骨样细胞与第3代兔骨髓基质干细胞接种共培养于Transwell小室内,成骨样细胞接种于培养板底层,骨髓基质干细胞接种于 Transwell膜内膜上作为实验组。以骨髓基质干细胞单独接种于Transwell 小室内,下层为基础培养液作为对照组。结果与结论:实验组共培养骨髓基质干细胞明显向成骨细胞分化,细胞碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P < 0.05)。实验组骨髓基质干细胞茜素红染色强阳性,可见呈红色结节,经PT-PCR扩增后,可见成骨启动基因核心结合因子α1的表达;对照组未见矿化结节。说明应用Transwell小室可实现成骨样细胞与骨髓基质干细胞体外共培养,并能定向诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化。     

兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及其对不同生长因子的反应

为了研究兔骨髓间充质干细胞（rBM—MSC）的生物学特征及其对不同生长因子的反应，使用贴壁培养法从兔骨髓单个核细胞中获得间充质干细胞（MSC），在光学显微镜和电子显微镜下观察其基本生长行为和生物学特征；使用流式细胞仪检测rBM—MSC的免疫学表型；RT—PCR法检测其胶原表达；诱导rBM—MSC多向分化并使用特异性染色和RT—PCR予以鉴定；最后使用MTT法检测IL—1、3、8和HGF对rBM—MSC生长增殖的影响。结果显示：贴壁生长的rBM—MSC具有典型的成纤维样细胞形态，可传15代以上，第5代rBM—MSC高表达基质受体CD44（32％），低表达造血细胞标记CD45（4．7％）；RT—PCR显示高表达Ⅰ型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达X型胶原；在不同的诱导条件下．rBM—MSC可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。rBM—MSC对IL-3最为敏感．10ng／ml的低浓度IL-3可显著促进细胞增殖达32％以上（P〈0．01），而高浓度IL-3能显著抑制其生长。结论：分离培养了rBM—MSC，其生物学特征与人和猕猴等BM—MSC相似的生物学特性，低浓度IL-3可有效促进其增殖。     

比较不同来源人成骨细胞的体外培养模式及其生物学特性

目的：建立不同来源人成骨细胞的体外培养模式，比较颅骨、骨膜、骨髓来源的成骨细胞的生物学特性。 方法：实验于2002-9／2004—3在东南大学修复重建外科研究所完成。①从人4个月龄胚胎骨膜、颅骨及骨髓组织中分离培养出骨膜来源的成骨细胞，颅骨来源的成骨细胞和骨髓基质干细胞并对骨髓基质干细胞进行成骨诱导培养。②体外动态观察细胞的生长情况和形态学变化，用第2-4代细胞进行细胞鉴定和生物学特性的比较。③通过相差显微镜，Giemsa染色及透射电镜观察比较细胞的形态和超微结构，通过生长曲线，比较细胞的增殖能力。经碱性磷酸酶染色和钙结节染色比较细胞的成骨活性，并经X射线能量散射分析鉴定钙结节的元素成分。 结果：培养的颅骨、骨膜来源的成骨细胞和在诱导培养下的骨髓基质干细胞具有成骨细胞的形态、生长及功能特点。骨膜、颅骨来源的成骨细胞以功能态为主，骨髓基质干细胞以增殖态为主。①体外增殖结果：3种细胞的增殖能力依次为：骨髓基质干细胞、颅骨来源成骨细胞、骨膜来源的成骨细胞。②形态学观察：第3代后3种细胞在形态上无明显的差别，在超微结构上骨膜来源的成骨细胞和颅骨来源的成骨细胞为高分化细胞，骨髓基质干细胞为低分化细胞。③成骨功能表达：骨膜来源成骨细胞第15天，颅骨来源成骨细胞第17天光镜下可见褐色的钙化结节形成，骨髓基质干细胞在诱导液条件下培养24d时可见褐色结节：矿化结节X射线能量散射分析，其Ga／P元素含量比值，骨膜来源成骨细胞为2．16&;#177;0．17，颅骨来源成骨细胞为2．39&;#177;0．21，骨髓基质干细胞为2．57&;#177;0．15；骨膜来源成骨细胞的碱性磷酸酶染色阳性率为95．2％，颅骨来源成骨细胞为89．6％。骨髓基质干细胞（诱导后）为69．0％。骨髓基质干细胞（未诱导）碱性磷酸酶染色阴性。3种不同来源的人成骨细胞成骨能力依次为：骨膜来源的成骨细胞、颅骨来源成骨细胞、骨髓基质干细胞。 结论：采用改良的酶消化法，培养骨、骨膜来源的成骨细胞，通过加以改进的密度梯度离心法，培养骨髓基质干细胞，可得到均一性好，活性强的3种不同来源的人成骨细胞。     

非诱导条件下犬骨髓基质干细胞的生物特性

背景：种子细胞的研究是组织工程众多研究领域中最重要的基础环节，骨髓基质干细胞以其诸多优点。成为理想的骨组织工程的种子细胞。 目的：观察骨髓基质干细胞在体外培养的生长特点和非诱导条件下的成骨特性。 设计：单一样本实验。单位：福建医科大学附属口腔医院种植中心。 材料：实验于2003-05／12在福建医科大学附属口腔医院中心实验室完成。骨髓基质干细胞来自4只1岁龄的杂交犬的原代～第3代传代细胞。 方法：无菌条件下在杂交犬两侧股骨大转子部做骨髓穿刺，抽取5mL肝素抗凝的骨髓，加入到含有50mL含双抗Dulbeeco’s改良的Eagle＇s培养液的离心管中分离单个核细胞，进行首次提纯获取骨髓基质干细胞单细胞，置培养箱中培养传代，培养48h后，吸除培养液，以后每3天换液1次。继续传代。采用倒置相差显微镜及苏木精一伊红染色观察骨髓基质干细胞形态；每天进行细胞计数，测定倍增时间，绘生长曲线；用钙钴法检测碱性磷酸酶；用茜素红法染色观察钙化结节生长情况。 主要观察指标：①犬骨髓基质干细胞光镜结构。②犬骨髓基质干细胞生长曲线。③成骨分化指标碱性磷酸酶及钙化结节的观察。 结果：①形态学观察表明，骨髓基质干细胞贴壁细胞呈集落生长。有成纤维样细胞外观，未加入成骨诱导剂，细胞形态发生变化。②碱性磷酸酶表达原代细胞呈强阳性，第1代细胞呈阳性，第2，3代细胞呈弱阳性。③钙沉积出现，原代细胞染色强于传代细胞。 结论：①骨髓基质干细胞在体外培养能大量扩增，具有自然向成骨细胞分化的能力，是骨组织工程理想的种子细胞。②3代内扩增的骨髓基质干细胞有成骨活性，但原代细胞传代活性优于传代后细胞。     

体外培养兔骨髓基质干细胞复合β-磷酸三钙的肌内成骨能力观察

目的：观察体外成骨诱导培养液条件下骨髓基质干细胞与细胞支架β-磷酸三钙体外复合培养后的成骨活性，以验证兔骨髓基质干细胞在体外向成骨细胞转化的能力，并进行对照比较。方法：实验于2003-10／2004-02在解放军第二军医大学长征医院骨科实验室完成。取健康成年新西兰大白兔7只，将抽取的骨髓置于加入地塞米松、β-甘油磷酸钠及维生素C的DMEM标准培养液中培养。对获得的兔骨髓基质干细胞以倒置显微镜、透射电镜、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色等手段进行生长状态观察及生物学特性鉴定。然后将骨髓基质干细胞与β-磷酸三钙体外复合培养1周后自体回植兔肌肉内，分别在4周和8周后取材，观察其成骨能力以组织学方法检测，并与未复合的β-磷酸三钙的细胞做自身对照比较。结果：实验选取的7只兔全部进入结果分析。①细胞的生长状况及形态特征：细胞全骨髓法培养24～48h，细胞开始贴壁，呈短梭形，贴壁细胞呈成纤维细胞集落方式生长。细胞培养5～7d，细胞集落生长逐渐密集，细胞体积逐渐增大，向长梭形转变，部分细胞呈多角形。②细胞生长曲线：传至第3代细胞，1～3d细胞增殖缓慢，为潜伏期，3～5d后细胞大量扩增，6d后细胞达到顶点进入平台期。第1，2，4代细胞的生长曲线基本与第3代相似。③细胞贴壁率：各代细胞的贴壁率未见明显差异，一般2h开始贴壁，2～8h前贴壁率增加较快，8～14h贴壁率达80％～90％。④细胞分裂指数：细胞早期分裂较慢，培养5～8d分裂指数最高，可达10％～15％。表现为胞核增大，双核增多。1～4代核分裂率基本相似。⑤细胞超微结构观察。结果：培养至第2代．骨髓基质干细胞透射电镜下细胞内开始出现大量胶原。⑥血清碱性磷酸酶检测结果：骨髓基质干细胞染色后，血清碱性磷酸酶显示红棕色沉淀，细胞密集区颜色较深。第3代细胞血清碱性磷酸酶染色阳性率可达85％以上。⑦细胞免疫组化Ⅰ型胶原检测结果：各代细胞Ⅰ型胶原免疫组化染色均为阳性．胞浆呈红棕色。⑧肌内成骨活性观察：骨髓基质干细胞／β-磷酸三钙复合物植入体内4周，可见新生骨样基质。8周后新生骨量明显增多，可见典型的骨组织结构。而未复合细胞的人工骨孔隙内仅见大量纤维结缔组织，体内培养4周及10周时均未见骨组织形成。结论：体外培养条件下，骨髓基质干细胞在条件培养液中具有与成骨细胞相似的形态特征、生长特点和功能性表现，短期内可以获得大量具有成骨能力的细胞。复合β-磷酸三钙载体后，出现异位成骨现象，为临床骨组织工程技术的研究提供了理论依据和参数。     

成人骨髓源成骨细胞体外培养条件下的生物学特性

背景：骨髓基质干细胞作为种子细胞构建组织工程化骨组织，具有广泛的应用前景，可作为首选的骨组织工程种子细胞来源。尽管目前对于动物骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化的研究已不断深入，但对于成人骨髓基质干细胞大量诱导分化为成骨细胞的研究尚处于探索阶段。目的：研究成人骨髓基质干细胞在体外培养条件下的生物学特性及成骨能力，探讨简便易行的成人成骨细胞体外培养方法，为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。设计：采用完全随机实验对照单盲设计进行横断面研究。地点和对象：实验在解放军第一军医大学南方医院全军创伤骨科中心完成，对象为健康成年志愿者骨髓组织。干预：抽取骨髓组织，在100mL／L胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃，50mL／L CO2湿化空气孵箱中培养，传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养，用倒置相差显微镜、光镜(HE染色)、扫描与透射电镜观察细胞的形态特征和增殖分化情况，并测定培养细胞的生长曲线(MTT法)、碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力。主要观察指标：形态学观察和生物学特性检测。结果：原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力，诱导培养2周后，细胞呈多角形或梭形，具有多个突起可互相联结，透射电镜下观察细胞核较为幼稚，细胞器丰富。诱导分化后的细胞可分泌碱性磷酸酶，改良钙钴法染色阳性率可达74．2％，并可形成钙结节，具有与典型的成骨细胞相似的形态特征及生物学功能。结论：成人骨髓基质干细胞取材安全方便，易于诱导分化为成骨细胞；本实验方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

老年人股骨近端骨髓基质干细胞成骨分化功能的研究

目的：通过对来自干全髋置换术中的股骨近端骨髓基质干细胞生物特性尤其是成骨分化潜能的研究，以期为将其应用于骨、软骨损伤修复和老年人骨关节疾患发病机理的研究提供细胞生物学依据。方法：运用 Ficoll密度梯度离心分离得到骨髓基质干细胞。分别在含10％FBS的LG—DMEM和含10％FBS的DMEM（10^-8M地塞米松，50μg／ml维生素C，10mMβ-甘油磷酸钠）中培养。用Von Kossa染色、四环素荧光染色证实特征性骨结节的形成，用ALP染色来区分MSC中向成骨细胞分化的细胞，收集处于不同分化时期的细胞和上清液，应用PNPP法测定碱性磷酸酶活性、放免法检测骨钙素活性，RT—PCR检测骨髓基质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化的基因的表达情况。结果：股骨近端来源的骨髓基质干细胞增殖迅速，在成骨诱导液中表现出更强的成骨分化能力。培养至13天时，ALP染色强阳性；普通培养液中培养至35天时，相差显微镜下可见细胞结节形成，继续培养则形成肉眼可见结节，直径达1mm。经Van Kossa染色、四环素荧光标记进一步证实为钙盐沉积、特征性骨结节。随着细胞诱导时间的延长，碱性磷酸酶活性逐渐增强，至12天时活性最大；骨钙素活性也是逐渐增强，至15天时最大。骨髓基质干细胞在诱导条件下，成骨细胞和脂肪细胞的特异性基因在mRNA水平没有明显随着诱导时间变化。结论：股骨近端来源的骨髓基质干细胞取材方便、在体外培养增殖迅速，在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠诱导下细胞向成骨细胞的分化能力增强，和正常成人髂骨来源的骨髓基质干细胞成骨分化时相一致。为股骨近端骨髓基质干细胞的进一步应用提供了细胞生物学依据。     

成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的：研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法：从骨髓血中提取hMSCs,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养,以流式细胞仪检测hMSCs的表面抗原表达.传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养,相差显微镜观察并绘制生长曲线.免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素.NAP法碱性磷酸酶染色、vonKossa法钙结节染色.结果：hMSCs增殖活跃,CD105、CD44表达阳性, CD14、CD34和CD45阴性.诱导培养后碱性磷酸酶、钙结节、Ⅰ型胶原和骨钙素染色阳性.结论：hMSCs取材方便,易诱导分化为成骨细胞,是研究骨组织工程的理想种子细胞.[     

全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨的定向诱导及鉴定

背景:许多分离纯化骨髓间充质干细胞操作繁琐、费用昂贵,且对细胞的活性影响较大,许多研究都致力于寻找有效且价格低廉的培养鉴定方法。目的:采用全骨髓贴壁培养法对大鼠骨髓间充质干细胞经体外进行成骨诱导和分化,并进行细胞鉴定。设计:观察对比实验。单位:青岛大学医学院。材料:实验于2005-11/2007-03在青岛大学医学院口腔研究室及分子生物学实验室完成,选用20只生后三四周Wistar大鼠,SPF级,雌雄不拘,体质量120～150g,由青岛市实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。胎牛血清购自杭州四季清生物技术有限公司,碱性磷酸酶检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,逆转录试剂盒为PROMEGA产品,引物由上海生工公司合成。方法:采用全骨髓培养法分离培养成年大鼠骨髓间充质干细胞,用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后分瓶,以5×10~7L~(-1)的密度接种于6孔培养板,诱导分化组加入诱导分化培养液,对照组加入等量基础培养液培养。①倒置相差显微镜观察细胞诱导分化结果及钙结节形成情况。②采用钙结节Von Kossa染色、钙结节茜素红染色进行诱导后细胞的生物学特性检测。③采用重氮盐法染色观察碱性磷酸酶活性。④RT-PCR检测细胞内成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。主要观察指标:①细胞诱导分化结果。②大鼠骨髓间充质干细胞诱导后细胞的生物学特性。③碱性磷酸酶活性。④成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。结果:①诱导分化组加入诱导分化培养液后,9d后开始密集重叠生长,21～28d出现较多散在的致密圆形矿化结节。对照组细胞虽密集重叠生长,但不形成矿化结节。②诱导分化组成骨诱导21～28d形成明显的圆形或卵圆形肉眼可见的钙化结节。Von Kossa染色为黑色沉淀,茜素红染色为橙红色结节状,对照组未见钙结节形成。③诱导分化组诱导2周细胞碱性磷酸酶活性明显增高,对照组活性较弱。④诱导分化组经诱导后成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达均较强。结论:大鼠的骨髓间充质干细胞经全骨髓培养法体外诱导和分化,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。     

人骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的形态学研究

目的：研究人骨髓间质干细胞(hMSCs)体外培养并向成骨细胞表型转化过程中的形态学改变。方法：在成骨特定诱导培养液中培hMSCs。在相差显微镜和电子显微镜下观察细胞形态，苏木精-伊红染色观察形态，组织化学法检测碱性磷酸酶(ATP)、Ca结节染色．免疫组化检测Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)、骨钙素(OC)表达。结果：诱导培养的hMSCs形态由成纤维样梭形向多边形转变，透射电镜观察见大量扩张的粗面内质网、高尔基体、线粒体和钙盐沉积，扫描电镜见细胞表面有大量钙盐颗粒。诱导培养后7，14，2ld可见ALP染色、COL Ⅰ免疫组化染色阳性，诱导培养后14，21d可见OC免疫组化染色、Ca结节染色阳性。结论：hMSCs在特定培养液诱导下可表现为典型的成骨细胞形态，可作为骨组织工程的种子细胞。     

比较不同来源人成骨细胞的体外培养模式及其生物学特性

目的:建立不同来源人成骨细胞的体外培养模式,比较颅骨、骨膜、骨髓来源的成骨细胞的生物学特性。方法:实验于2002-9/2004-3在东南大学修复重建外科研究所完成。①从人4个月龄胚胎骨膜、颅骨及骨髓组织中分离培养出骨膜来源的成骨细胞,颅骨来源的成骨细胞和骨髓基质干细胞并对骨髓基质干细胞进行成骨诱导培养。②体外动态观察细胞的生长情况和形态学变化,用第2～4代细胞进行细胞鉴定和生物学特性的比较。③通过相差显微镜,Giemsa染色及透射电镜观察比较细胞的形态和超微结构,通过生长曲线,比较细胞的增殖能力。经碱性磷酸酶染色和钙结节染色比较细胞的成骨活性,并经X射线能量散射分析鉴定钙结节的元素成分。结果:培养的颅骨、骨膜来源的成骨细胞和在诱导培养下的骨髓基质干细胞具有成骨细胞的形态、生长及功能特点。骨膜、颅骨来源的成骨细胞以功能态为主,骨髓基质干细胞以增殖态为主。①体外增殖结果:3种细胞的增殖能力依次为:骨髓基质干细胞、颅骨来源成骨细胞、骨膜来源的成骨细胞。②形态学观察:第3代后3种细胞在形态上无明显的差别,在超微结构上骨膜来源的成骨细胞和颅骨来源的成骨细胞为高分化细胞,骨髓基质干细胞为低分化细胞。③成骨功能表达:骨膜来源成骨细胞第15天,颅骨来源成骨细胞第17天光镜下可见褐色的钙化结节形成,骨髓基质干细胞在诱导液条件下培养24d时可见褐色结节;矿化结节X射线能量散射分析,其Ga/P元素含量比值,骨膜来源成骨细胞为2.16±0.17,颅骨来源成骨细胞为2.39±0.21,骨髓基质干细胞为2.57±0.15;骨膜来源成骨细胞的碱性磷酸酶染色阳性率为95.2%,颅骨来源成骨细胞为89.6%,骨髓基质干细胞(诱导后)为69.0%。骨髓基质干细胞(未诱导)碱性磷酸酶染色阴性。3种不同来源的人成骨细胞成骨能力依次为:骨膜来源的成骨细胞、颅骨来源成骨细胞、骨髓基质干细胞。结论:采用改良的酶消化法,培养骨、骨膜来源的成骨细胞,通过加以改进的密度梯度离心法,培养骨髓基质干细胞,可得到均一性好,活性强的3种不同来源的人成骨细胞。     

骨髓间质干细胞体外分化软骨细胞的实验研究

目的：应用转化型生长因子TGF-β1，体外诱导骨髓间质干细胞（MSCs）向成软骨细胞表型分化，探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法：由大鼠骨髓中分离出MSCs，体外传代培养，取第3代细胞通过TGF-β1、地塞米松和维生素C诱导向软骨细胞分化。诱导后14d观察细胞形态变化，进行阿辛蓝染色检测软骨基质的分泌、免疫组化检测细胞Ⅱ型胶原的表达。采用Western-blot和RT-PCR检测诱导前后成软骨相关的SOX9、蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的表达。结果：诱导后阿辛蓝染色示糖胺聚糖均匀分布于基质中，免疫组化染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性。RT-PCR检测示成软骨相关的SOX9、蛋白聚糖、Ⅱ型腔原mRNA表达阳性。Western-blot印迹检测示细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性。结论：MSCs在特定培养液的诱导下可向软骨细胞表型分化．并能分泌软骨细胞特异性基质．可成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。     

大鼠骨髓基质干细胞的培养鉴定及向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的研究体外培养大鼠骨髓基质于细胞的方法及其生长特点和成骨能力。方法通过贴壁培养法和密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞，应用含维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化，检测碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。结果原代培养基质干细胞首先形成细胞集落，14d时集落间接近融合；传代细胞体积变大，约5～7d传代一次。诱导条件下，细胞碱性磷酸酶活性明显增高，并出现了矿化结节。结论骨髓基质干细胞易于体外分离培养及扩增，成骨能力较强，可作为骨组织工程的种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化

目的诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，将其分为对照组和诱导组两组。诱导组加入地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸，诱导成骨。采用免疫荧光染色的方法检测碱性磷酸酶（AKP）和骨桥蛋白（0PN）的表达；并通过RT-PCR检测骨桥蛋白mRNA的表达；利用硝酸银染色和茜素红染色两种特殊染色方法检测钙盐沉积。结果经诱导，诱导组细胞在呈典型的成骨细胞形态并有钙结节形成；免疫荧光染色结果显示诱导组细胞AKP和OPN均为强阳性表达，RT-PCR结果也显示诱导组细胞骨桥蛋白mRNA表达；两种特殊染色结果显示诱导组细胞有大量的钙盐沉积。而对照组细胞无上述形态改变和表达。结论人骨髓间充质干细胞在一定的诱导条件下能向成骨细胞分化。     

兔骨髓基质干细胞诱导为骨髓源成骨细胞的时间及功能特征

目的：观察经体外培养、扩增后的兔骨髓基质干细胞，应用诱导剂促使其转化为功能活跃的成骨细胞的功能及其时间特征。 方法：实验于2004-03／10在为哈尔滨医科大学第一临床医学院实验中心进行。实验动物选择36只日本大耳白兔，均由胫骨髓腔抽取骨髓，每只抽取量为2．0mL，抗凝，将其加入淋巴细胞分离液，密度梯度离心，取有核细胞层，加入DMEM培养液进行贴壁培养、传代，取生长状态良好的第3代骨髓基质干细胞，以适量的地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸作为诱导剂进行诱导，使其向成骨细胞转化，并通过倒置相差显微镜、透射电镜分别对细胞的形态、细胞的内部显微结构进行观察，并应用反转录-聚合酶链反应方法检测其分泌的碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原。 结果：原代骨髓基质干细胞于24-48h开始贴壁，细胞形态为长梭形，核小，呈椭圆形，核浆比例小，三四天细胞集落形成，逐渐增大，2周时集落边缘融合，细胞呈单层旋涡状分布，形态均一。传代培养的骨髓基质干细胞于24h内开始贴壁，均匀生长，体积大，无集落形成，细胞排列规则。骨髓基质干细胞在加入诱导剂3d后其形态逐渐由长梭形转变为短梭形，1周后变为多角形或鳞片形，其胞体、细胞核和核浆比例逐渐增大；诱导的细胞细胞器不发达，为低分化细胞，突起内见丰富的粗面内质网；在诱导1周后，细胞开始分泌碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原。碱性磷酸酶扩增产物长度为408bp，Ⅰ型胶原扩增产物长度为206bp。 结论：兔骨髓基质干细胞在加入诱导剂1周后，细胞开始分泌碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原，并形成钙结节，细胞功能状态良好，说明诱导1周后骨髓基质干细胞已成功向成骨细胞转化，并形成为功能活跃的骨髓源成骨细胞，是与支架材料构建组织工程骨的最佳时机。