富含血小板血浆凝胶结构用于组织工程载体可能性的扫描电镜观察

目的:富含血小板血浆中含有较高浓度的生长因子,对骨的再生和修复都有一定的促进作用。通过大体和扫描电镜两种方法观察富含血小板血浆凝胶的结构,探索其用于组织工程载体的可能性。方法:实验于2004-01/03在第四军医大学口腔医学院动物中心完成。①制备牛凝血酶溶液:作为使富含血小板血浆结固成凝胶的催化剂。②制备富含血小板血浆液:将清洁级新西兰兔4只,解剖颈内静脉,抽取静脉血10mL,离心后将红细胞与血浆分离,再将血浆离心,使富含血小板血浆与乏血小板血浆分开,得到富含血小板血浆。③制备富含血小板血浆凝胶:将富含血小板血浆与牛凝血酶溶液按体积比6∶1充分混合为凝胶。④冻干及观察:将富含血小板血浆凝胶冻干,进行大体观察和扫描电子显微镜检查。结果:①富含血小板血浆凝胶大体观察结果:可见大量的纤维彼此细密交织。②富含血小板血浆凝胶扫描电子显微镜观察结果:材料内大量的纤维交织,形成支架,其间含有大量的孔隙,孔隙彼此相通,孔径为200～1000μm,孔隙率80%。结论:富含血小板血浆凝胶呈典型的多孔性结构,孔径大小、孔隙率均比较符合骨组织工程支架材料的要求,而且又含有丰富的、对成骨有利的生长因子,提示富含血小板血浆可用作骨组织工程支架材料。     

富含血小板血浆凝胶的超微结构

目的观察富含血小板血浆(PRP)凝胶的超微结构。方法采用二次离心法制备PRP,分别计数全血和PRP血小板,用酶联免疫吸附法测定全血和PRP凝胶中转移生长因子(TGF)-β1及血小板源性生长因子(PDGF)-AB的浓度;同时,对PRP凝胶行大体观察、HE染色、透射及扫描电镜观察。结果 PRP中的血小板浓度达到全血的4.58倍;PRP凝胶中含有高浓度的TGF-β1、PDGF-AB;扫描电镜及透射电镜观察均显示PRP凝胶主要由大量纤维蛋白网和血小板构成。结论 PRP可能是构建可注射组织工程髓核的理想支架材料。     

不同抗凝剂和激活剂联合应用对富血小板血浆凝胶释放生长因子影响的比较

背景:富血小板血浆凝胶生物效应的发挥受多种因素的影响,如富血小板血浆制备的方法、血小板的完整性、抗凝剂及激活剂的选择等.目的:比较不同抗凝剂与激活剂联合应用对富血小板血浆凝胶释放生长因子影响的差异.方法:抽取新西兰兔全血制备富血小板血浆,再用牛凝血酶和Ⅰ型胶原激活,实验共分4组:依地酸钠钙-凝血酶组,依地酸钠钙-Ⅰ型胶原组,肝素-凝血酶组,肝素-Ⅰ型胶原组.分别计数各组富血小板血浆血小板数目.在激活富小板血浆后2 h,1 d,3 d,5 d使用酶联免疫吸附法测定空白对照组(全血)和各组富血小板血浆凝胶中转化生长因子β1及血小板源性生长因子AB的浓度,比较各组间2种生长因子释放方式和浓度的差异.结果与结论:依地酸钠钙-Ⅰ型胶原组合制备的富血小板血浆凝胶中转化生长因子β1和血小板源性生长因子AB累积释放量最大(P < 0.05);使用Ⅰ型胶原作为激活剂的富血小板血浆凝胶中上述2种生长因子的释放方式均为持续缓慢,并且转化生长因子β1的释放与激活时间呈正相关关系(r=0.873);而凝血酶激活的富血小板血浆凝胶释放生长因子的速度则较为快速(P > 0.05).结果证实,依地酸钠钙与Ⅰ型胶原制备的富血小板血浆凝胶所释放生长因子的浓度较大.     

富血小板凝胶制备方法的比较与优选

背景：富血小板凝胶含有多种细胞生长因子,对于局部创伤及骨缺损的修复具有非常重要的作用。富血小板凝胶作为组织工程的支架的研究越来越多,但是对于其最优化的制备方法目前尚无统一标准。 目的：简要综述近年来富血小板凝胶所含生长因子及制备方法的相关研究,总结多种富血小板凝胶的制备方法并进行比较,以此找出较为优化的制备方法。 方法：以＂富血小板血浆,富血小板凝胶,组织工程＂为检索词检索中国期刊全文数据库（1980年1月至2013年1月）,以＂Platelet-rich plasma,Platelet-rich plasma gel,Tissue Engineering＂为检索词检索PubMed数据库（1980年1月至2013年1月）,纳入与富血小板凝胶检测及制备方法相关的研究,排除不相关学科及内容的研究,检索得到322篇相关文献,筛选后最终纳入67篇。 结果与结论：目前富血小板凝胶的多种制备方法都存在各自的优势,不能单纯凭借某一项数据断定何种制备方法最好,需根据不同需要确定使用不同的方法。随着富血小板凝胶研究的不断深入,将会对创伤及骨缺损的临床修复以及组织工程研究起到至关重要的作用,也是未来组织工程支架研究的重要方向。     

跖筋膜炎病理力学概念及治疗：富含血小板血浆治疗的前景

背景：跖筋膜炎作为跟痛症的重要病因,各级医疗机构治疗方法不尽相同,治疗效果也出入较大。
　　目的：总结跖筋膜的各种治疗,结合跖筋膜炎的发病机制及病理力学,探讨各种治疗方法的效果及适应证。方法：检索PubMed数据库、中国科技期刊数据库(万方)1993年1月至2014年1月有关跖筋膜炎的相关研究。英文关键词为“Plantar fasci tis,Mechanism,Treatment”;中文关键词为“跖筋膜炎;机制;治疗”。阅读标题及进行筛查,保留其中34篇归纳总结。
　　结果与结论：跖筋膜炎的治疗需遵循无创到有创的原则,核心的理念为跖筋膜特殊牵引治疗、矫形器及夜间夹板的固定。对于急性期的患者,如果能够接受激素治疗带来的不良反应,局部注射激素可以作为一线治疗。富含血小板血浆注射治疗的前景看似美好,但现在还缺少大量的实验证据。对于反复发作的慢性顽固性跖筋膜炎,可以考虑体外震波治疗。手术治疗需严格筛选,因为它并不能缓解所有患者的疼痛,这是治疗跖筋膜炎的最后一道防线。     

自体富含血小板血浆对兔骨折愈合的影响

背景：研究表明富含血小板血浆常通过同源异体制备,可应用于促进扁骨和松质骨的骨折愈合。目的：用Landsbergs法制备自体富含血小板血浆,观察其对兔桡骨骨折愈合影响。方法：将新西兰兔随机分成富含血小板血浆组和对照组,分别建立桡骨中下1/3处骨折模型,富含血小板血浆组中加入制备的自体富含血小板血浆凝胶,对照组建立骨折模型后直接缝合。采用Landsbergs法制备自体富含血小板血浆,并植入富含血小板血浆组的骨折端,并行骨折断端石膏外固定。结果与结论：兔骨折标本在建模后1,2,4,6周均有不同程度骨痂形成。富含血小板血浆组在建模后第4周X射线进行影像学评分明显高于对照组（P〈0.05）。免疫组织化学检测显示：富含血小板血浆组Ⅰ型胶原量明显的高于对照组（P〈0.05）,可持续4周左右。结果证实,富含血小板血浆可通过增加骨痂中骨岛量和加速Ⅰ型胶原合成而明显促进长骨骨折愈合。     

自体富含血小板血浆对兔骨折愈合的影响

背景:研究表明富含血小板血浆常通过同源异体制备,可应用于促进扁骨和松质骨的骨折愈合。目的:用Landsbergs法制备自体富含血小板血浆,观察其对兔桡骨骨折愈合影响。方法:将新西兰兔随机分成富含血小板血浆组和对照组,分别建立桡骨中下1/3处骨折模型,富含血小板血浆组中加入制备的自体富含血小板血浆凝胶,对照组建立骨折模型后直接缝合。采用Landsbergs法制备自体富含血小板血浆,并植入富含血小板血浆组的骨折端,并行骨折断端石膏外固定。结果与结论:兔骨折标本在建模后1,2,4,6周均有不同程度骨痂形成。富含血小板血浆组在建模后第4周X射线进行影像学评分明显高于对照组(P<0.05)。免疫组织化学检测显示:富含血小板血浆组Ⅰ型胶原量明显的高于对照组(P<0.05),可持续4周左右。结果证实,富含血小板血浆可通过增加骨痂中骨岛量和加速Ⅰ型胶原合成而明显促进长骨骨折愈合。     

组织工程支架材料三维多孔聚乙烯醇水凝胶的制备

目的:制备组织工程支架材料,使其内部具有三维多孔结构,以种植和培养细胞。方法:利用氯化钠在二甲基亚砜/水溶液中的溶解度很小的特点,在聚乙烯醇的二甲基亚砜/水溶液中加入不同量的氯化钠颗粒,搅拌均匀而后迅速冷冻,待聚乙烯醇的二甲基亚砜/水凝胶形成后,将凝胶置于蒸馏水中1周,从而将该凝胶中的二甲基亚砜置换出并且溶出氯化钠,由此得到具有三维多孔结构的聚乙烯醇水凝胶。结果:①聚乙烯醇水凝胶的力学性能包括断裂强度,断裂伸长率,弹性模量等和制孔前相比基本没有变化,仍然符合作为组织工程支架材料的要求。②干燥速率随着孔隙率的增大先是降低后又上升。③水凝胶内部可以清晰地观察到三维孔隙结构,孔隙的大小符合作为组织工程支架材料的要求。结论:实验经过改进工艺方法,得到了具有三维多孔性的聚乙烯醇复合水凝胶。     

扫描电镜观察组织工程神经支架与骨髓间充质干细胞的共同培养

目的:扫描电镜观察骨髓间充质干细胞在组织工程神经支架中生长、附着状态,探讨骨髓间充质干细胞与该支架细胞的亲合性。方法:实验于2006-02/2006-12在中国医科大学神经解剖研究室完成。实验材料:180～200g成年清洁级健康雄性wistar大鼠,用于制备无细胞神经移植物,100～120g成年清洁级健康雄性wistar大鼠,用于制备骨髓间充质干细胞,均由中国医科大学实验动物部提供(SCXK(辽)2003-0009)。实验方法:①无细胞神经移植物的制备:参考刘承吉等组织工程化天然神经支架制备方法制备无细胞神经移植物。②骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定:无菌条件下分离wistar大鼠股骨、胫骨,用低糖DMEM培养液反复冲洗骨髓腔,收集冲洗液,1000r/min4℃离心10min,去上清液,DMEM培养液重悬细胞,置于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱内培养,24h半量换液,48h全量换液,每二三天换液1次,5～7d后达到80%融合,0.25%胰酶消化,离心,按1∶2传代培养,留取3代备用。采用免疫组织化学染色法鉴定。③骨髓间充质干细胞植入并与无细胞神经支架联合培养:手术显微镜下将1×107L-1骨髓间充质干细胞多点注入无细胞神经支架内,见支架膨胀隆起后,将支架重新放入培养液内培养7d。④实验评估:将制备的无细胞神经移植物横断面进行扫描电镜观察,骨髓间充质干细胞接种于支架上混合培养7d后,对移植物支架进行扫描电镜观察。结果:①免疫组织化学法鉴定骨髓间充质干细胞:培养的细胞不表达CD34、CD14,表达CD44、CD29,说明实验中分离、培养的细胞不是造血干细胞而是骨髓间充质干细胞。②扫描电镜观察无细胞神经移植物与移植物支架:无细胞异体神经支架在扫描电镜下见正常神经的髓鞘、轴突均消失,仅剩下空虚呈网格状的施万细胞基底膜管。联合培养7d后骨髓间充质干细胞在基底膜管内均匀分布,在管腔内贴附生长,细胞呈椭圆形或多突起形。骨髓间充质干细胞在该支架内均匀分布,并伸出伪足贴附于该支架内。结论:骨髓间充质干细胞在组织工程神经支架内生长良好,形态正常,并伸出伪足与管壁粘连紧密,该支架对骨髓间充质干细胞具有良好的细胞亲合性。     

脂肪干细胞与自体富血小板血浆载体复合物体内构建血管化组织工程脂肪

背景：血运重建机制是组织工程化脂肪组织成功构建的决定性因素。目的：观察脂肪干细胞与自体富血小板血浆和纤维蛋白胶载体复合物在体内构建血管化组织工程脂肪的可行性。方法：从健康成年人吸脂术后的脂肪组织中分离脂肪干细胞并行原代及传代培养,将第3代经BrdU标记的脂肪十细胞向脂肪细胞定向诱导2周后,制成浓度为5×10^10L^-1。细胞悬液。由0．5mL细胞悬液、100μL富血小板血浆工作液或DMEM培养基与0.5mL纤维蛋白胶组成实验组和对照组移植物,分别植入裸鼠背部皮下。结果与结论：植入后8周取材：①实验组可见血管明显增生并长入材料,呈轻度纤维包裹;列照组有少量血管长入材料中,也有轻度纤维包裹现象。实验组新生组织湿质量大予对照组（P〈0．01）。②苏木精一伊红染色均可见移植物中有新生脂肪组织形成和不同程度的微血管长入;实验组微血管数多于对照组（P〈0．01）。⑧新生组织免疫荧光染色示,两组新生脂肪细胞的胞核及部分微血管内皮细胞的胞核呈现绿色荧光。说明脂肪干细胞与自体富血小板血浆和纤维蛋白胶载体复合物在体内可构建血管化组织工程脂肪,脂肪于细胞与自体富血小板血浆共同参与新生脂肪组织的血管化过程,自体富血小板血浆能促进组织工程构建物的血运重建,保证更多种子细胞的成活。     

纤维蛋白在组织工程载体构建方面的应用

随着组织工程领域研究热潮的不断兴起，越来越多的生物材料正作为细胞、生物活性物质的载体而发挥作用，选择一合适的生物材料以作为载体是核心问题。纤维蛋白因具有良好的生物学功能和理化性质等一系列优点而被广泛应用，涉及面涵盖支架载体、复合载体以及释放载体，同时载体构建的技术水平与日俱增。文章就纤维蛋白的起源、结构、生物学功能、在组织工程中作为载体的研究进展作一综述，为纤维蛋白在组织工程中的发展提供理论依据。     

Phase-gradient contrast in thick tissue with a scanning microscope

It is well known that the principle of reciprocity is valid for light traveling even through scattering or absorptive media. This principle has been used to establish an equivalence between conventional widefield microscopes and scanning microscopes. We make use of this principle to introduce a scanning version of oblique back-illumination microscopy, or sOBM. This technique provides sub-surface phase-gradient and amplitude images from unlabeled tissue, in an epi-detection geometry. That is, it may be applied to arbitrarily thick tissue. sOBM may be implemented as a simple, cost-effective add-on with any scanning microscope, requiring only the availability of an extra input channel in the microscope electronics. We demonstrate here its implementation in combination with two-photon excited fluorescence (TPEF) microscopy and with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, applied to brain or spinal cord tissue imaging. In both cases, sOBM provides information on tissue morphology complementary to TPEF or CARS contrast. This information is obtained simultaneously and is automatically co-registered. Finally, we show that sOBM can be operated at video rate.OCIS codes: (110.0180) Microscopy, (180.5810) Scanning microscopy, (290.7050) Turbid media     

Three-dimensional visualization of Golgi-stained neurons by a projection X-ray microscope converted from a scanning electron microscope

Trying to obtain the three-dimensional images of neuronal elements, Golgi-stained thick sections were examined by a projection X-ray microscope converted from a scanning electron microscope. An attachment unit for the projection X-ray microscope consists of a target holder, specimen stage and film cassette. Two kinds of target material, titanium and gold, were tested. The system was operated at 10 to 30 kV. The electron beam into the target was about 20 nA with the use of a pointed cathode. The stereopair of X-ray micrographs were taken by tilting the specimens. Quality and contrast of the X-ray micrograph taken with a titanium target was better than that with a gold target. The spatial resolution was estimated about 1 to 2 micrometers for 100 to 350 micrometers thick sections with a titanium target. Compared with the light microscope, strong penetrating ability of X-ray permitted to visualize the internal structures of optically opaque materials. Further, almost all objects were in focus in X-ray micrographs even for relatively thick sections (100 to 350 micrometers). The three-dimensional morphology of neurons and glial cells was demonstrated by a stereopair of X-ray micrographs.     

木瓜蛋白酶诱导大鼠膝早期骨关节炎软骨表面的电镜扫描

背景：木瓜蛋白酶注射建立骨性关节炎动物模型是用于骨关节炎防治研究的常用方法之一。 目的：观察木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合注射诱导大鼠膝早期骨关节炎进程中扫描电镜下软骨表面形态学变化。 方法：2%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L左旋半胱氨酸按2∶1比例混匀,取0.15 mL注射至SD大鼠右膝关节腔诱导骨关节炎模型,左膝注射等量生理盐水为对照组,另取2只4膝不做处理为正常对照组,于注射后第2,4,6周后分别使用扫描电镜观察股骨内侧髁关节软骨表面形态学变化。 结果与结论：正常和对照组可见表面分布较均匀的浅坑。木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合注射2周后大鼠软骨表面出现凹凸不平,皱缩扭曲变形;4周表面变薄,局部出现小裂纹;6周出现深大裂纹,软骨缺损。提示2%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L左旋半胱氨酸混合注射诱导的早期骨关节炎模型的时间节点可以定在4-6周。     

Platelet-rich fibrin (PRF) gel modified by a carbodiimide crosslinker for tissue regeneration

Platelet-rich fibrin (PRF) as a rich source of effective growth factors has been used as a scaffold in tissue regeneration. It is known that PRF exhibits rapid degradability against enzymes, which should be decreased using crosslinking agents to reduce the release rate of growth factors and increase the effectiveness of tissue regeneration. In this study, a carbodiimide crosslinker with different concentrations (0.01%, 0.05%, 1%, and 2%) was used to modify and improve the properties of PRF gel. The crosslinked gels were evaluated with analyses such as SEM, swelling, degradability, mechanical strength, release test, cytotoxicity, and cell adhesion. The results showed that with increasing crosslinker concentration, the morphology of the fiber structure changes drastically, the swelling rate decreases from 300% (control) to 160% for the crosslinked gel, the degradation time for the control sample increases from 8 days to more than two weeks for the crosslinked gel, and the Young''s modulus increases from 0.15 MPa (control) to 0.61 MPa for the crosslinked samples. Growth factors also showed lower release with increasing crosslinking ratio. Cytotoxicity assays demonstrated that by increasing the crosslinker concentration to 1% w/v, no cytotoxicity was observed. Cellular studies with DAPI staining showed that the cells penetrated well into the gels and were well distributed, especially in gels with lower crosslinker concentrations. In addition, the modified PRF gel can be used as a scaffold for tissue regeneration.

1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) as a crosslinker can improve the physical and mechanical properties of PRF gel by forming covalent bonds.     

糖皮质激素作用下大鼠股骨远端松质骨超微结构改变:扫描电镜观察结果

背景:骨质疏松症中骨微结构的破坏是导致骨强度下降、骨脆性增加以及骨折发生率增加的重要原因.目的:通过扫描电镜观察糖皮质激素作用下大鼠股骨远端松质骨超微结构的改变.方法:3.5月龄SPF级雌性SD大鼠32只,随机分为2组,糖皮质激素组皮下注射甲泼尼龙3.5 mg/(kg·d)诱导糖皮质激素性骨质疏松,对照组皮下注射等量生理盐水.分别于干预4,9周后取大鼠股骨远端沿冠状面切开,蒸馏水冲洗骨髓腔,乙醇梯度脱水,表面喷金后利用扫描电镜观察大鼠股骨远端松质骨超微结构的改变.结果与结论:与对照组相比,糖皮质激素组大鼠骨小梁数目减少,且骨小梁变细、变脆、连接中断,立体网状结构破坏,同时骨吸收面积增加,骨胶原排列紊乱,骨微损伤增加,且糖皮质激素干预4周组较干预9周组能更好地保持骨微结构.提示糖皮质激素可导致大鼠松质骨的骨量减少、骨三维网状结构破坏、骨吸收活动增强,从而导致骨脆性增加,骨生物力学性能下降.     

扫描电镜下三种流动树脂充填体边缘微渗漏研究

目的扫描电镜下观察比较三种流动树脂充填V类洞的微渗漏程度。方法在42颗离体的恒磨牙颊侧制备V类洞,随机分为3组,每组14颗牙。分别充填Filtek Z350流动性纳米复合树脂、Beautifil Flow流动型聚合体和Esthet.X流体复合树脂,样本经冷热循环及加压负载试验后,在扫描电镜下观察充填体龈壁边缘微渗漏情况。结果Z350流动性纳米复合树脂组充填体与牙体组织之间微缝隙宽度最窄,与Beautifil Flow流动型聚合体组、Esthet.X流体复合树脂组相比均有显著性差异(P0.01)。结论 Z350流动性纳米复合树脂适合用于牙颈部龋损的充填。