乙肝病毒HBsAg-EGFP融合蛋白真核表达载体构建及稳定转染Chang Liver细胞系的建立

目的 构建可表达乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg-EGFP融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.方法 利用PCR技术从HBV基因组中扩增出HBsAg基因片段,BamH I/EcoR l双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP-N1真核表达载体,转化TG1菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒pEGFPNl.HBsAg.将阳性克隆用脂质体法转染Chang Liver细胞,经持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系.结果 成功构建了真核表达载体pEGFPN1-HBsAg;建立了其重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.结论 重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系可表达HBsAg-EGFP融合蛋白;该细胞系可以用于筛选HBsAg转染细胞后,差异表达的蛋白质研究,为深入研究HBsAg可能的致病机制提供依据.     

HCV NS5A基因在hepG2细胞中的表达以及对PI3K的影响

目的：探讨HCV—NS5A对PI3K表达的影响。方法：应用PCR技术从含有HCV全长开放阅读框的质粒中获得NS5A全长基因片段，利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．0（-）中。通过酶切、PCR及测序鉴定，NS5A基因已正确插入到pcDNA3．0（-）中，再利用脂质体转染HepG2细胞。结果：经RT—PCR及Western blot检测，HCV的NS5A基因在HepG2细胞中获得表达，而且在表达重组NS5A的转染HepG2细胞中，检测到PI3K蛋白的表达。结论：NS5A可在体外激活PI3K及其信号通路。     

P3启动子调控融合基因质粒构建及在肝癌细胞中表达(英文)

目的：构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因（IGF-Ⅱ）P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法：应用基因重组技术，构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体，脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。     

GFP／HBVX融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

1b型丙型肝炎病毒NS3-4b重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的 构建1b型丙型肝炎病毒(HCV) NS34b基因重组腺相关病毒载体并了解其在HEK 293细胞中的表达,为进一步研究HCV重组腺相关病毒疫苗及其树突状细胞疫苗奠定前期基础.方法 收集基因1b型的丙型肝炎病人血清,用RT-PCR的方法扩增NS3-4b全长片段,与腺相关病毒的表达载体pAAV.CMV.eGFP重组,构建pAAV.CMV.HCV.NS3-4b重组表达载体,转染HEK293细胞,检测其蛋白表达情况.结果 PCR扩增获得的NS3-4b条带与预期大小(2838 bp)一致,重组质粒经双酶切和测序证实NS3-4b基因已重组成功,重组质粒转染HEK 293细胞后Western Blot图可见有目的蛋白表达.结论 成功构建腺相关病毒重组HCV NS3-4b载体并且其能在真核细胞中表达.     

MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　扩增人黑色素瘤抗原 3(Melanomaantigen 3,MAGE 3)基因 ,构建真核表达载体 ,并在小鼠黑色素细胞瘤B16中进行表达。方法　采用PCR扩增MAGE 3基因 ,连接到真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,构建真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G4 18筛选阳性克隆 ,荧光显微镜和RT PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白 (Enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的表达和MAGE 3mRNA的表达。结果　从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 95 0bp的片段 ,成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆 ,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光 ,RT PCR检测到MAGE 3mRNA的表达。结论　成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,获得了稳定表达该载体的小鼠黑色素瘤B16细胞系 ,为研究MAGE 3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒x基因转染HepG2细胞后差异表达基因的筛选

目的建立稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞系,利用基因芯片技术分析HBx转染肝癌细胞株引起的表达谱变化。方法首先PCR扩增HBx基因片段,与真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组子,脂质体转染HepG2细胞经抗生素G418筛选后获得稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞系,采用流式细胞术、Western blot鉴定HBx蛋白在细胞中的表达。利用基因芯片技术分析HBx转染肝癌细胞株引起的表达谱变化。结果经HindⅢ和XbaⅠ内切酶酶切和测序鉴定表明成功构建了HBx基因真核表达载体,流式细胞术、Western blot均证实HBx蛋白在HepG2细胞高效表达,基因芯片结果显示在检测的35 000个基因中有98个基因转录显著上调,24个基因转录显著下调。结论成功构建了稳定、高效表达HBx的HepG2细胞,HBx转染HepG2细胞可导致部分基因显著差异表达,差异表达的基因可能参与了肝癌的发生发展。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在HepG2细胞中的表达及其对端粒酶活性的影响

目的 建立HCV核心蛋白细胞表达模型，并探讨其对细胞端粒酶活性的影响。方法 用PCR法扩增出HCV核心基因cDNA，将其插入真核表达载体pBK-CMV的HindⅢ和BamHⅠ位点间，构建重组质粒pBK-HCVc。再将重组质粒pBK-HCVc和空载体分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，RT－PCR、免疫组化和蛋白印迹鉴定HCV核心蛋白表达。PCR－ELISA法检测端粒酶活性。结果 构建的pBK-HCVc质粒在HepG2细胞中有稳定表达。表达HCV核心蛋白的细胞HepG2-C的端粒酶活性较转染空载体的细胞HepG2-CMV明显升高。结论 HCV核心蛋白上调了端粒酶活性，可能是HCV诱发肝细胞癌的一种途径。     

结合RNAi技术的三重表达HCV DNA疫苗的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建多表位抗原基因、hIL-12、小分子干扰RNA(siRNA)共质粒表达的新型复合丙型肝炎DNA疫苗并在HepG2细胞中表达.方法:设计并合成复合多表位丙肝抗原基因,将其与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中;利用pVAX1载体上卡那霉素抗性基因与复制起始位点之间的非功能区域,将带CMV启动子的hIL-12表达单元克隆进该区域的BspH Ⅰ位点中;同时将8组针对丙肝的siRNA表达单元分别克隆进载体复制起始位点下游非功能区域的Mlu Ⅰ位点上,构建三重表达的HCV DNA疫苗pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA.以该重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达;以靶向EGFP的siRNA做为对照验证siRNA的表达及其干扰效果;ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达.结果:经酶切鉴定和测序证实三重表达的复合HCV DNA疫苗构建成功.在转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;靶向EGFP的siRNA亦能显著抑制EGFP的表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 ng/L细胞上清,72 h检出量为1 712 ng/L细胞上清.结论:成功地构建多表位抗原基因、hIL-12和siRNA共质粒表达的丙肝DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原基因、hIL-12并介导RNA干扰效应.为进一步研究该DNA疫苗抗HCV的免疫治疗和基因治疗效果打下基础.     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白转染HepG2细胞对其p53表达的影响

目的 研究丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV—core protein，HCV—C）对HepG2细胞周期、细胞凋亡和n53蛋白表达的影响。方法 表达HCV—C的真核表达质粒pcDNA3.1-core，通过Lipofectamine基因转染法转染HepG2细胞，经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞，经Westem Blot证实HCV核心蛋白阳性表达。利用四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法，平板克隆实验和流式细胞术，蛋白印迹和免疫细胞化学法检测HCV核心蛋白对细胞生长增殖率、细胞周期、细胞凋亡率和p53蛋白表达的影响。结果 HCV—C转染组细胞增殖率显著高于空白质粒转染组和未转染组；HCV—C转染组细胞S期所占百分率高于未转染组；HCV-C转染组细胞凋亡率显著低于未转染组；HCV—C转染组细胞突变型p53蛋白的表达高于空白质粒转染组和未转染组。结论 HCV核心蛋白可能通过促进突变型p53蛋白的表达，促进HepG2从G0／1期进入S期，促进细胞生长增殖，抑制细胞凋亡。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对HepG2细胞生长周期的影响

目的: 构建丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-core-1b)真核重组质粒,获得稳定表达HCV-core-1b的HepG2细胞株,观察HCV-core-1b对HepG2细胞株生长周期及cyclin D1 和pRb/p130表达的影响,探讨丙型肝炎病毒慢性感染的可能机制。方法: 将HCV-core-1b亚克隆入pBabe-Flag-puro载体,获得重组质粒pBabe-Flag-HCV-core-1b;将重组质粒转染病毒包装细胞Pheonix 293T,筛选获得分泌HCV-core-1b的病毒包装细胞株。利用包装细胞产生的病毒上清感染靶细胞,筛选后获得稳定表达HCV-core-1b的HepG2细胞株,流式细胞仪检测靶细胞生长周期的变化,Western blotting检测cyclin D1 和pRb/p130蛋白的表达。结果: 基因测序确认HCV-core-1b亚型基因编码区完整无移位,与标签蛋白Flag形成融合蛋白。HepG2-HCV-core细胞株成功表达Flag-HCV-core-1b蛋白,并导致细胞cyclin D1 和 pRb/p130的水平下调,显著改变了HepG2细胞生长周期,使细胞阻滞在G₀/G₁期。结论: 成功构建了pBabe-Flag-HCV-core-1b真核表达质粒,获得稳定表达Flag-HCV-core-1b融合蛋白的HepG2细胞。由于HCV-core-1b蛋白的表达,下调了HepG2细胞 cyclin D1和pRb/p130的表达,显著抑制HepG2细胞生长周期。     

pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况。结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内。结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响。     

人BTLA-Fc融合蛋白的制备及其生物学活性的研究

为建立CHO/BTLA-Fc基因转染细胞株,使之能稳定分泌BTLA-Fc融合蛋白,采用PCR法从本单位构建的pEGZ-Term/B7-H1-Fc重组质粒中扩增人IgG1(Fc)恒定区,Xho I、BamH I双酶切后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接为重组质粒pIRES2-EGFP-Fc,同时PCR法从pEGZ-Term/BTLA重组质粒中获得人BTLA胞外段基因片段,用Nhe I、Xho I双酶切插入上述pIRES2-EGFP-Fc构建重组载体pIRES2-EGFP/BTLA-Fc。脂质体法以该重组载体转染鼠CHO细胞,G418筛选并亚克隆化。Protein G亲和层析柱对上清中的融合蛋白进行纯化,Western blot作定性分析。CCK-8检测BTLA-Fc融合蛋白对抗人CD3单抗激发的T淋巴细胞增殖的影响。结果表明,基因转染CHO细胞培养上清中表达的BTLA-Fc融合蛋白能与L929/HVEM细胞有效结合,纯化的融合蛋白经Western blot鉴定有清晰的目的条带,而且BTLA-Fc融合蛋白对T细胞的体外增殖具有抑制作用。     

利用乳糖化羧甲基壳聚糖构建小鼠OX40转基因细胞株

目的利用乳糖化羧甲基壳聚糖（Lac-CMCS）构建小鼠OX40转基因细胞株，探讨Lac-CMCS在HepG2细胞定向转染中的可行性。方法从ConA活化的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，应用RT-PCR方法，扩增获得编码小鼠OX40分子的cDNA，并将其克隆到pUCm-T载体，测序证实后构建pIRLS2-EGFP-OX40重组真核表达载体，利用Lac-CMCS与载体偶联靶向性转染HepG2细胞，G418筛选，RT-PCR法鉴定获得表达OX40分子的阳性细胞株。结果pUCm-T-OX40和pIRFE2-EGFP-OX40经PCR、酶切和测序分析，证实插入的目的片段与GenBank记载的小鼠OX40 cDNA序列完全一致。利用Lac-CMCS能将小鼠OX40靶向转染HepG2细胞并获得表达；经G418筛选后获得稳定表达小鼠OX40的细胞株。结论利用Lac-CMCS能够成功将OX40靶向转染入HepG2细胞中。     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

共刺激分子配体B7-DC基因真核表达载体和转基因细胞的构建

目的：克隆小鼠B7-DC基因，并构建含该基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-V5His，证明该基因在CHO细胞中的表达方式，为建立B7-DC的转基因小鼠打下基础。方法：从小鼠胸腺中抽提总RNA为模板，通过RT—PCR技术，扩增出B7-DC编码区片段。按常规方法克隆进pEF6V5His载体中，重组质粒经鉴定后采用脂质体法转染CHO细胞，48小时后进行间接免疫荧光实验，72小时后用blasticidin进行筛选，挑选出能稳定表达B7-DC的细胞株。结果：已成功克隆小鼠B7-DC基因并构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体，经间接免疫荧光实验（IFA）证明，该基因在CHO细胞中得到表达。经Western blot检测表明筛选出的转基因细胞稳定表达了B7-DC基因。结论：构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-VSHis，并能在CHO细胞中稳定表达目的基因，为该基因功能的后续研究奠定了基础。