携EGFP基因的逆转录病毒包装细胞的分选和滴度测定

目的 探讨利用荧光激活细胞分选技术获得有效重组逆转录病毒包装细胞系的方法。方法 用脂质体介导pLEGFP转染PA317细胞,用荧光显微镜观察转染结果;依据EGFP荧光利用流式细胞仪的分选技术获得多克隆和单克隆源性的包装细胞,并利用PCR、RT-PCR对其鉴定;以NIH3T3为靶细胞,对其滴度进行测定。结果 荧光显微镜显示用脂质体介导的方法成功的转染PA317细胞,在4次连续流式细胞仪分选后得到了稳定表达的多克隆和单克隆源性的包装细胞。PCR和RT-PCR分别从多克隆和单克隆源性的包装细胞细胞基因组DNA以及多克隆和部分(6/8)单克隆源性的包装细胞培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的EGFP片段。滴度测定显示得到的包装细胞能够产生有效的病毒滴度。结论 荧光激活细胞分选技术是获得有效病毒滴度的包装细胞的有效方法。     

重组HDV核酶逆转录病毒的生产及对HBV抑制效率的测定

目的:构建含HDV核酶基因的重组逆转录病毒载体,包装出逆转录病毒实现其在HepG2215细胞中稳定表达,并研究其是否抑制HBV的复制。方法:应用PCR方法扩增HDV核酶基因,克隆入逆转录病毒载体pMSCV/U6中,用脂质体法转染逆转录病毒载体包装细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,用PCR和药物抗性水平传播分析检测野生型辅助病毒。收获的病毒感染HepG2215细胞,用酶联免疫实验测定对HBV的抑制率。结果:重组逆转录病毒载体的酶切鉴定片段约为73bp,与预期值一致。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×10⁶ CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒,对HBV的抑制率最高可达61.56 %。结论:成功构建重组逆转录病毒载体,在包装细胞系中能生产出高滴度的逆转录病毒,能有效的抑制HepG2215细胞内HBV的复制,为HBV的基因治疗提供了实验数据。     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

可调控CYP4A1的逆转录病毒重组质粒的构建与鉴定

目的:运用分子生物学技术克隆CYP 4A1全长cDNA基因,进一步构建可由强力霉素诱导表达CYP4A1的逆转录病毒重组质粒。方法:运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从大鼠肝组织中扩增出CYP 4A1全长基因,克隆至pMD18-T载体,将构建正确的pMD18-CYP 4A1质粒采用双酶切亚克隆到逆转录病毒载体载体pRe-vTRE中,采用酶切反应、PCR鉴定和序列测定鉴定重组逆转录病毒载体pRevTRE/CYP 4A1;在脂质体介导下分别将质粒pRevTRE/CYP 4A1与逆转录病毒四环素调节质粒pRevTet-on转染至包装细胞PT67,分别经抗性筛选获得稳定产生病毒的包装细胞系后收集转染后的细胞上清。用荧光定量PCR测定病毒滴度。结果:经酶切鉴定、PCR鉴定和序列测定证实成功构建了pRevTRE/CYP 4A1逆转录病毒重组质粒;转染pRevTet-on的PT67细胞病毒滴度为7.2×1010copies/L,转染pRevTRE/CYP 4A1的PT67细胞病毒滴度为5.46×109copies/L。结论:成功构建了含四环素调控CYP 4A1基因的逆转录病毒重组质粒,建立了能产较高滴度逆转录病毒的包装细胞系,为CYP 4A1基因功能及其相关疾病的研究打下实验基础。     

Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体.方法利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES-EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1-IRES-EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP E86和PA317,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;"乒乓球"法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT-PCR法分别检测细胞荧光和Delta1 mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能.结果酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1-IRES-EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9.7×105 CFU/ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT-PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化.结论逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达.     

靶向肝细胞重组逆转录病毒载体的构建

目的：包装5种携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组逆转录病毒,筛选肝细胞靶向性好的病毒载体。方法：在前期构建的融合表达质粒基础上,构建4种新的表达质粒,采用脂质体法将这5种质粒分别与质粒pL-EGFP共转染已稳定表达Gag-Pol蛋白的NIH3T3包装细胞系中,48h后收获病毒上清,分别感染肝源性HepG2215细胞及非肝源性293T细胞,48 h后提取细胞总RNA,荧光定量PCR比较重组病毒的靶向性。结果：酶切鉴定结果表明4种新的表达质粒构建成功,包装的病毒滴度约为10⁵cfu/ml,以pcDNA3.1(-)-env^m-preS1-S2质粒包装的病毒有较好的肝细胞靶向性。 结论：包装的肝细胞靶向性好的重组逆转录病毒载体,为包装携带HDV核酶的病毒载体以及HDV核酶抑制乙型肝炎病毒复制表达的研究奠定了基础。     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

miR-148a克隆及逆转录病毒载体构建

目的 克隆微小RNA hsa-miR-148a并构建逆转录病毒表达载体.方法 将PCR扩增得到的miR-148a前体序列和pMSCV载体经双酶切连接产生pMSCV-miR-148a逆转录病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.用pMSCV-miR-148a和PIK packaging质粒以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293FT,包装产生逆转录病毒.将病毒感染NIH3T3细胞进行滴度测定.结果 经双酶切鉴定和测序证实,成功构建了miR-148a的逆转录病毒表达载体pMSCV-miR-148a.并测得病毒滴度为5×108CFU/ml.结论 以miR-148a前体序列构建的逆转录病毒表达载体pMSCV-miR-148a能够产生高滴度的逆转录病毒,为深入研究miR-148a的生物学功能奠定了基础.     

Constructing retroviral vector carrying green fluorescent protein （GFP） and investigating the expression of GFP in primary rat myoblast

INTRODUCTION Green fluorescent protein ( G FP ) absorbs blue or ultraviolet light , and gives out bright green fluorescence.G FP has been expressed in a variety of species , and extentively used in tissue engineering [1]. M yoblast could fuse w ith host m yofibers , transform - ing the target gene into the host , and expressing corressponding gene product.M yoblast is com patible w ith collagen and could be induced to differentiate by collagen. N ow m yoblast has been used in studies on…     

产生重组逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度影响因素

目的 探讨产生重组逆转录病毒包装细胞系建立及其病毒滴度（以cfu表示）的影响因素。方法 用逆转录病毒载体pSLXCMV，以磷酸钙共沉淀法转染PA317包装细胞，挑选抗性集落（PA317／pSLXCMV)扩大培养后，进行PA317／PSLXCMV细胞接种密度，培养温度（37度，32度），纯度方法等对其培养上清中重组病毒cfu影响的比较性研究。结果 包装细胞的密度是影响cfu滴度的关键因素；降低培养温度需延长培养时间方可提高cfu滴度，对比离心纯化与过滤纯化，并未发现两者之间的差异。结论 该实验结果为应用逆转录病毒载体进行的ex vivo基因治疗实验研究提供重要参考指标。     

膜结合型肿瘤坏死因子在人乳腺癌细胞中的转染

目的 :研究膜结合型肿瘤坏死因子α(TNFα)在基因转染中的特点及其在肿瘤基因治疗中的作用等特性。方法 :用反转录病毒为载体 ,将含有突变的膜结合型TNFα的质粒 ,用lipofectin法转入包装细胞株crip细胞。又用收集到的病毒上清感染人乳腺癌细胞MDA2 31,采用G418筛选 ,DNA印迹法和聚合酶链反应方法鉴定该基因转染的结果。结果 :经上述方法鉴定表明该外源基因已成功转染人乳腺癌细胞中 ,为进一步研究膜结合型TNFα的功能奠定了基础。结论 :经初步研究表明 ,含有膜结合型肿瘤坏死因子的质粒可以通过lipofectin法成功导入crip细胞 ,且该病毒可成功感染人乳腺癌细胞并整合     

供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒的制备

目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）基因的重组逆转录病毒,为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人ＰＤＧＦ－ＡｃＤＮＡ片段插入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子序列的逆转录病毒ＧＩＮａ载体的多克隆位点中,将构建的重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中,经Ｇ４１８筛选并扩增,以病毒液感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,测病毒滴度,选择出抗性克隆,进行免疫组织化学检测,表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为１．４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ;免疫荧光染色法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实ＰＤＧＦ－ＡＡ的表达;抗性细胞条件培养基的细胞活性高达５１．２Ｕ／（１０６·ｄ）。结论供转导ＰＤＧＦ－Ａ基因的高滴度逆转录病毒得以制备,该基因获得有效表达,表达产物具有明显的致丝裂活性。     

逆转录病毒滴度测定新方法的实验研究

[目的]研究一种简便、快速的能获取较高病毒滴度的体外培养方法.[方法]用质脂体转移法将逆转录病毒载体pLXIn转染到包装细胞PA317中,用G418筛选出抗性克隆,扩大培养,再收集上清,并测定病毒滴度.比较不同方法产生病毒的多少,为提高病毒滴度而进一步感染靶细胞奠定良好的实验基础.[结果]改良后的新方法(低温32℃、无CO2条件以及反复冻融法)较常规方法(37℃、5% CO2)可提高病毒滴度至少10倍.PTs,Ptas和PLXIn组病毒颗粒数分别提高到1.3×105CFU/ mL、1.2×105CFU/ mL、1.5×105 CFU/ mL.[结论]逆转录病毒滴度测定新方法简便、快捷,能获取较高病毒滴度.     

双功能逆转录病毒载体介导耐药基因转染人脐血CD34+细胞能增强联合化疗抗性

目的　为探讨转染醛脱氢酶基因 (ALDH1)和多药耐药基因 (MDR1)的人脐血CD34 细胞能否同吮增强对活性环磷酰胺 ( 4 HC)和P gp转运泵靶药的抗性。方法　构建了同时含ALDH1和MDR1双耐药基因的逆转录病毒表达质粒G1Na ALDH1 IRES MDR1,经LipofectAMINE介导转染GP E86和PA317包装细胞 ,采用含长春新碱 (VCR)和 4 HC的培养基克隆选择后 ,收集重组病毒上清于单向型与双嗜型包装细胞行乒乓交互感染 ,获得PA317重组病毒生产细胞 (最高滴度达 5 6× 10 5CFU ml) ,将含ALDH1和MDR1耐药基因重组病毒上清在细胞生长因子刺激下重复感染人脐血CD34 细胞。结果　经PCR ,RT PCR ,Southernblot,Northernblot,FACS和MTT方法检测显示外源ALDH1与MDR1基因已经整合入转染靶细胞中基因组并获得有效表达 ,同时传递不同的耐药表型。经耐药基因修饰的脐血CD34 细胞对 4 HC和P gp转运泵靶药同时产生抗性 ,其IC50值分别比未转染细胞高 4倍 ( 4 HC) ,5 5倍 (柔红霉素 DNR)和 7 2倍 (VCR)。结论　双功能逆转录病毒载体介导两种不同耐药基因转染人脐血CD34 细胞能增强联合化疗抗性 ,本基因转移系统的建立为开展肿瘤基因治疗的临床研究奠定了实验基础。     

hSALL4基因逆转录病毒载体的构建及在小鼠髓系祖细胞中的表达

目的：构建含人SALL4B基因的逆转录病毒载体并证明其在小鼠髓系祖细胞中的表达。方法：①用PCR方法从质粒pcDNA3-hSALL4B扩增包括有全部编码序列的人SALIABcDNA,将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成含hSALL4的重组逆转录病毒载体;②将重组质粒在包装细胞系PT67中进行包装,用病毒上清感染32D细胞;③RT—PCR分析其mRNA表达;④Westernblotting分析其蛋白质的表达。结果：①限制型内切酶酶切,PCR及DNA测序均证实hSALIAB成功地克隆入pLXSN;②转染的32D细胞在mRNA水平及蛋白水平均有SALIAB表达。结论：成功地构建了含人SALIAB的逆转录病毒表达载体;且表达于32D细胞中,为研究SALIA基因过表达对造血功能的作用及其机制奠定了基础。     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

经典方法与LaSRT法测定绿色荧光蛋白标记重组病毒滴度的研究

OBJECTIVE: To compare large-scale real-time titration method (LaSRT) with standard titration method by flow cytometry (FACS) for determining the titers of green-fluorescence-protein (GFP)-marked recombinant retrovirus. METHODS: (1) Standard titration method: NIH3T3 cells were inoculated at 2x10(5) /well in 6-well plate, and after cell culture for 12 h, 0.5 ml, 50 microl and 5 microl GFP-marked recombinant retrovirus (n=3) were respectively used to infect the cells, with the final concentration of polybrene being 8 microg/ml. Forty-eight hours later, the cells were treated with trypsin and assayed for the positive rate of GFP by means of FACS. When the positive rate was lower than 10%, the titer was calculated according to the equation: virus titer (TU/ml) =2x10(5)xGFP positive rate/volume of virus stock solution used. (2) LaSRT method: The cells were inoculated at 5,000 cells/well in a 96-well plate, and after cell culture for 12 h, 90 microl/well complete culture medium was used with 8 microg/ml polybrene and 10% newborn bovine serum, 10 microl virus was added into the first well, and ten-fold dilution of the previous virus-containing solution was performed before the virus was added into the next well (8 wells in each group, altogether 3 groups). Forty-eight hours later, inverted fluorescence microscope was used to observe the fluorescence-positive cells in each well. The virus titer was calculated according to the equation: virus titer (TU/ml) =mx10(n+1), where n is the serial number of the reference well, and m the number of positive cells. (3) LaSRT was used to study the influence of freezing/thawing on the titers of recombinant retroviruses. RESULTS: The virus titer obtained with standard method by FACS was (1.54+/-0.38)x10(6) TU/ml, and that of LaSRT was (1.33+/-0.57)x10(6) TU/ml (P>0.05). After one cycle of freezing/thawing, the virus titer dropped to (18.1+/-9.9)% (n=7). CONCLUSION: LaSRT is more rapid and convenient as well as easier to determine the virus titer compared with standard method, and no significant difference is found between the two titration methods.     

小鼠Aire逆转录病毒表达载体的构建及表达

目的：将小鼠Aire基因定向连入MigR1-GFP质粒,得到长期稳定的Aire逆转录病毒表达载体,收集逆转录病毒上清感染胸腺基质细胞,为研究Aire在胸腺细胞终末分化中的作用奠定基础。方法：以小鼠胸腺基质细胞的cDNA为模板扩增得到Aire的ORF片段;将该片段连接入MigR1-GFP质粒;将构建成功的Aire—MigR1-GFP质粒转染293T细胞,收集逆转录病毒上清;使用逆转录病毒上清感染胸腺基质细胞系MTEC9,流式细胞仪检测感染效率,Western blot确定Aire蛋白的表达。结果：（1）成功得到Aire的ORF片段。（2）构建的Aire逆转录病毒表达质粒能够成功表达Aire蛋白。（3）逆转录病毒上清成功感染胸腺基质细胞系MTEC9。结论：成功构建了小鼠Aire逆转录病毒表达载体,并实现了Aire蛋白在胸腺基质细胞系中的强制性表达。