双表达B7-1、B7-2基因肿瘤疫苗治疗小鼠肝癌优于单表达疫苗的研究

目的:研究B7-1、B7-2基因对肿瘤的免疫治疗作用。方法:应用转染有B7-1、B7-2基因的肝癌细胞株H22/B7-1、H22/B7-2,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小。结果:各实验组动物都发生肿瘤,接种H22/B7-1 H22/B7-2组成瘤率低,对照组动物肿瘤呈进行性生长;组间成瘤潜伏期不同,与对照组相比,凡接种有H22/B7-2的小鼠肿瘤形成有迟发性;接种转B7基因细胞的小鼠肿瘤生长都较对照组慢;同时接种H22/B7-1和H22/B7-的小鼠能负载大于107的肿瘤细胞。转基因细胞在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显增强。结论:B7-1、B7-2都能增强肝癌细胞的免疫原性。B7-2在抗肿瘤早期发挥作用,B7-1随后起放大和调节作用。B7-1与B7-2联用效果优于单一应用。     

肿瘤源性外切体负载的间充质干细胞抗肿瘤活性的实验研究

目的:分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体及同基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs);将外切体负载经γ干扰素(IFN-γ)刺激活化的间允质干细胞,探讨其抗肝癌细胞活性改变.方法:利用超滤及密度梯度离心法分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体;利用贴壁培养联合免疫磁珠阴性分选法体外培养同基因小鼠骨髓间充质干细胞;外切体负载活化的间充质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育,72 h后观察H22细胞增殖状态.结果:外切体负载的IFN-γ刺激活化的间允质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育72 h后,活化组H22细胞增殖速度明显低于对照组.结论:负载肿瘤源性外切体的间充质干细胞抗肝癌细胞活性明显增强,间充质干细胞联合肿瘤源性外切体有可能成为一种更为有效的外切体疫苗诱导抗肿瘤效应.     

B7.1转基因肿瘤疫苗与大蒜素联合治疗膀胱癌的初步研究

目的初步估计大蒜素与B7.1转基因肿瘤疫苗对膀胱肿瘤的联合抗肿瘤效果.方法采用脂质体将B7.1基因导入鼠膀胱肿瘤(MBT-2)细胞.B7.1分子的表达经免疫荧光染色而测得.利用混合淋巴细胞培养MTT法,观察MBT-2-B7.1细胞刺激脾淋巴细胞的增殖作用.用MTT法测定了大蒜素对肿瘤细胞体外生长的影响.通过动物实验测定该肿瘤疫苗与大蒜素对膀胱肿瘤的联合治疗效果.结果转染了B7.1基因的肿瘤细胞能有效地刺激脾淋巴细胞增殖.当与大蒜素联合应用时,明显延迟了肿瘤的发生,并有效抑制了肿瘤的生长.结论大蒜素与转基因肿瘤疫苗治疗相结合能显著增强抗肿瘤效果.     

小鼠肝癌细胞(H22)源外泌体的体内抗肝癌作用研究

目的在荷瘤动物模型观察小鼠肝癌细胞（H22）来源的外泌体（exosomes）激发宿主抗肝癌免疫应答的效应。方法用自行分离纯化的小鼠肝癌细胞H22源外泌体免疫小鼠,然后给小鼠皮下注射H22肿瘤细胞,观察肿瘤的生长状况。用MTT法检测小鼠脾细胞增殖情况和细胞毒活性;用免疫组织化学法检测肿瘤组织中CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞浸润情况。结果该外泌体使肿瘤出现时间延迟,肿瘤生长缓慢,小鼠生存率提高。促进脾淋巴细胞增殖并增强其细胞毒活性,促进CD4^＋和CD^8＋T细胞活化。结论小鼠肝癌细胞（H22）源外泌体能诱导抗肿瘤应答,有效地诱导特异性的杀伤肿瘤细胞活性,有针对亲本细胞的免疫保护作用。     

嗜盐隐杆藻胞外多糖抗肿瘤活性研究

目的探讨嗜盐隐杆藻胞外多糖(exopo lysaccharide of Aphanothece ha lophy tica,EPAH)的抗肿瘤活性。方法以S180肉瘤为肿瘤模型,检测EPAH对肿瘤生长的抑制活性;M TT法检测EPAH对S180肉瘤细胞、Sm cc7721肝癌细胞和H eL a细胞的体外抑制活性;以对荷瘤小鼠免疫器官、血液淋巴细胞数量及淋巴细胞增殖影响、NK细胞杀伤活性和巨噬细胞产生NO及其他细胞因子的影响评价EPAH对小鼠免疫功能的作用。结果EPAH对S180肉瘤生长有显著的抑制作用,其中预防给药和与肿瘤接种同时给药组最大抑瘤率分别达66.79%和47.93%。100μg/mL EPAH对Sm cc7721细胞、H eL a细胞以及S180细胞生长的抑制率达60%以上。EPAH显著提高荷瘤小鼠脾脏和胸腺质量以及血液淋巴细胞数量,促进淋巴细胞增殖反应,增加NK细胞杀伤活性,刺激巨噬细胞产生NO,分泌白细胞介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。结论EPAH有显著的抗肿瘤活性,并能直接作用于肿瘤细胞,抑制肿瘤生长。EPAH可能是通过增加荷瘤小鼠免疫器官的质量和免疫细胞的数量、促进淋巴细胞分裂,提高NK细胞杀伤活性和巨噬细胞产生NO以及其他细胞因子实现其抗肿瘤活性。     

人源性肝癌细胞小鼠原位移植瘤模型的建立及特点的比较研究

目的选择3株人源性肝癌细胞,原位接种于4种不同免疫功能缺陷的小鼠肝组织内,建立人源性肝癌细胞原位移植瘤模型并进行比较。方法将人Hep G2、HUH-7和QGY-7703细胞悬液,分别接种于不同免疫功能缺陷的小鼠(BALB/c裸鼠、NOD SCID小鼠、NOG小鼠和NPG小鼠)肝组织内。最终统计模型小鼠死亡时间、死亡率、肝重量,应用B超以及组织学检查等方法,分析比较不同免疫功能缺陷小鼠肝癌模型的特点。结果 B超和大体解剖观察结果显示各实验组小鼠均可见肝组织内有肿瘤结节形成;肝接种Hep G2细胞悬液的各组动物于实验20 d左右全部死亡,NOG和NPG小鼠生存时间显著低于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠(P 0. 001); HUH-7和QGY-7703接种肝的各实验组动物分别于实验第92天和104天进行解剖,发现NOG和NPG模型小鼠肝体积显著增大并形成巨大肿瘤团块,而BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠仅可见肝组织出现较小的肿瘤结节; HUH-7及QGY-7703接种肝的NOG和NPG小鼠肝重量显著高于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠(P 0. 05);组织学检查可见各组动物肝组织内均出现肿瘤细胞生长伴大面积坏死,部分动物肺组织发生肿瘤细胞转移。结论与BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠比较,肝癌细胞在NOG和NPG小鼠肝组织内生长更为迅速,最终表现为生存期短,肝体积大,重量增加。NOG和NPG小鼠可以在较短时间内完成人源性肝癌细胞的恶性增殖,缩短模型研究周期,因此NOG和NPG小鼠人源性肝细胞原位移植瘤是抗肝癌药物的研发的较为理想的模型。     

树突状细胞介导的肝癌免疫治疗实验研究

目的探讨以树突状细胞（DC）为介导的原发性肝癌免疫治疗新方法。方法采用肝癌细胞制备肿瘤细胞性抗原冲击致敏体外培养的DC,体外混合淋巴细胞反应检测抗原致敏DC;刺激同基因T淋巴细胞增殖的能力,观察负载肿瘤抗原的DC;体内外诱导产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）及其抗肿瘤能力。结果经肝癌细胞抗原致敏的DC;能诱导较强的自体T细胞增殖,且诱导特异性CTL,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC和未经肝癌细胞抗原致敏的DC;激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对非同种肿瘤细胞无明显的杀伤作用,经BEL7402肿瘤细胞抗原致敏的DC;经皮下免疫小鼠可诱导有效的免疫保护作用,可抵抗野生型BEL7402细胞的再攻击,肿瘤生长受到明显抑制,瘤体出现延迟,生长减慢。结论DC具有强大的刺激T淋巴细胞增殖和诱导产生特异性CTL的能力,在体内外均能激发特异性抗肿瘤免疫应答。     

苦参碱对小鼠H22细胞抗肿瘤作用的实验研究

目的:观察苦参碱在体内和体外的抗肿瘤作用.方法:MTT法检测苦参碱对小鼠腹水瘤细胞H22的体外杀伤作用;Annexin V-FITC/PI双标记法检测苦参碱对体外培养的H22细胞的诱导凋亡作用;在BALB/C小鼠H22移植瘤模型上观察苦参碱的体内抑瘤活性,透射电镜观察苦参碱治疗后荷瘤小鼠肝癌细胞的超微结构改变;免疫组化法检测荷瘤小鼠肝癌组织中Bcl-2、Bax蛋白表达.结果:苦参碱在体外能够明显抑制H22细胞的生长和增殖,并可诱导细胞凋亡;对小鼠肿瘤生长也有明显抑制作用,高、低浓度组抑瘤率分别为60.71%和62.53%;用药组小鼠肿瘤组织中,电镜下可见较为典型的细胞凋亡的形态学改变;肿瘤组织中Bcl-2蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达增强,与荷瘤对照组相比有显著性差异(P＜0.01).结论:苦参碱在体内外对H22肿瘤细胞生长均有抑制作用,同时可促进肿瘤细胞表达Bax蛋白,抑制Bcl-2表达,诱导肿瘤细胞凋亡.     

小鼠肝癌细胞系Hepa1-6 B7.1瘤苗抗肿瘤免疫的实验研究

目的：研究小鼠肝癌细胞系Hepal-6转染B7.1基因后在体内外抗肿瘤免疫的作用。方法：采用脂质体介导的方法用pLXSNB7.1转染PA317包装细胞，经G418筛选出高滴度阳性的细胞克隆，以流式细胞仪检测B7.1分子的表达情况；用所获病毒上清进一步感染Hepal-6细胞，观察转染B7.1基因后Hepal-6细胞作为肿瘤疫苗在体内外诱发抗肿瘤免疫的情况。结果：Hepal-6/B7.1高表达B7.1分子，其致瘤性明显降低。接种小鼠后成瘤率为20%，而亲代Hepal-6细胞成瘤率为100%，转B7.1基因肿瘤细胞疫苗可抑制肿瘤生长速度，延长荷瘤小鼠生存期；且转B7.1基因肿瘤细胞疫苗具有保护性免疫反应。结论：转B7.1基因的肿瘤细胞作为肿瘤疫苗可有效地激发机体的抗肿瘤免疫反应。     

CBA/N小鼠肝癌移植瘤的建立及重建SCID免疫的B淋巴细胞抗癌作用

目的: 研究CBA/N,nude,SCID小鼠建立人肝癌模型和重建SCID免疫的特点,初步探讨B淋巴细胞及其抗体对肝癌细胞生长的排斥作用.方法: 将体外培养的人肝癌细胞接种到B细胞缺陷的CBA/N,T细胞缺陷的BALB/c-nu,T,B细胞缺陷的SCID小鼠及免疫重建的SCID小鼠中,观察瘤细胞生长特点;取实验小鼠血清,测定荷瘤鼠抗体Ig含量的变化,取小鼠血清与肝癌细胞作抗原抗体凝集试验.结果: CBA/N和用BALB/c小鼠外周血淋巴细胞重建的SCID(B-PBL-SCID)小鼠不成瘤,nude,SCID和用CBA/N外周血淋巴细胞重建的SCID (C-PBL-SCID)小鼠100%成瘤;有B淋巴细胞的实验鼠(包括B-PBL-SCID)测到的Ig达到mg/mL水平,血清能与肝癌产生凝集反应.结论: SCID小鼠是建立肿瘤模型和免疫重建及其肿瘤免疫研究的理想的实验动物;B淋巴细胞及其产生的抗体在抗肿瘤中起着重要的作用.     

腺病毒介导人IL-2基因治疗的抗肿瘤作用及机理分析

目的　观察重组人白介素 2腺病毒 (advh IL- 2 )在小鼠肝癌 H2 2中的转染效率、表达时程、体内抗肿瘤作用及其免疫机理。方法　小鼠皮下接种肝癌 H2 2 ,将肿瘤生长至体积为 10 0～ 2 0 0 mm3的荷瘤小鼠随机分组 ,经肿瘤局部注射给药。用 X- gal染色法检测重组腺病毒载体 adv L ac Z的转染效率 ;用 RT- PCR检测人 IL- 2基因的持续表达时间 ;以 H2 2瘤体生长及荷瘤小鼠存活时间评价 advh IL - 2抗肿瘤作用 ;以 51 Cr 4小时释放法测定治疗小鼠脾细胞的 L AK与 CTL 杀伤活性 ,免疫荧光法分析肿瘤组织内 CD4 +与 CD8+ T细胞浸润情况。结果　肿瘤局部单次注射 1× 10 9pfu重组腺病毒 ,可在肿瘤组织中进行有效的转染及表达 ,人 IL- 2基因的表达时间长于 12 d。AdvhIL- 2的抗肿瘤作用具有剂量依赖性 ,与 PBS组比较 ,2× 10 9pfu advh IL- 2可非常明显地抑制 H2 2皮下瘤的生长、延长荷瘤小鼠的生存时间 (P<0 .0 1) ,同时明显增强脾细胞 L AK与 CTL杀伤活性 (P<0 .0 1) ,增加肿瘤组织内CD4 + 与 CD8+ T细胞的浸润。结论　 Advh IL - 2通过介导人 IL - 2基因在小鼠 H 2 2肿瘤组织中的持续表达 ,产生明显的体内抗肿瘤作用 ,其机理与激活荷瘤小鼠抗肿瘤免疫反应有关     

Zoledronic acid inhibits hepatocellular carcinoma cells growth in vitro and in vivo

背景 越来越多的临床前研究表明,唑来磷酸能抑制多种肿瘤细胞生长,但其对肝癌细胞的作用尚未见报道。本研究我们通过体内体外实验验证唑来磷酸对肝癌细胞的作用。 方法 SRB及流式细胞术验证唑来磷酸对肝癌细胞生长及周期的影响。westernblot验证周期蛋白表达变化。H22腋下核瘤小鼠及H22腹水瘤小鼠模型验证唑来磷酸在体内对肝癌细胞效应。 结果 唑来磷酸可能通过下调CDC2和上调cyclin A表达诱导S期阻滞从而抑制肝癌细胞株SK-HEP-1、H22细胞生长。在体内试验中,唑来磷酸显著抑制核瘤小鼠肿瘤生长且可显著延长腋下核瘤小鼠及腹水瘤小鼠生存。 结论 唑来磷酸体内外均可抑制肝癌细胞生长且可延长核瘤小鼠生存。本研究结果将为唑来磷酸直接应用于肝癌的治疗提供一定的理论和试验基础。     

Zoledronic acid inhibits growth of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo

Background Growing preclinical evidence shows that zoledronic acid (ZOL) exhibits direct antitumor activity in various cancer cell lines.However,the cytotoxic effects of ZOL on human hepatocellular car...     

Anti-tumor effect of murine renal cell carcinoma cells genetically modified to express B7-1 combined with cytokine secreting fibroblasts

Recently, many experiments have shown that the expression of the costimulatory molecule B7-1 on tumor cells can induce tumor-specific immunity. These results suggest that tumor cells modified to express costimulatory molecules can be used as a potential tumor vaccine. For this purpose, we transduced B7-1 gene into renal adenocarcinoma cells of spontaneous origin (Renca) in BALB/c mouse using the retroviral vector system. Our results indicated that approximately 60% of cells expressed B7-1 gene product using the retroviral vector system, and that B7-1 transduction did not affect the expression of MHC molecules on tumor cells nor the in vitro growth rate of tumor cells, but only in vivo tumorigenicity. As for the antitumor effect on the remote site, there were no significant differences among parental Renca, Renca lac Z and Renca B7-1 sublines, although tumors grew a little more slowly in the mice injected with Renca B7-1 cells as a vaccine. Even if the growth of tumors was significantly delayed in the mice treated by Renca B7-1 as a vaccine combined with the injection of BALB/c3T3 IL-12 near to the tumor on the same or following day, no significant antitumor effects were observed when the Renca B7-1 cells were injected as a vaccine compared with cytokines near the vaccine site. These results indicated that B7-1 gene transduction can decrease the tumorigenicity of murine renal cell carcinoma cells, but fails to induce sufficient antitumor response when it is used as a tumor vaccine. It is necessary to develop immunogenicity, by such means as irradiation or a combination of appropriate cytokines, to stimulate effective tumor immunity in a therapeutic setting.     

融合基因GM-CSF/IL-2转基因瘤苗在肝癌特异性免疫治疗中的应用

目的 制备人白细胞介素2(hIL-2)与鼠粒-单核细胞集落刺激因子(mGM-CSF)融合基因修饰的H22肝癌全细胞瘤苗,探索融合基因GM.CSF/IL-2转基因瘤苗,在肝癌主动免疫治疗中特异性抗肿瘤作用.方法 用含hlL-2与mGM-CSF融合基因的真核表达载体在体外转染H22肝癌细胞,制成疫苗,皮下接种Balb/c小鼠,同时建立Balb/c小鼠荷瘤模型,ELISA法检测H22/pcDNA3.1( ).GM-CSF/IL-2瘤苗免疫组小鼠与各对照组小鼠(分别接种H22/pcDNA3.1( )瘤苗、H22瘤苗、PBS)血清中IL-10、IFN- γ水平,观察小鼠存活期;同时用51Cγ释放法测定H22/pcDNA3.1( )-GM-CSF/IL-2瘤苗免疫组小鼠与各对照组小鼠(单纯荷瘤组、正常组)脾细胞对亲本H22肝癌细胞的杀伤活性.结果 成功制备了含有hIL2与mGM-CSF融合基因的H22肝癌瘤苗,转基因瘤苗免疫组小鼠的脾细胞在体外对亲本H22肝癌细胞的杀伤率为38.3%,显著高于对照组小鼠的脾细胞对亲本H22肝癌细胞的杀伤率(分别为13.6%和7.5%),也高于其对S180细胞的杀伤率(9.1%)(P＜0.05).转基因瘤苗免疫组小鼠血清IFN-γ较对照组明显升高(P＜0.01),血清IL-10较对照组明显降低(P＜0.01).同时,转基因瘤苗免疫组小鼠生存期亦有明显延长.结论 转染hIL-2与mGM-CSF融合基因的同系肿瘤细胞瘤苗可激发特异性细胞介导的免疫反应,改善抗肿瘤免疫反应,延长荷瘤小鼠生存期.     

用酶联免疫斑点法检测肝癌患者抗原特异性免疫应答能力

目的研究HLA-A2阳性肝细胞癌(HCC)患者及正常人外周血CD8+ T细胞对流感病毒抗原肽(Flu p58-66)的免疫应答能力.方法用免疫磁珠法分离出HCC患者与正常人外周血CD8+ T细胞,以照射后自体CD8-外周血单个核细胞(PBMC)或树突状细胞(DC)作为抗原提呈细胞(APC),加载Flu抗原肽,经7 d培养诱导,用酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测诱导后产生γ干扰素的效应CD8+ T细胞频数.结果当效应细胞为5×104个/孔时,CD8- PBMC作为APC,Flu抗原肽特异的CD8+ T细胞频数在HCC患者组(n=8)为22个±9个/孔,正常人组(n=12)为59个±27个/孔,两组间差异有非常显著意义(P<0.01),但均为阳性应答;在5名正常人,Flu抗原特异的CD8+ T细胞频数以DC为APC时高于以CD8- PBMC为APC时(P<0.05).结论 HCC患者对Flu p58-66的免疫应答程度虽较正常人低,但大多数中晚期HCC患者仍然具有对抗原肽产生特异免疫应答的能力.     

博落回总碱对肝癌细胞的毒性作用和体内抗肿瘤作用

OBJECTIVE: To observe the cytotoxic effects in vitro and antitumor effects in vivo of total alkaloid of Macleaya cordata. METHODS: MTT assay was used to assess the proliferation of Hep3B and H22 cells in vitro treated with the alkloid, and the inhibitory effects of the alkaloid on H22 and S180 tumors were observed in mice with subcutaneous inoculation of the tumor cells. RESULTS: The total alkaloid significantly inhibited the proliferation of human Hep3B cells and murine H22 cells in a dose-dependent in vitro. IC(50) of the alkloid in 3 repeated experiments was 3.04, 3.98 and 2.98 mug/ml respectively in Hep3B cells, and was 2.89, 2.21 and 2.34 mug/ml in H22 cells. In the tumor-bearing mice, the alkaloid inhibited the development of H22 tumor and prolonged the survival of S180 tumor-bearing mice. At the daily dose of 1, 2, and 4 mg/kg.b.w (i.p.) and 4 mg/kg.b.w. (i.g.) for 10 days, the inhibition rates of the alkaloid on H22 tumor in 3 repeated experiments were 18.6%, 35.1%, 44.9% and 7.9% respectively, and the rates of survival prolongation of the tumor-bearing mice were 24.8%, 48.9%, and 52.7%, respectively. CONCLUSION: The alkloid possesses antitumor effects both in vitro and in vivo.     

淋巴细胞趋化因子基因修饰增强肿瘤抗原多肽致敏的树突状细胞的 …

目的 通过选择性增强树突状细胞（ＤＣ）与Ｔ细胞的体内相互作用。优化其体内抗原提呈的微环境,为进一步增强ＤＣ介导的肿瘤免疫治疗效果。方法 体外培养的小鼠骨髓树突太细胞体外经Ｌｔｎ重组腺病毒感染后（Ｌｔｎ－ＤＣ）,用３ＬＬＬｅｉｗｓ肺癌细胞株的Ｍｕｔｌ抗原肽冲击致敏,按不同剂量免疫正常同系小鼠体内,观察其体内诱导的细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）活性保护性免疫反应。通过体内阻断试验探讨免疫细胞亚群及免疫分