核酶抑制端粒酶活性的实验研究

目的为有效切割肿瘤细胞端粒酶ＲＮＡ组分使端粒酶活性降低,从而使细胞不能维持端粒长度而在有限分裂后进入凋亡。方法设计并合成了针对端粒酶ＲＮＡ组分的锤头状核酶基因,构建了该核酶基因的体外转录和真核表达质粒,检测了核酶对端粒酶ＲＮＡ组分的体外切割效力和对ＨｅＬａ细胞端粒酶活性的抑制效力。结果该核酶对端粒酶ＲＮＡ组分的体外切割效率达到６０％左右。导入ＨｅＬａ细胞后使端粒酶活性降至原来的１／８～１／１０,细胞生长速度明显变慢,传至１９～２０代时出现９５％凋亡。结论该核酶可望成为有效的端粒酶抑制剂,在肿瘤基因治疗中发挥作用。     

姜黄素抑制HeLa细胞端粒酶的活性

目的研究姜黄素能否抑制HeLa细胞端粒酶活性。方法用MTT法检测姜黄素对HeLa细胞生长的抑制作用,用RT-PCR和半定量TRAP-ELISA法检测HeLa细胞中人端粒酶催化亚基(hTERT)mRNA的表达和端粒酶活性。结果HeLa细胞生长呈剂量依赖性抑制,其端粒酶活性和hTERT的表达也明显下调。结论姜黄素可能通过下调hTERT的表达而抑制HeLa细胞的端粒酶活性。     

AML患者端粒酶逆转录酶mRNA的表达与端粒酶活性的检测

目的:建立一种实时荧光RT-PCR方法,定量检测急性髓细胞白血病(AML)患者外周血单个核细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达水平,观察其与AML发生及复发的关系,探讨hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性的相关关系。方法:采用实时荧光RT-PCR与Lightcycler荧光PCR仪定量检测hTERT mRNA的表达水平,采用PCR-ELISA检测端粒酶活性。结果:①AML首治患者、复发患者、完全缓解期患者以及健康体检者NhTERT分别为299.2±292.8、550.1±441.3、14.0±9.2和12.3±6.7,与健康体检者和完全缓解期患者比较,AML首治患者、复发患者hTERT mRNA表达水平显著升高,而且AML复发患者hTERT mRNA的表达水平显著高于首治患者;②AML首治患者、AML复发患者、AML完全缓解期患者以及健康体检者端粒酶的活性分别为32.8%±24.3%4、8.6%±31.4%、7.4%±5.1%和7.6%±3.6%,AML首治患者、复发患者端粒酶活性显著升高,而且AML复发患者端粒酶活性显著高于首治患者;③hTERT mRNA表达水平与端粒酶的活性呈现良好的相关性,相关系数为0.78。结论:hTERT mRNA表达水平与端粒酶活性的上调是AML发生与复发的一个重要因素,且hTERT mRNA表达水平与端粒酶活性呈良好的正相关。     

端粒酶核酶抑制裸鼠移植瘤生长的实验研究

目的　探讨端粒酶核酶对裸鼠移植瘤生长的影响。方法　构建了人子宫颈癌细胞株HeLa 裸鼠移植瘤,将不同剂量端粒酶核酶真核表达质粒pXJ-neo-teloRZ用脂质体包裹后进行瘤体内多点注射,对照组注射生理盐水或空质粒载体。连续注射14 天,测量肿瘤体积和重量,检测瘤组织端粒酶活性,并作病理切片检查。结果　端粒酶核酶使肿瘤组织端粒酶活性下降,肿瘤组织凋亡增加,明显地抑制了裸鼠移植瘤生长。结论　该端粒酶核酶可望成为有效的端粒酶抑制剂,在肿瘤基因治疗中发挥作用。     

端粒,端粒酶与细胞永生

长期以来，人们研究表明癌是由长久积累的破坏正常细胞生长调控机制的多重变异所引发，不同类型的癌可能都在同一基因上发生变异。近来研究提示：端粒酶的激活机制可能在恶性肿瘤细胞中发挥重要作用，可能是细胞永生的必要条件或者可使细胞无限增生。故此，本文就端粒及端粒酶的结构和功能与细胞永生之间关系的研究新进展作一综述。１　端粒及其功能Ｍｕｌｌｅｒ与ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ分别在３０年代首次和４０年代发现染色体未端即端粒对维持染色体稳定具有重要作用。８０年代，随着生物学发展，对纤毛虫Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ中大量端…     

端粒酶逆转录酶及c-myc基因反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性的影响

目的研究端粒酶逆转录酶（hTERT）与c-myc基因反义寡核苷酸（ASODN）对HL-60细胞端粒酶活性的影响,探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT和c-myc基因表达的关系。方法应用反义寡核苷酸（ASODN）分别封闭HL-60细胞hTRET与c-myc基因,RT-PCR方法检测基因表达;分别使用TRAP-ELISA法、PAGE-银染法检测细胞端粒酶活性。结果ASODN作用细胞72h后。hTERT、c-mycmRNA的表达受到不同程度抑制。以30μmol／L作用组表达量最低。TRAP-ELISA检测：hTERT ASODN10、20、30μmol／L作用组,c-myc ASODN20、30μmol／L作用组与未作用组比较,端粒酶活性明显降低（P〈0．05）;c-myc ASODN 10μmol／L作用组及c-myc、hTERTSODN作用组与未作用组比较无显著差异（P〉0．05）。PCR-PAGE检测：hTERT与c-myc ASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol／L作用组条带最少,而同浓度hTERT ASODN作用组较c-mycASODN作用组条带减少。结论hTERT与c-myc基因ASODN能够分别抑制该基因mRNA的表达,同时具有下调端粒酶活性作用。     

端粒酶活性抑制的研究进展

端粒、端粒酶具有特殊结构和功能，近年来已成为分子生物学研究的热点。资料证实，端粒酶激活见于大多数恶性肿瘤中，是恶性肿瘤形成的早期关键事件，而在大部分正常组织中无端粒酶活性。因此，端粒酶抑制剂被认为是一类潜在的高选择性的抗肿瘤药物，抑制剂的开发研究为恶性肿瘤的早期诊断、预后估计以及基因治疗开辟了一个新的方向。本阐明了有关端粒酶抑制剂的研究进展，并讨论了其应用前景和可能面临的问题。     

靶向hTERT RNA干涉促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

目的：利用RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达，探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。方法：将成功构建的针对hTERT的siRNA(small interferencing RNA)表达载体转染HeLa细胞，通过透射电镜、免疫印迹和流式细胞术(FCM)等方法检测人宫颈癌HeLa细胞的凋亡情况。结果：构建的siRNA表达载体可以诱导HeLa细胞发生凋亡。结论：针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体稳定转染HeLa细胞，可诱导HeLa细胞发生凋亡。     

端粒酶活性抑制与肿瘤治疗的研究

端粒酶是一种核糖蛋白,包括人端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白和端粒酶催化蛋白亚单位三个主要组成部分,可向染色体末端添加端粒DNA序列.端粒酶在85％～95％的恶性肿瘤组织中有阳性表达,而正常体细胞则一般阴性,是进行肿瘤基因治疗的理想靶点.目前以抑制端粒酶活性为靶点的肿瘤治疗研究较多,其主要策略有:①阻断人端粒酶RNA的模板作用;②抑制端粒酶催化蛋白亚单位;③核苷类似物竞争性抑制反转录过程;④细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性;⑤对细胞内调节机制进行调控;⑥其它抑制剂对端粒酶活性的调节.     

人端粒酶逆转录酶核心启动子调控的人TRAIL蛋白在人卵巢癌细胞中的表达

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因核心启动子（hTERT）调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达载体，并检测TRAIL在转染的卵巢癌细胞SKOV3中的表达情况。方法：利用基因重组方法将TRAIL基因克隆人带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。采用脂质体介导的方法将hTERT调控的TRAIL基因真核表达载体转染人卵巢癌SKOV3细胞，采用G418筛选获得阳性克隆；应用免疫细胞化学法、蛋白质印迹分析、流式细胞术（FCM）结合间接免疫荧光、RT—PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达。结果：经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确。转染细胞中的TRAIL表达明显高于对照组细胞。结论：成功地构建了hTRET基因核心启动子调控的TRAIL基因真核表达载体，并在人卵巢癌细胞系SKOV3中得到稳定表达，为进一步研究其对卵巢癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。     

端粒酶活性抑制与肿瘤治疗的研究

端粒酶是一种核糖蛋白，包括人端粒酶ＲＮＡ、端粒酶相关蛋白和端粒酶催化蛋白亚单位三个主要组成部分，可向染色体末端添加端酶ＤＮＡ序列。端粒酶在８５％～９５％的恶性肿瘤组织中有阳性表达，而正常体细胞则一般阴性，是进行肿瘤基因治疗的理想靶点。目前以抑制端粒酶活性为靶点的肿瘤治疗研究较多，其主要策略有：①阻断人端粒酶ＲＮＡ的模板作用；②抑制端粒酶催化蛋白亚单位；③核苷类似物竞争性抑制反转录过程；④细胞分化诱     

胶质瘤细胞ING1、人端粒酶逆转录酶及人端粒酶相关蛋白1基因表达的研究

目的 探讨胶质瘤细胞ING1、人端粒酶逆转录酶(hTERT)和人端粒酶相关蛋白1(hTP1)基因表达的意义。方法 用mRNA原位杂交及免疫组织化学染色方法观察了70例不同级别的人胶质瘤组织。结果 hTERT mRNA和蛋白的阳性表达率分别为88.6％和82.9％,hTP1 mRNA和蛋白的阳性表达率均为100％,这4种阳性肿瘤细胞的密度彼此间均呈正相关(r=0.758～0.882,P<0.0005),并均随肿瘤级别升高而相应增加(P<0.05～0.01)。ING1 mRNA和蛋白的阳性表达率分别为94.3％和88 6％,两种阳性肿瘤细胞密度间也呈正相关(r=0.831,P<0.0005),但两者均随肿瘤级别升高而相应减少(P<0.01),并均分别与hTERT mRNA和蛋白及hTP1 mRNA和蛋白的阳性肿瘤细胞密度呈负相关(r=-0.211～-0.384,P<0.05～0.001)。结论 胶质瘤细胞中hTERT和hTP1基因表达异常增加可能是抑制其ING1基因表达的重要因素,这3种基因的表达异常可能在胶质瘤发生及恶性进展过程中起重要作用。     

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因抑制Hep-2细胞生长增殖的实验研究

目的探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对Hep-2细胞生长增殖的抑制作用及诱导凋亡作用。方法根据hTERTcDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2。随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的质粒pshRNA3。构建不表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA4。实验分为5组:A(pshRNA1)、B(pshRNA2)、C(pshRNA3)、D(pshRNA4)、E(空白培养液)。酶切后电泳分析鉴定质粒pshRNA1~3。采用共聚焦显微镜检测质粒转染后细胞荧光表达情况;以蛋白印迹法研究hTERT表达变化;以TRAP-PCR ELISA法研究端粒酶活性变化;以四甲基偶氮唑盐(MTT)法、倒置相差显微镜及原位细胞凋亡法观察各质粒抑制细胞增殖及诱导凋亡作用。结果(1)质粒pshRNA1~3SalⅠ酶切后电泳见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致。共聚焦显微镜下见大量的细胞表达绿色荧光。(2)pshRNA1、2转染细胞后hTERT表达显著降低;细胞端粒酶活性明显受到抑制,A组细胞活性为:0·159±0·039、B组细胞活性为0·163±0·028、E组细胞活性为1·512±0·076。A、B组与E组比较,差异均有统计学意义(P<0·01)。(3)与E组细胞吸光度(A)值比较,A、B组细胞各时间点均减小,P值均小于0·01。同等培养条件下,A、B组脱落瓶壁的死亡细胞显著增多,凋亡率明显升高。结论(1)靶向hTERTmRNA的shRNA真核表达质粒能有效转染Hep-2细胞;(2)RNA干扰hTERT能显著地抑制Hep-2细胞的生长增殖并诱导细胞凋亡。     

RNA干扰端粒酶活性对HeLa细胞生物学行为的影响

目的 观察RNA干扰(RNAi)体外培养的HeLa细胞端粒酶催化亚单位(hTERT)对HeLa细胞生物学行为的影响,进一步探讨端粒酶活性与肿瘤细胞恶性生物学行为的相关性.方法 体外转录法设计合成4条针对hTERT基因的shRNA,脂质体转染HeLa细胞后经免疫荧光染色和端粒重复序列扩增-酶联免疫法(TRAP-ELISA)测定端粒酶活性,筛选出端粒酶沉默效果最佳片段即B链shRNA.以B链shRNA转染HeLa细胞为实验组,转染无关siRNA的HeLa细胞为对照组,显微镜下观察细胞在纤维黏连蛋白(FN)上的铺展;CCK-8细胞计数试剂盒检测细胞在FN上黏附;划痕实验评价细胞迁移;Boyden小室侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 铺展实验显示细胞接种到FN上30 min时,对照组铺展细胞的比率为(31.3±7.9)%,而实验组铺展细胞的比率仅为(5.6±2.3)%,两组差异有统计学意义(P<0.01);2 h后对照组和实验组铺展细胞的比率分别为(79.4±4.8)%和(26.3±6.1)%,两组差异仍有统计学意义(P<0.01);24 h后两组所有细胞几乎均呈铺展状态.细胞黏附实验显示细胞在FN上黏附30 min时对照组细胞黏附率为(83.7±5.4)%,而实验组的细胞黏附率为(67.2±2.8)%,明显低于对照组(P<0.05).划痕实验检测细胞的迁移能力显示实验组细胞24 h迁移率为(27.1±6.2)%,明显低于对照组(58.7±15.0)%.Boyden小室侵袭实验显示在Matrigel胶上培养4 h后,实验组和对照组侵袭的细胞数分别为75.7±14.5和165.1±11.0,差异有统计学意义(P<0.05).结论 降低体外培养HeLa细胞的端粒酶活性使细胞的生物学特性发生改变,表现为减低了HeLa细胞的恶性生物学行为.     

hTERT基因反义核酸对Raji细胞端粒酶活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASODN)对Raji细胞端粒酶活性的影响。方法: 端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测Raji细胞的端粒酶活性；采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果:hTERTASODN作用于Raji细胞后，hTERTmRNA表达水平明显降低，ASODN与Raji细胞共同孵育48h，hTERT蛋白表达阳性率降为50.15%±3.49%，72hhTERT蛋白表达阳性率降为33.35%±2.75%。而hTERT正义核酸作用24、48、72h对hTERT蛋白表达阳性率(65%)无显著影响(P＞0.05)。hTERT基因ASODN作用于Raji细胞48h，其端粒酶活性明显降低，作用72h，端粒酶活性明显受到抑制，分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论:hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制Raji细胞的端粒酶活性。     

二氟甲基鸟氨酸对HeLa细胞及其端粒酶活性的影响

探讨二氟甲基鸟氨酸(DFMO)对人宫颈鳞癌细胞系HeLa细胞生长特性、凋亡和端粒酶活性的影响。采用细胞记数、形态观察、流式细胞术(FCM)分析、DNA电泳和端粒重复扩增技术(TRAP)，观察DFMO对HeLa细胞生长、凋亡和端粒酶活性的影响。DFMO能显著抑制HeLa细胞生长，诱导细胞凋亡，G1期细胞增多、S期细胞减少，细胞内端粒酶活性明显被抑制。外源性腐胺(Pu)的加入可阻止DFMO引起的上述变化。DFMO可抑制HeLa细胞的生长，诱导HeLa细胞凋亡；抑制HeLa细胞内端粒酶活性。DFMO引起的HeLa细胞生长抑制及凋亡诱导与端粒酶活性被抑制有关，这可能是抗肿瘤的分子机制之一。     

端粒酶核酶hTERT 5''RZ时辰治疗人肝癌裸鼠移植瘤

我们在既往的研究中 ,为探讨肝癌裸鼠移植瘤细胞DNA合成与端粒酶表达的生物节律 ,在时辰同步化裸鼠中构建了肝癌细胞SMMC 772 1裸鼠移植瘤。继续在程控光照条件下饲养 ,于光照后 3,6 ,9,1 2 ,1 5 ,1 8,2 1小时取样 ,用流式细胞仪测定各时期细胞DNA含量 ,细胞周期分布及端粒酶活性水平。结果 ,肝癌裸鼠移植瘤细胞DNA合成随昼夜节律变化 ,且伴随端粒酶活性的同步节律变化 ,均在光照后 2 1小时达高峰 ,光照后 9小时处于低谷 ;节律周期呈余弦分布。表明 ,肝癌裸鼠移植瘤的生长与端粒酶活性表达在静止相达高峰 ,为制定肿瘤时辰化疗方案提…     

端粒酶活性抑制的研究进展

端粒、端粒酶具有特殊结构和功能,近年来已成为分子生物学研究的热点.资料证实,端粒酶激活见于大多数恶性肿瘤中,是恶性肿瘤形成的早期关键事件,而在大部分正常组织中无端粒酶活性.因此,端粒酶抑制剂被认为是一类潜在的高选择性的抗肿瘤药物,抑制剂的开发研究为恶性肿瘤的早期诊断、预后估计以及基因治疗开辟了一个新的方向.本文阐述了有关端粒酶抑制剂的研究进展,并讨论了其应用前景和可能面临的问题.     

使用RNAi技术抑制HeLa细胞p42MAPK表达

目的筛选可抑制HeLa细胞p42^MAPK表达的siRNA。方法采用体外转录合成的方法,合成针对p42^MAPK的siRNA 3条和阴性对照siRNA 1条,并进行Cy-3荧光标记,用脂质体转染HeLa细胞,以判断转染效果。应用噻唑蓝（MTT）法和流式细胞仪检测siRNA的作用效果,筛选具有功能的siRNA序列;应用Western blot方法鉴定siRNA抑制p42^MAPK表达的效果。结果从3条p42^MAPK siRNA中筛选出2条有效的序列siRNA-2和siRNA-3,与空白对照组、脂质体对照组和随机siRNA-4相比,两者均可诱导HeLa细胞p42^MAPK表达下调,Western blot结果分析显示,与随机siRNA-4相比分别下调了1／2和2／3,并抑制HeLa细胞的增殖（P〈0．05）,同时改变了细胞周期各时相的细胞分布。结论p42^MAPK siRNA-2和siRNA-3在体外实验中可沉默目的基因以及抑制HeLa细胞增殖。