CD-TK双自杀基因系统对前列腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨CD-TK融合双自杀基因对前列腺细胞的杀伤作用.方法 应用缺陷性腺病毒载体将CD-TK融合双自杀基因以及绿色荧光蛋白基因(GFP)转染RM-1细胞,以GFP是否表达作为间接鉴定转染成功的标志,以RT-PCR鉴定作为是否转染的标准.联合前药5-FC和/或GCV作用于转染了CD-TK基因的RM-1细胞,以MTT法检测自杀基因系统对转染后的RM-1细胞的杀伤作用,以未转染的RM-1细胞作对照.结果 以腺病毒感染RM-1细胞72 h后,在荧光显微镜下可见每个细胞都能发出淡绿色荧光,表明该基因已转染到RM-1细胞中,RT-PCR可检测到转染双基因的RM-1细胞含有CD-TK基因.与对照组相比较,当GCV浓度为125 μg/ml时,转染了CD-TK基因的RM-1细胞的存活率为47.27%;与对照组相比较,当5-FC浓度为160 μg/ml时,RM-1细胞的存活率为71.56%;而两种前药联合应用时RM-1细胞的存活率为18.45%,低于单一用药组(P＜0.05).结论 CD/5-FC、TK/GCV自杀基因系统对前列腺癌细胞具有较强的杀伤作用,而应用CD-TK融合自杀基因系统明显优于单一的自杀基因系统.     

前列腺特异启动子驱动的自杀基因对雄激素非依赖前列腺癌的杀伤作用

目的 将前列腺特异性启动子驱动的自杀基因导入到雄激素非依赖性前列腺癌(androgen independent prostale Cancer,ALPC)细胞,观察其对AIPC细胞的杀伤作用.方法 将rPB-DR(6)启动子驱动的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因融合分子插入到逆转录病毒载体pLNCX,构建pLN-rPB-DR(6)-CD重组逆转录病毒载体,PA317包装,获得重组逆转录病毒,后者感染前列腺癌细胞PC-3,获得CA18抗性细胞PC-3CD.在培养基中加入维甲酸、5-氟胞嘧啶,观察其对PC-3CD的杀伤作用.结果 经酶切和测序证实成功构建了pLN-rPB-DR(6)-CD重组逆转录病毒载体,PCR证实在PC-3CD基因组DNA中扩增出了CD基因,RT-PCR证实PC-3CD有CD mRNA表达.在培养基中加入维甲酸、5-氟胞嘧啶后,PC-3CD细胞大量死亡,生长显著被抑制.结论 前列腺特异性启动子驱动的自杀基因可杀伤雄激素非依赖性前列腺癌细胞,并显著抑制其生长.     

融合自杀基因AdCD-UPRT对人肺癌细胞A549的体外作用

目的:研究融合自杀基因CD-UPRT系统对A549细胞的体外作用.方法:包装、扩增携带重组腺病毒AdCD-UPRT,并测定其滴度.检测AdCD-UPRT感染A549细胞的效率、毒性及目的基因的表达.用MTT法观察AdCD-UPRT/5-FC系统对A549细胞的体外抑制作用及旁观者效应.运用AO-EB染色、电镜及FCM观察AdCD-UPRT/5-FC系统对A549细胞的诱导凋亡作用.结果:CD-UPRT融合自杀基因对A549细胞显示出明显的生长抑制作用并存在旁观者效应,使细胞周期阻滞于S期并诱导细胞凋亡.结论:CD-UPRT融合自杀基因系统对A549细胞有较强的细胞毒作用.     

慢病毒介导的双自杀基因对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨慢病毒介导的CDglyTK融合基因体系对人乳腺癌细胞株（MCF-7）的杀伤作用。方法 构建的重组质粒pLenti6／V5-D-CDglyTK及阳性对照质粒pLenti6／V5-D-GFP在lipofectamine2000介导下转染293FT细胞,包装、扩增后获得病毒颗粒,体外感染MCF-7细胞株,荧光显微镜下观察阳性对照质粒的感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予前药5-FC,GCV及5-FC＋GCW处理,观察该体系对细胞株的杀伤效应。结果 重组体对细胞株的感染率随慢病毒滴度的增高而递增。RT-PCR方法检测发现MCF-7有目的基因CDglyTK的表达。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效（P〈0．001）。结论 慢病毒为载体有较高的转染效率,MCF-7细胞对前药的具有较高的敏感性,双自杀基因疗效优于任一单自杀基因。     

自杀基因CD、TK的共表达对人肺腺细胞的杀伤作用

目的 观察双自杀基因的共表达与单自杀基因单独表达对癌细胞的杀伤作用。方法 分别构建了以CMV为启动子,含单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）和／或大肠杆菌嘧啶脱氨酶（Ecoli.CD)单、双自杀基因的真核表达载体。在脂质体介导下将基因导入细胞,经G418筛选出稳定表达的克隆。用PCR、半定量RT－PCR检测各组基因的整合及表达。给予前本药物5－氟胞嘧啶（5－flurocytosine,5-Fc)和／或无环岛苷（Ganciclovir,GCV)后,用MTT法测定各围基因组细胞的存活率。结果 单、双自杀基因均在GLC－82细胞中稳定表达,双基因转染组对细胞增殖的杀伤及旁杀伤效应高于单基因组。结论 TK＋CD／5－Fc GCV的双基因共表达体系较CD／6－Fc或TK／GCV单 基因体系对细胞具有更强的杀伤作用。     

PNP-TK融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的分析PNP—TK融合自杀基因系统对HepG2肝癌细胞的杀伤作用及其对肝癌细胞的杀伤机制。方法利用重组PCR定点诱变法制备PNP—TK融合基因,将其插入真核表达载体pcDNA3．0中,构建融合基因表达载体pcDNA3．0／PNP—TK,经酶切、PCR及测序鉴定重组体,G418筛选获得稳定转染了pcDNA3．0／PNP—TK的抗性细胞克隆。RT-PCR和WesternBlotting检测PNP—TK基因在HepG2细胞中的表达。台盼兰排斥法测定细胞生长曲线,MTF法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果融合基因片段PNP—TK正确插入了pcDNA3．0载体中,pcDNA3．0／PNP—TK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达。细胞抗性克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下,pcDNA3．0／PNP—TK对肝癌细胞产生了良好的旁观者效应。结论具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3．0／PNP-TK对肝癌细胞HepG2有着良好的杀伤作用,有望将其应用于肝癌体内治疗。     

PNP—TK融合自杀基因及PNP单自杀基因对肝癌细胞杀伤效率

目的分析PNP—TK融合自杀基因系统及PNP单自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用及二者对肝癌细胞潜在的杀伤机制。方法构建融合基因表达我体pcDNA3．0／PNP—TK。经酶切、PCR及测序鉴定重组体。G418筛选获得稳定转染了pcDNA3．0／PNP-TK的HepG2细胞克隆。RT—PCR和Western Blotting检测融合基因在HepG2细胞中的表达。台盼兰排斥法检测细胞的生长曲线,MTT法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果融合基因片段PNP—TK正确插入了pcDNA3．0载体中,pcDNA3．0,PNP-TK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达。抗性细胞克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下。pcDNA3．0／PNP-TK所导致的旁观者效应明显强于只给予MeP-dR一种前药以及pcDNA3．0／PNP单基因系统所致的旁观者效应。结论具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3．0／PNP-TK对肝癌细胞的杀伤效果优于PNP单自杀基因系统。     

双自杀基因重组腺病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的体外特异性杀伤作用

目的研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD／TK融合基因（AdKDR—CDglyTK）对胃癌细胞及血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法选择表达KDR的MGC803细胞、ECV304细胞和不表达KDR的LS174T细胞，用腺病毒重组体AdEasy-KDR—CDglyTK和AdEasy—CMV—CDglyTK感染之，观察其感染效率并以RT—PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达．然后给予不同浓度的前药5一FC及GCV处理，观察该体系对不同细胞株的杀伤效应。结果两种重组体对各细胞株的感染率相似，其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT—PCR检测发现：除感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞外．感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞均有目的基因CDglyTK的表达。以感染复数为100的两种腺病毒分别感染各细胞株，其表现出对前药不同的敏感性：感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞对前药具有较高的敏感性．且其敏感性差异无显著性意义（P〉0．1）；相比之下，感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感（P〈0．001）。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效（P〈0．001）。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养，观察到该体系明显的旁观者效应。结论KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR胃癌细胞及血管内皮细胞。     

自杀基因单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶对鼻咽癌细胞株杀伤作用机制的研究

目的探讨自杀基因单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）对鼻咽癌（NPC）细胞株的杀伤作用机制.方法将HSV-tk基因通过脂质体法转染NPC细胞株,经G418筛查挑选阳性细胞克隆并经逆转录聚合酶链反应（R-PCR）鉴定,加入前体药物戊环鸟苷（GCV）后,观察其对NPC细胞的杀亡状况.结果MTT法显示转染的NPC细胞株在加入GCV后,成活率明显降低,与未转染基因的NPC细胞株相比,差异有显著性（P＜0.01）.流式细胞仪显示与未加GCV的细胞相比,转染基因的细胞加入GCV后生长受到明显抑制,S期细胞数从占总细胞数的35.71%降至17.41%,凋亡率从1.33%增长至8.15%,并出现明显的凋亡峰.电镜下,转染细胞经GCV作用后大量细胞发生凋亡,可观察到凋亡细胞内特征性的凋亡小体.结论自杀基因HSV-tk对NPC有明显的杀伤作用,其可能性机制是HSV-tk基因联合GCV,对NPC细胞产生选择性细胞毒性作用,抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡.     

融合自杀基因对骨肉瘤细胞作用的实验研究

目的观察单纯疱疹病毒-胸苷激酶/胞嘧啶脱氨酶融合自杀基因（HSV TK/CD）对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法将含TK/CD的重组腺病毒载体感染人骨肉瘤细胞系MG 63细胞,测定感染效率后,分别给予不同浓度的前体药物和不同感染复数的自杀基因重组腺病毒,计算瘤细胞增殖抑制率,MTT法测定细胞存活率,并用流式细胞术和Hochest 33342 染色法分析杀伤机制。结果含自杀基因的重组腺病毒成功感染MG 63细胞;不同感染复数和不同前体药物浓度下,融合自杀基因系统对瘤细胞的杀伤作用明显强于单基因和双基因相加的作用 (P＜0.05);其杀伤机制为致细胞坏死和细胞凋亡。结论融合自杀基因HSV TK/CD对骨肉瘤细胞系MG 63细胞的生长有明显的抑制作用。     

NT4-SAC-HA2-TAT融合基因表达载体的构建及鉴定

目的 构建NT₄-SAC-HA₂-TAT融合肽cDNA克隆，探讨前列腺凋亡反应基因-4(Par-4)核心区凋亡肽(SAC)作为目的基因对前列腺癌的治疗作用。  方法 应用互为引物模板法合成两端具有NaeI和KpnI酶识别位点的SAC cDNA片段。将所得SAC和已有HA₂-TAT片段克隆到具有相应酶切位点的pBV220-NT₄质粒，得到pBV220-NT₄-SAC-HA₂-TAT重组质粒。PCR扩增NT₄-SAC-HA₂-TATcDNA片段，并将其克隆到pGEM-T easy中，转化细菌筛选阳性克隆，酶切鉴定，序列测定分析。  结果 经DNA测序、限制性内切酶酶切等证实，PCR获得了编码NaeI和KpnI酶切位点的SAC cDNA片段，并将NT₄、SAC、HA₂-TAT亚克隆于pBV220内。  结论 成功构建了NT₄-SAC-HA₂-TAT融合基因的原核表达载体pBV220-NT₄-SAC-HA₂-TAT。     

自杀基因联合细胞因子的癌症治疗

INTRODUCTION The transfer of suicide genes into tumor cells is currently being used in a variety of clinical gene therapy trials for the treatment of cancer, and suicide gene therapy is the transduction of a gene that transforms a non-toxic into a toxic substance[1].     

~(153)Sm-EDTMP联合唑来磷酸治疗前列腺癌骨转移

目的:评价153钐-乙二胺四亚甲基磷酸(153Sm-EDTMP)联合唑来磷酸治疗前列腺癌骨转移的临床疗效及不良反应。方法:使用153Sm-EDTMP联合唑来磷酸静脉注射治疗20例去势后前列腺癌骨转移伴有不同程度骨痛患者,观察其镇痛效果、骨转移灶的变化及不良反应。结果:20例患者接受治疗后,止痛的总有效率94.12%,无效5.88%,骨转移灶有明显减少。所有患者均未发现严重的不良反应。结论:153Sm-EDTMP联合唑来磷酸对去势治疗后的前列腺癌骨转移骨痛的临床止痛疗效明显,对多发骨转移癌伴骨痛是一种有效的治疗方法。     

垂体腺瘤双重靶向性基因治疗的实验研究

目的构建并实验评价转染与转录双重靶向性基因治疗系统对垂体腺瘤的治疗作用。方法构建GE7基因导入系统介导的生长激素启动子调控的基因治疗系统,通过对垂体生长激素腺瘤GH3细胞的体外实验,以及垂体腺瘤裸鼠模型的体内实验,观察此系统用于垂体腺瘤基因治疗的可能性和靶向性。结果成功构建双重靶向性基因治疗系统;基因转染后,GH3细胞可检测到HSVTK蛋白,对照细胞为阴性;在此基础上予以GCV(4mg/L),GH3细胞存活率平均为106%,相同条件下,U2OS、HO8910PM的存活率分别为829%和935%(P<001);裸鼠皮下种植肿瘤经基因治疗后,治疗组肿瘤体积明显缩小(168mm3±17mm3),各对照组肿瘤体积均有不同程度的增大(P<001);治疗组裸鼠的生存期也较对照组明显延长(平均123d和40d,P<001)。结论GE7转染的生长激素启动子调控的基因治疗有望成为垂体腺瘤的靶向性治疗策略。     

肿瘤基因治疗的研究进展

随着生命科学的高速发展,基因治疗已经成为目前肿瘤研究中的一项热门课题。肿瘤基因治疗常用的方式有导入抑癌基因、抑制癌基因的表达、自杀基因治疗、抑制血管生成、针对一些细胞因子的基因治疗、针对耐药基因的治疗和肿瘤DNA疫苗等等。用于肿瘤基因治疗的常用载体有病毒载体和非病毒载体。相信随着科学的进步,基因治疗手段的不断革新,肿瘤的基因治疗必将拥有广阔的应用前景。     

新辅助治疗对125I粒子永久种植组织间照射治疗局部高危前列腺癌的影响

目的 总结新辅助治疗后125I粒子永久种植组织间照射治疗局部高危前列腺癌的经验.方法 选择局部高危前列腺癌10例(T17/10;T2a3/10);前列腺特异抗原(PSA)20～50(29.4±12.6)μg/L,前列腺体积(54±33)ml.新辅助治疗:(康士得50 mg/d 1周;康士得50 mg/d+皮下注射诺雷德3.6 mg/4周)3～10个月(中位时间6个月);模板法125I粒子永久种植前列腺组织间照射,前列腺组织间照射剂量145 Gy(125I粒子35～78粒,中位数46粒),尿道周围剂量≤80 Gy,直肠周围剂量≤60 Gy,手术时间1～2.5 h,平均1.75 h.结果 新辅助治疗3～10个月后,PSA降为(1.4±0.7)μg/L;前列腺体积为(25±10)ml;与治疗前比较差异有统计学意义(P＜0.01).125I粒子永久种植组织间照射术后3～5 d拔除尿管,1例出现排尿不畅,1例出现尿道刺激征,对症治疗后缓解.随访3～24个月(中位时间13个月),PSA为(0.9±0.7)μg/L.结论 新辅助治疗可以降低PSA、缩小前列腺体积,从而保证靶区处方剂量,减少放疗相关并发症,提高了局部高危前列腺癌的疗效.     

非病毒类载体靶向治疗前列腺癌研究进展

在治疗前列腺癌的各种传统方法中,普遍存在着杀伤癌细胞的同时对正常组织器官造成损伤的现象。近年来兴起的靶向治疗在一定程度上能很好地解决这一问题。但作为靶向治疗的载体,病毒类载体存在免疫原性大、毒性大等缺点,而非病毒类载体靶向治疗前列腺癌往往能克服这些缺点。本文综述了以阳离子聚合物、脂质体和壳聚糖聚合物为主的非病毒类载体包裹基因药物靶向治疗前列腺癌的研究进展。     

前列腺癌间歇性内分泌治疗的临床观察及其疗效影响因素分析

目的：观察间歇性内分泌治疗在不同分期及分级的前列腺癌患者中的效果,并分析影响疗效的可能相关因素。方法：对45例不同分期及分级的前列腺癌患者进行间歇性内分泌治疗：首先行激素诱导治疗即药物去势和/或抗雄激素治疗,停止治疗的时机为保持前列腺特异抗原（prostate specific antigen, PSA）≤0. 2 μg/L(ng/mL)水平持续3个月,以后根据每月PSA 的检测结果决定是否再行内分泌治疗。随访观察患者治疗的轮数和治疗期及间歇期的时间。根据治疗效果将上述患者分为治疗耐受较好和治疗耐受较差两组,单因素分析比较两组患者在人口统计学、临床、生化、影像、病理等方面的差异,并使用非条件Logistic回归分析探讨影响治疗耐受的独立相关因素。结果：平均随访时间为40.7±13.4个月。45例患者中,41名患者进入第2轮治疗,其中8例患者在第2轮治疗期间进展为雄激素非依赖性前列腺癌;8例中7例患者均为T _3-4 M₀或M₁期且Gleason评分≥8分。16名患者进入第3轮治疗,其中有14名分期为Ⅲ期以内,有13名患者Gleason评分≤7分。第1到第4周期平均间歇期（分别占第1到第4疗程时间的百分比）分别为8.7±5.4个月（47.1%）,8.4±4.9个月（49.3%）,7.0±3.4个月（43.7%）,3.7±0.6个月（42.5%）。5例患者在治疗过程中出现骨转移,目前没有患者死亡。按照评价标准将患者分为治疗耐受较好（n=16）与治疗耐受较差两组（n=29）,与治疗耐受较差的患者相比,治疗耐受较好的患者Gleason评分较低（P=0.002）,PSA值较低（P=0.053）,Ⅳ期患者较少（P=0.001）。相反,年龄、有无骨转移、淋巴结转移及有无复发等差异均无统计学意义。非条件Logistic回归分析显示Ⅳ期患者所占比例是唯一影响治疗的独立相关因素（OR=12.113, 95%CI 1.330~110.312, P=0.027）。结论：能坚持较多治疗周期的患者多为肿瘤分化较好的Ⅲ期及以内的病患,而较快进展为激素非依赖性的患者多为分化较差的Ⅳ期患者,间歇性内分泌治疗可能更适合于Ⅲ期以内患者。     

前列腺癌基因3的临床研究进展

前列腺癌是老年男性常见的恶性肿瘤之一,目前仍无满意的预测方法。前列腺癌基因3（PCA3）可能是最有前景的前列腺癌高特异性标记物,在穿刺活检中的预测作用被广泛证实,在联合其他诊断方法时有助于提高前列腺癌的诊出率,并且有望在预测肿瘤侵略性、基因靶向治疗方面有特殊作用。本文就PCA3基因在初次、重复穿刺活检中的预测作用、PCA3分数与前列腺癌体积和Gleason分级的关系、PCA3联合其他检查方法预测前列腺癌的效果及靶向基因治疗作用等方面进行综述。