脐血来源的不同增殖能力的两种内皮祖细胞

目的比较两种脐血来源内皮祖细胞的增殖和抗凋亡能力。方法采用Annexin V／PI的凋亡检测比较两种细胞抵抗凋亡的能力；用增殖实验等方法比较两种内皮祖细胞的增殖特点；用集落形成实验比较两种细胞的集落形成能力。结果发现高增殖潜能内皮祖细胞（HPP-EPCs）显示比循环成血管细胞（CACs）具有更强的抗凋亡能力。CACs只能达到4-6个倍增，而HPP-EPCs能达到60多个倍增。CACs的单个细胞不能形成集落，HPP-EPCs的单个细胞中能在14d的培养期间形成了次级集落和Y-YL集落。结论HPP-EPCs比CACs具有更强的抗凋亡能力、增殖能力和集落形成能力。     

槲皮素对人内皮祖细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

目的研究氧自由基对内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的损伤及槲皮素(quercetin,Que)的保护作用,并探讨可能机制。方法①分离内皮祖细胞并诱导其分化,随机分为:空白对照组;60～120μmol/L Que组;H2O2组;60～120μmol/L Que+H2O2组。②WST-1观察细胞增殖情况;③应用免疫细胞化学染色法观察p-JNK蛋白;④流式细胞术分析细胞凋亡改变。结果①低浓度的Que可以促进EPCs的增殖,而高浓度的Que则表现为抑制其增殖(P<0.05);②Que在60～120μmol/L范围内呈浓度依耐性降低H2O2诱导的EPCs凋亡率(P<0.01);③Que能抑制加入JNK激动剂后EPCs凋亡率的增加(P<0.05)。结论Que可促进H2O2诱导的EPCs的增殖,并通过阻断JNK信号通路抑制其凋亡。Que具有拮抗氧化应激条件下EPCs损伤的潜在作用。     

葡萄糖浓度波动对人外周血内皮祖细胞增殖、凋亡及内皮型一氧化氮合酶活性的影响

目的 研究葡萄糖浓度波动对人外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖、凋亡及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响.方法 采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,经含血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和10%胎牛血清的M199培养基培养7 d,贴壁细胞鉴定为EPCs.细胞同化后给予葡萄糖浓度5.5 mmol/L(正常对照组)、30 mmol/L(糖浓度固定组)和20或40 mmol/L(平均浓度为30 mmol/L,波动间期为3 h,糖浓度波动组).干预6、12、24、48、96 h后,采用WST-1细胞增殖检测试剂盒处理细胞,酶标仪检测细胞增殖;以AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒处理细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以一氧化氮合酶检测试剂盒处理细胞,荧光酶标仪检测eNOS活性.结果 当平均浓度相同时,与糖浓度固定组相比,糖浓度波动组抑制EPCs增殖及eNOS活性的作用显著增强(P值均＜0.05),凋亡率显著增高(P＜0.05);糖浓度固定组与糖浓度波动组的增殖率、凋亡率、eNOS活性的差值与干预时间呈正相关(r值分别=0.937、0.927、和0.951,P值均＜0.05).结论 葡萄糖浓度波动作为独立因素促进EPCs的凋亡、抑制EPCs的增殖并降低eNOS的活性.EPCs对葡萄糖浓度波动的适应性差.     

雷帕霉素对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡和NO分泌的影响

目的:观察雷帕霉素对大鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPC)增殖、凋亡及一氧化氮(NO)分泌的影响.方法:密度梯度离心法获得SD雄性大鼠的骨髓EPCs,无菌条件下培养6 d;实验分为5组:对照组及不同浓度(0.1, 1.0,10,100 μg/L)雷帕霉素组.各组皆于24 h后收集标本,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,硝酸还原酶法检测培养液中的NO含量.结果:与对照组相比,1.0～100 μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs增殖及NO分泌,并诱导EPCs凋亡(P<0.05),具有浓度依赖性.结论:1.0～100 μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs的增殖及NO分泌,并诱导EPCs凋亡.     

双氢睾酮对人外周血内皮祖细胞增殖能力的影响

目的探讨双氢睾酮(DHT)对人外周血内皮祖细胞增殖能力的影响。方法采用密度梯度离心法从健康成年男性外周血获得单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白包被的培养板。培养7d后,经Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)及FITC标记的荆豆凝集素-I(FITC-UEA-I)荧光双染法鉴定正在分化的内皮祖细胞。采用人工计数法和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法观察浓度为0nmol/L(对照组),1nmol/L DHT组,10nmol/L DHT组,100nmol/L DHT组DHT对内皮祖细胞增殖能力的影响。结果与对照组相比,各浓度DHT组内皮祖细胞增殖能力明显增强,差异有统计学意义(P<0.01);随着DHT浓度的升高促进作用逐渐增强,但浓度达100nmol/L时DHT对内皮祖细胞增殖能力促进作用有所减弱,但仍明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论在一定浓度范围内,DHT可呈剂量依赖性增强内皮祖细胞增殖能力。     

脑出血事件应激对患者内皮祖细胞增殖能力和衰老的影响

目的 探讨脑出血事件应激对患者外周血来源的内皮祖细胞增殖能力和衰老的影响.方法 诱导分化脑出血急性期和基础疾病与其相同的对照组患者的内皮祖细胞,检测两组内皮祖细胞增殖能力、集落、细胞计数和衰老情况并进行对比研究.结果 脑出血事件应激组内皮祖细胞增殖能力较对照组增强(0.270±0.074,0.185±0.050,t=3.802),集落[(5.10±0.79)个/高倍视野,(1.90±0.41)个/高倍视野,t=14.407]和细胞计数[(75.15±10.48)个/高倍视野和(57.10±9.28)个/高倍视野,t=5.157]增加,两组相比差异均具有统计学意义(P＜0.01);但2组内皮祖细胞衰老[(45.54±5.74)个/100细胞和(46.86±5.06)个/100细胞,t=0.686]差异无统计学意义(P＞0.05).结论 脑出血事件应激可增强内皮祖细胞的增殖能力,但并不能改变患者内皮祖细胞易于衰老的转归.     

老年性耳聋患者内皮祖细胞增殖和衰老变化及其意义

目的 探讨体外培养的老年性耳聋患者外周血来源的内发皮祖细胞的增殖和课衰老变化情况及其临床意义.方法 测定培养7d的老年性耳聋患者和对照组健康老年人内皮祖细胞增殖能力、细胞集落数,比对两组培养14d时内皮祖细胞的衰老程序.结果 老年性耳聋组内皮祖细胞增殖能力为(0.154±0.042),对照组为(0.226±0.574),两者比较差异具有统计学意义(t=3.376,P=0.005<0.01);内皮祖细胞计数,老年性耳聋组为(54.32±9.24)个,对照组为(67.64±8.39)个,两者比较差异具有统计学意义(t=3.376,P=0.003<0.01);内皮祖细胞集落计数:老年性耳聋组为(1.40±0.37)个,对照组为(2.88±0.48)个,两组相比差异具有统计学意义(t=7.734,P<0.01);衰老细胞计数为:老年性耳聋组为(43.90±4.11)个,对照组为(39.76±4.01)个,两组相比差异具有统计学意义(t=2.280,P=0.035<0.05).结论 老年性耳聋患者内皮祖细胞增殖能力下降,易于衰老,可能是老年性耳聋血管退化的机理之一.     

内皮祖细胞增殖、迁移和黏附能力与端粒酶活性的关系

目的 观察体外培养外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖、迁移和黏附能力与EPCs端粒酶活性之间的关系.方法 密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞(MNCs),接种至明胶包被的培养板上,培养7 d后进行细胞免疫组化鉴定EPCs,采用MTT比色法、Transwell小室和黏附能力测定实验,观察EPCs的增殖、迁移和黏附能力.TRAP-PCR银染法检测EPCs端粒酶活性.结果 从人外周血能成功分离EPCs细胞.从冠心病患者分离的EPCs增殖、迁移、黏附能力较非冠心病患者下降.冠心病患者EPCs端粒酶活性较非冠心病患者低.结论 冠心病患者EPCs功能显著减弱.可能与EPCs端粒酶活性降低有关.     

两种内皮祖细胞成血管能力的比较

目的:比较高增殖潜能内皮祖细胞(HPP-EPCs)和循环成血管细胞(CACs)两种内皮祖细胞的成血管能力.方法:利用基质胶上毛细血管样结构的形成实验比较两种细胞的体外成血管能力;利用免疫缺陷的无胸腺裸鼠建立后肢缺血模型评价两种细胞移植后体内促进新生血管形成的能力;并利用荧光标记示踪的方法研究移植的内皮祖细胞能否整合入新生的毛细血管中.结果:HPP-EPCs形成的毛细血管样结构数明显高于CACs(28.6±15.8vs4.7±3.4,P＜0.01).内皮祖细胞移植能增加肢体的保留比例,减少肢体脱失率,促进缺血肢体的血流恢复,而且HPP-EPCs移植组的增加程度较CACs移植组的为高.HPP-EPCs和CACs移植组的毛细血管密度均高于对照组(P＜0.001),且HPP-EPCs高于CACs移植组(P＜0.01).结论:HPP-EPCs较CACs具有更强的成血管能力.     

β-榄香烯对肿瘤细胞上清液诱导的大鼠骨髓来源内皮祖细胞增殖与凋亡的影响

目的观察β-榄香烯对肿瘤细胞上清液诱导的大鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)增殖与凋亡的影响,探讨β-榄香烯对EPCs参与肿瘤血管形成过程的作用。方法原代培养大鼠骨髓来源EPCs经胃腺癌细胞株SGC-7901培养上清液诱导EPCs 12h后,分为浓度效应组(β-榄香烯0、5、10、20mg.L-1干预48h)和时间效应组(20mg.L-1β-榄香烯干预0、12、24、48h)。检测各组EPCs的增殖和凋亡率。结果随着β-榄香烯剂量的增加和作用时间的延长,EPCs的增殖显著下降(P<0.05),当β-榄香烯浓度为5mg.L-1及作用时间为12h时,EPCs凋亡率变化不明显,当β-榄香烯浓度增加至10mg.L-1及作用时间延长为24h时,EPCs凋亡率显著上升(P<0.05)。结论β-榄香烯通过诱导EPCs的凋亡抑制其增殖,并可削弱EPCs在肿瘤血管发生中的作用。     

人外周血单个核细胞向内皮祖细胞及内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨体外分离、培养成人外周血单个核细胞,并将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞的方法.方法 密度梯度离心法提取人外周血单个核细胞,用含有生长因子的内皮培养基将其体外培养、定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞;分别用流式细胞技术及RT-PCR通过对内皮祖细胞及内皮细胞表面特异性抗原的检测进行细胞鉴定.结果 分离获得的单个核细胞培养7 d后形成梭状的内皮样细胞,部分细胞积聚成团形成克隆集落,流式细胞仪鉴定该细胞表达内皮祖细胞特异性抗原CD34、CD133及VEGFR.继续培养4周后细胞形成典型铺路石样改变,RT-PCR检测有成熟血管内皮细胞特异性基因vWF、eNOS表达.结论 可成功分离人外周血单个核细胞,并可将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟内皮细胞.     

原发性高血压对循环内皮祖细胞的影响

目的探讨原发性高血压和循环内皮祖细胞(CEPCs)的关系及血压控制对CEPCs的影响。方法选取原发性高血压患者30例,包括血压未控制者和血压控制达标者各15例,并选取15例健康成人为正常对照。采集外周血进行CEPCs的分离、培养,测定CEPCs的数量、增殖能力、黏附能力及凋亡率,并进行比较分析。结果血压控制达标组和血压未控制组的CEPCs数量、凋亡率、增殖能力和黏附能力与正常对照组间差异均有统计学意义(P<0.01);血压未控制组与血压控制达标组的CEPCs数量、凋亡率、增殖能力间差异均有统计学意义(P<0.01),黏附能力间差异无统计学意义(P>0.05)。结论原发性高血压患者CEPCs受损;在规范服用降压药物控制血压达标的基础上,联合应用能够增加CEPCs数目、改善其功能的药物,可能会使原发性高血压患者获取降压外的效益。     

百里醌对内皮祖细胞的抑制作用

目的探讨百里醌对人脐血来源的内皮祖细胞血管生成的抑制作用及其可能机制。方法采用贴壁选择法培养人脐血内皮祖细胞(EPCs),DiI-ac-LDL吞噬试验及VEGFR-2、Ⅷ因子和CD34细胞免疫组化证实细胞属性;百里醌作用EPCs后,CCK-8法检测细胞增殖;Transwell小室实验测定EPCs体外侵袭能力;小管形成实验检测EPCs体外小管形成能力;Western blotting检测EPCs中MMP-2和MMP-9蛋白表达。结果体外成功培养出人脐血内皮祖细胞,百里醌可显著抑制体外EPCs增殖,IC50=51.2nmol/L;百里醌可抑制体外EPCs侵袭和小管形成,呈浓度依赖性;百里醌可显著下调EPCs中MMP-2和MMP-9的表达。结论百里醌可能通过抑制EPCs中MMP-2和MMP-9的表达从而抑制EPCs参与的血管生长,从而有望作为有效的血管生成抑制药物。     

血管内皮祖细胞与脑血管性疾病

血管内皮祖细胞(EPCs)是成熟血管内皮细胞的前体细胞,也称为成血管细胞,来源于骨髓,可以特异性地归巢于血管新生组织,且分化和增生为成熟内皮细胞的一群干细胞群体。EPCs可以通过特定方式分离,现已发现多种表面标志物,但均缺乏特异性。影响EPCs功能和数量的因素包括内源性因素和外源性因素(如药物、某些疾病和烟酒史等)。随着EPCs的深入研究,已证实EPCs是血管内皮功能的生物学标志,与某些脑血管疾病(如脑卒中、偏头痛和脑白质病变等)有着密不可分的关联。     

内皮祖细胞的培养与扩增研究进展

内皮祖细胞移植已经成为治疗缺血性疾病的一种新策略,但内皮祖细胞数量不足成为限制其治疗应用的主要障碍。如何培养和有效扩增内皮祖细胞具有十分重要的意义。内皮祖细胞获取的方法繁多,他汀类药物、雌激素、促红细胞生成素等对增加内皮祖细胞数量有着积极的作用,现就此内容进行综述。     

胰岛素对人外周血内皮祖细胞凋亡的影响

目的:研究不同浓度的胰岛素对体外培养条件下的健康人外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)凋亡的影响。方法:经密度梯度离心法分离出健康成年人外周血中的单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),在体外诱导分化后,用Dil-acLDL和FITC-UEA-1双染色鉴定为内皮祖细胞。观察不同浓度的胰岛素对将所获取的内皮祖细胞凋亡的影响。结果:20mU/L胰岛素干预组较对照组的的凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);200mU/L及2000mU/L胰岛素干预组较对照组的凋亡率差异有统计学意义(P<0.05),且2000mU/L胰岛素干预组的凋亡率随着干预时间的延长而增加(P<0.01)。结论:高浓度胰岛素可增加体外培养的人外周血内皮祖细胞的凋亡,并且这种影响呈时间依赖性。     

小鼠异基因造血干细胞移植中清髓照射对供者来源内皮祖细胞归巢的影响

目的 研究异基因造血干细胞移植预处理因素--清髓照射对供者来源内皮祖细胞(EPCs)归巢的影响. 方法 密度梯度离心和差速贴壁法获取小鼠骨髓单个核细胞,EGM-2培养基培养,5～7 d检测CD133+CD31+CD45low表面标记及吸食Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1鉴定,并行羟基荧光素=醋酸盐琥珠酰亚胺酯(CFSE)标记.实验分组:正常组,正常+EPCs移植组,照射组,照射+EPCs移植组.流式细胞术(FCM)分析外周血、脾脏和骨髓中内皮细胞(ECs)、EPCs和CFSE阳性细胞比例;病理、电镜和免疫荧光分析各组织的损伤情况及CFSE标记EPCs的分布. 结果 流式细胞术鉴定内EPCs为CD45lowCD133+CD31+;Dil-ac-LDL+、FITC-UEA-1+.照射后短时间内循环中ECs即开始升高,第5 d达高峰,持续到第7 d,与正常组相比差异有统计学意义 (P<0.05);循环中EPCs照射后短时间内也增加,于第4 d达到峰值,随后下降至正常水平,其增加与正常组相比差异有统计学意义 (P<0.05).照射后3 d光镜下肝脏弥漫性的炎症浸润,小肠大量炎症细胞浸润;电镜下肝脏中血小板聚集到内皮下暴露的胶原上,小肠中ECs和基底膜间被损坏.照射+EPCs移植组,荧光显微镜下观察,移植后3 h见CFSE阳性细胞归巢至损伤的肝脏和小肠,细胞少且不连续; 36 h细胞较多,且呈连续性.结论 移植预处理中的清髓照射可引起严重的内皮损伤, 该损伤启动了EPCs的动员,并驱动外源性EPCs归巢至损伤比较重的组织中.     

人脐血内皮祖细胞体外诱导分化的研究

目的研究从人脐血中诱导分化出内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,并对此类细胞进行鉴定。方法术中取健康产妇的新鲜脐静脉血,采用淋巴细胞分离液梯度离心法分离出单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）,应用添加诱导因子的培养基于体外诱导分化,观察细胞生长状态。培养7d后将贴壁细胞与含Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1的培养基进行孵育并于荧光显微镜下观察,流式细胞仪检测培养细胞表面分子CD34及CD133的阳性率,RT-PCR检测培养细胞表达VEGFR-2mRNA。结果体外诱导7d后90%以上贴壁细胞摄取Dil-ac-LDL呈红色荧光和FITC-UEA-1呈绿色荧光双阳性。流式细胞仪检测CD34及CD133阳性细胞分别为（50.48±5.17）%和（19.12±4.37）%。RT-PCR检验培养细胞VEGFR-2mRNA呈阳性。结论采用密度梯度离心法从人脐血中提取MNCs在体外经诱导分化可以形成EPCs。     

大鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的建立体外分离培养及鉴定大鼠骨髓来源内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）的方法。方法采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离得到骨髓单个核细胞,并结合差时贴壁法,收集24h后未贴壁细胞,然后用添加有多种细胞因子的内皮细胞基础培养基（endothelial basal medium,EBM-2）诱导培养获取EPCs。通过形态学观察、CD133和VEGFR-2抗体免疫荧光染色并结合FITC-UEA-1和Dil—ae—LDL的摄取功能来对EPCs进行鉴定分析,同时通过体外管样结构形成能力对EPCs进行功能性评价。结果在EBM-2培养基中诱导培养7d后,出现类似于血岛样的细胞集落,集落中央的细胞呈圆形,周边的细胞呈放射状;80％以上的细胞都是CD133＋／VEGFR＋2＋细胞,并且这些细胞同时能够摄取Dil-ac—LDL和结合FITC-UEA-1;EPCs在基质胶表面形成管腔样结构。结论密度梯度离心法结合差时贴壁法从骨髓中分离获得的单个核细胞,然后经EBM-2条件培养基诱导培养可获得较高纯度的EPCs。