靶向转染纳米tPA基因预防狗冠脉搭桥术吻合口血栓形成和再狭窄的研究

目的探讨构建的白蛋白纳米组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因质粒超声微泡载体靶向转染心肌组织预防冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。方法建立狗冠状动脉搭桥术吻合口再狭窄模型,制备tPA基因白蛋白纳米超声微泡,超声波靶向转染心肌并获得tPA表达,观察对吻合口局部血栓形成、血管内膜细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和PDGF-BmRNA表达以及内膜增生的影响。结果成功靶向心肌转染tPA基因并获得了tPA基因有效表达。显著减少了动脉搭桥吻合口血栓形成,抑制率100%。抑制冠状动脉吻合口处内膜细胞表达PCNA和PDGF-B mRNA。显著减少局部血管内膜厚度、内膜面积,使吻合口狭窄率减少68.29%。结论白蛋白纳米-超声微泡载体靶向转染tPA基因可预防狗冠状动脉搭桥术后吻合口血栓形成和再狭窄,这为人冠状动脉搭桥术吻合口血栓形成和再狭窄的防治提供实验基础。     

转染组织型纤溶酶原激活物基因质粒预防狗冠脉搭桥术吻合口再狭窄

目的探讨应用组织型纤溶酶原激活物（tPA）基因质粒预防冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。方法建立狗冠状动脉搭桥术吻合口再狭窄模型,构建tPA基因质粒并制备tPA基因缝线,在冠状动脉搭桥术同时以超声波辅助转染心肌细胞和吻合口血管平滑肌细胞,采用常规病理、免疫组织化学、原位杂交以及形态测量方法观察对吻合口局部血栓形成、血管内膜细胞增殖细胞核抗原（PCNA）和PDGF-BmRNA表达以及内膜增生的影响。结果成功转染tPA基因并显著抑制血管内膜细胞表达PCNA和PDGF-BmRNA,抑制率分别为75.16%和87.01%;显著减少局部血管内膜厚度、内膜面积和吻合口血栓形成,使吻合口狭窄率显著减少70.30%。结论转染tPA表达质粒在可抑制猪实验性冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄,这为冠状动脉搭桥术后再狭窄的防治提供实验基础。     

纳米tPA基因和PDGF-B小干扰RNA预防兔实验性再狭窄

目的 探讨联合应用纳米组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因质粒和血小板衍化生长因子B(PDGF-B)小干扰RNA预防血管再狭窄.方法 建立兔髂动脉再狭窄模型;构建壳聚糖纳米tPA基因载体和PDGF-B siKNA表达载体并在球囊损伤髂动脉同时在超声波的辅助下转染血管壁细胞和血管周围骨骼肌组织.实验分4组.对照组:单纯行内膜剥脱术;实验组A:内膜剥脱术+纳米tPA质粒;实验组B:内膜剥脱术+PDGF-B sigNA质粒;实验组C:内膜剥脱术+纳米tPA质粒+PDGF-B siRNA质粒.采用常规病理、免疫组织化学、原位杂交以及形态测量方法 观察对再狭窄血管血栓形成、血管内膜细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和PDGF-B mRNA表达以及血管病变的影响.结果 成功转染tPA基因和PDGF-B mRNA小干扰RNA;两种基因单独应用和联合使用均显著抑制血管内膜细胞表达PCNA和PDGF-B mRNA;显著减少内膜厚度、内膜面积;使吻合口狭窄率显著减少实验A组54.12%、B组74.08%和C组79.09%.转染tPA基因组血管内血栓形成显著减少.联合应用两种基因效果优于单独使用.结论 联合应用纳米tPA基因和PDGF-B mRNA小干扰RNA在一定程度上抑制实验性免髂动脉再狭窄.     

超声靶向转染c-myc基因的反义肽核酸抑制兔髂动脉平滑肌细胞增生的实验研究

目的观察制备的白蛋白超声微泡载c-myc原癌基因反义寡肽核酸靶向转染血管内膜平滑肌细胞的效果及对受损血管内膜增生的影响。方法用球囊导管剥脱兔髂动脉内皮细胞制备血管内膜平滑肌细胞增生模型;设计合成针对兔c-myc m RNA原癌基因反义PNA,并将其5’-氨基端以生物素分子标记;采用白蛋白作为原料,在制备超声微泡过程中向白蛋白溶液中加入定量PNA制备白蛋白超声微泡-PNA靶向载体,在超声场的作用下转染局部血管壁细胞;用免疫组织化学法检测PNA转染效果并观察其对血管内膜平滑肌细胞表达增殖细胞核抗原的影响;血管形态测量法直接测量局部血管内膜厚度和面积并评价其对内膜增生的影响。结果超声波介导白蛋白超声微泡载c-myc反义PNA靶向转染受损血管壁获得成功并有效抑制血管内膜平滑肌细胞表达PCNA和内膜增生。结论白蛋白超声微泡携带PNA靶向转染方法为促进其进入体内特定细胞发挥功效提供又一可行途径。     

PDGF-β mRNA反义寡核苷酸抑制兔血管内膜损伤后血管平滑肌细胞增生

目的 以PDGF-β的反义寡核苷酸作为药物抑制血管平滑肌细胞表达PDGF-βmRNA和增生,为反义药物预防经皮血管内膜成形术后再狭窄提供实验依据.方法 用球囊导管损伤兔髂动脉内膜建立再狭窄模型,于内膜损伤后1周观察血管平滑肌细胞表达PDGF-β mRNA和增殖细胞核抗原的情况.结果 计数200个内膜细胞中的PCNA阳性反应的细胞数,与对照组相比,反义药物显著抑制内膜平滑肌细胞表达PCNA,抑制率为93.44%(P＜0.001).显微镜高倍视野下(400X)计数血管内膜每平方毫米中的PDGF-βmRNA阳性细胞的平均数,与对照组相比,反义药物显著抑制内膜平滑肌细胞表达PDGF-β mKNA,抑制率为88.40%(P＜0.001).结论 根据不同种属PDGF-β的同源性设计的反义药物显著下调血管内膜表述PDGF-β mRNA并可抑制血管内膜增生,这为临床应用反义寡核苷酸防治经皮血管内膜成形术后再狭窄提供实验依据.     

γ干扰素抑制兔平滑肌细胞PDGF-β mRNA原位表达和球囊扩张术后再狭窄

目的　阐明干扰素γ (IFN γ)抑制血管内膜增生和防治经皮冠状动脉成形 (PTCA)术后再狭窄的体内机制。方法　建立兔再狭窄血管模型 ,动态观察体内给予重组干扰素γ (IFN γ)对损伤后不同时期血管内膜平滑肌细胞(vSMCs)原位表达血小板源性生长因子 βmRNA (PDGF βmRNA)和增殖细胞核抗原 (PCNA)的影响。结果　重组IFN γ显著抑制一周和四周时内膜vSMCs表达PCNA ,抑制率分别为 88 50 %和 58 89% ;显著抑制新生内膜细胞PDGF βmRNA的表达 ,抑制率分别为一周 91 4 5% ,二周 93 6 6 %和四周的 52 92 %。结论　球囊损伤后血管局部vSMCs自泌性产生PDGF β是导致内膜vSMCs增殖和内膜病变形成的主要原因之一。IFN γ通过下调vSMC原位表达PDGF βmRNA抑制这一过程 ,可能用于临床再狭窄的防治。     

PTEN基因对兔血管再狭窄的影响及其机制探讨

目的:探讨联合应用PTEN基因转染兔预防血管再狭窄及其发生机制。方法:建立兔腹主动脉再狭窄模型;构建PTEN表达载体并在球囊损伤腹主动脉同时转染血管壁细胞。实验分3组。对照组:单纯行内膜剥脱术;实验组A:内膜剥脱术+PTEN真核质粒;实验组B:内膜剥脱术+空脂质体。采用常规病理、免疫组织化学、以及形态测量方法观察对再狭窄血管病变的影响及血管内膜细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和MMP-9蛋白的表达。结果:成功转染PTEN基因组显著抑制损伤后4周内膜VSMCs表达PCNA,与对照组相比PCNA表达和MMP-9的水平明显受抑制(P<0.01);显著减少血管内膜厚度和面积。结论:PTEN基因转染在一定程度上可抑制实验性兔腹主动脉再狭窄。     

联合转染VEGF和PCNA-ASODN对血管成形术后再狭窄的影响

目的探讨联合转染血管内皮生长因子(VEGF)基因和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸(PCNA-ASODN)对血管成形术后再狭窄的影响。方法 32只新西兰纯种大白兔随机平均分为对照组、转染VEGF组、转染PCNA-ASODN组、联合转染VEGF和PCNA-ASODN组(联合转染组)。构建兔的股髂动脉球囊损伤术后再狭窄模型,以医用生物蛋白胶作为缓释载体,将300μg PCNA-ASODN或VEGF均匀喷布于处理血管段外膜。取损伤处理血管段标本,光学显微镜观察损伤血管内膜、中层结构和局部血栓形成情况;电子显微镜观察新生内膜内皮细胞及内膜、中膜,计算内膜/中膜(I/M)面积比与厚度比;采用RT-PCR法检测VEGF与PCNA基因的表达,采用免疫组化从蛋白质水平检测VEGF与PCNA的表达。结果联合转染组与其他组相比,其血管内皮较完整、光滑,内膜轻度增生,平滑肌细胞排列规则,外膜无明显变化;I/M面积比与厚度比明显较低(P<0.05);RT-PCR检测VEGF表达水平明显升高(P<0.05);免疫组化检测血管组织中VEGF蛋白表达阳性率较高(P<0.05)。结论联合转染VEGF和PCNA-ASODN能更有效地抑制球囊损伤术后的血管内膜增生和再狭窄的发生。     

联合转染eNOS基因和反义ET核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

目的：探讨联合转染eNOS基因和反义ET核酸对自体移植静脉内膜增生的影响。方法：制作20只自体颈静脉腹主动脉移植Wistar大鼠模型，实验组、对照组各10只，实验组移植血管行腺病毒介导的eNOS溶液泡和反义ET核酸凝胶涂布，对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布。要后2周取出植物血管，利用病理学、免疫组织化学、RT－PCR方法检测移植血管内膜厚度、管腔狭窄度、内膜VSMC数及PCNA阳性表达、血管ETmRNA、eNOS、mRNA表达情况。结果：实验组移植血管内膜厚度、管腔狭窄度及VSMC数均较对照组减小或减少，PCNA阳性表达及ETmRNA表达较对照组减少，而eNOSmRNA表达则明显增加。结论：联合传染eNOS基因和反义ET核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生，是一种有效的防治移植静脉再狭窄的基因疗法。     

实验性动脉内膜损伤后抑制血管平滑肌细胞增生的研究

目的 :观察血管内膜损伤后 c- m yc反义 RNA在抑制血管平滑肌细胞 (VSMC)增生、迁移及防止动脉粥样硬化形成和血管再狭窄中的作用。方法 :选雄性日本大白兔 36只 ,经球囊造成腹主动脉内膜损伤的同时 ,局部给予 c- myc反义 RNA、正义 RNA及盐水 ,高胆固醇喂养 12周处死。测量内膜厚度 ,计数增殖细胞核抗原 (PCNA)阳性细胞数。结果 :盐水及正义 RNA对照组动脉内膜明显增厚 (317μm) ,PCNA阳性细胞数明显增多 (6 2 % ) ,可见明显的粥样斑块灶形成。而反义 RNA治疗组内膜增厚度为 2 17μm,PCNA阳性细胞为 30 .5 % ,明显低于对照组 (P <0 .0 1)。结论 :c- myc反义 RNA具有显著抑制 VSMC增生 ,减轻粥样斑块形成的作用。     

巴曲酶对犬颈总动脉人工血管旁路术后远端吻合口内膜增生的影响

目的 研究人工血管旁路术后远端吻合口局部内膜增生的形态学表现、部分炎症因子及生长因子的表达及药物巴曲酶对其的影响.方法 建立12只犬左颈总动脉膨体聚四氟乙烯(eVrrE)人工血管旁路移植模型,随机分为巴曲酶组和对照组,28 d后吻合口局部取材,应用HE、Masson染色、免疫组化(IHC)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹(Western Blot)等实验方法 观察吻合口内膜厚度、胞外基质(ECM)相对含量、新生内膜平滑肌细胞增殖率及单核细胞趋化蛋白.1(MCP-1)、血小板源牛长因子B(PDGF-B)mRNA和蛋白表达,并用半定量方法 比较两组间的差异.结果 术后28d,远端吻合口均已形成有内皮细胞(EC)覆盖的新生内膜,且均表达MCP-1及PDGF.B.实验组与对照组相比,其吻合口新生内膜厚度明显减少[(381.3±144.7)μm对(213.8±29.0)μm,P=0.036],胞外基质相对含量明显降低(P=0.006),MCP-1表达量明显下降(RT-PCR P=0.025,Western Blot P=0.016),而PDGF-B表达量差异无统计学意义(RT-PCR P=0.055,WesternBlot P=0.337),平滑肌细胞增殖率无明显差异(P=0.109).结论 巴曲酶可抑制人工血管旁路术后早期吻合口新生内膜胞外基质的沉积和MCP-1的表达,抑制新生内膜厚度,为提高人工血管移植远期通畅率提供新的临床应用及研究思路.     

Interferon-γ inhibits in situ expression of PDGF-β mRNA by smooth muscle cells in injured rabbit arteries after transluminal balloon angioplasty

Objective To elucidate the mechanism of interferon-gamma (IFN-γ) to inhibit the resten osis after successful percutaneous transluminal angioplasty (PTA). Methods A rabbit vascular restenotic model was constructed and the proliferation of inti mal smooth muscle cells (SMCs) were observed by monitoring their expression of p roliferating cell nuclear antigen (PCNA) and platelet-derived growth factor β chain mRNA (PDGF-β mRNA) at the indicated time points.Results IFN-γ could significantly inhibit the expression of PCNA by intimal SMCs one w eek after denudation, when counting 200 intimal cells for PCNA-positive reactio ns with an inhibitory rate of 88.50% (P&lt;0.001). IFN-γ could downregulat e in situ expression of PDGF-β mRNA by these cells as we calculated the averag e number of PDGF-β mRNA positive cells per square millimetre area at ×400 mag nification with reduced rates of 86.85% in 1 week group (P&lt;0.001), of 93. 66% in 2 week group (P&lt;0.001) and of 52.92% in 4 week group (0.02&lt; P&lt;0.05), respectively. Conclusions The local production of PDGF-β by vascular intimal SMCs via an autocrine mecha nism may be responsible for continuous proliferation of these cells and the form ation of neointima after injury. This could be inhibited by IFN-γ through dow nregulating the expression of PDGF-β mRNA. These results provide an in vivo b asis for IFN-γ to be used clinically for the management of restenosis after pe rcutaneous transluminal angioplasty.     

C-myc siRNA抑制大鼠自体移植静脉再狭窄的研究

目的静脉移植术后c-myc基因持续高表达是导致血管内膜增生进而再狭窄的原因之一。文中探讨通过局部给药方法给予针对c-myc基因的小分子干扰RNA(siRNA)对自体移植静脉内膜增生的影响。方法建立SD大鼠自体颈外静脉-颈总动脉移植模型。32只大鼠按移植静脉外膜局部给药不同处理方式方法分为未处理组(No treatment组)、凝胶组(Gel组)、无义序列组(scramble sequence group,SCR组)、c-myc RNA干扰组(C-myc siRNA组),于术后3周处死大鼠取移植静脉,光学显微镜下测量内膜厚度,免疫组化染色检测移植静脉增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、c-myc蛋白的表达,Q-RT-PCR检测移植静脉c-myc mRNA的含量。结果 C-myc siRNA组内膜厚度[(15.0±2.2)μm]显著低于No treatment组[(58.3±8.3)μm]、SCR组[(60.5±6.1)μm]和Gel组[(63.5±5.4)μm]。C-myc siRNA组静脉内膜区和中膜区PCNA阳性细胞率显著低于SCR组[分别为(8.4±2.2)%vs(68.5±5.0)%,P<0.05和(15.0±3.1)%vs(55.2±7.5)%,P<0.05],c-myc蛋白阳性细胞率C-myc siRNA组显著低于SCR组[(30.6±2.6)%vs(48.5±3.5)%,P<0.05]。C-myc siRNA组移植静脉中c-myc mRNA的表达相对量显著低于SCR组(0.48±0.05 vs 1.00±0.12,P<0.05)。结论C-myc siRNA能抑制移植静脉中平滑肌细胞的增殖,抑制内膜的增生,减轻移植静脉再狭窄程度。     

全反式维甲酸对球囊损伤动脉后新生内膜形成及平滑肌细胞PCNA表达的影响

①目的　观察全反式维甲酸 (atRA)对球囊损伤大鼠主动脉内皮后内膜增生及血管平滑肌细胞增殖细胞核抗原 (PCNA)表达的影响 ,探讨atRA对PTCA术后再狭窄的防治作用及其机制。②方法　 5 6只大鼠随机分为假手术组、损伤组、atRA组 ,分别于术后 2、7、1 4d取实验动脉段 ,常规病理切片、苏木精 伊红染色 ,测定管腔及新生内膜面积 ,免疫组化法测定PCNA的表达水平。③结果　atRA组较损伤组 (7、1 4d时 )新生内膜横截面积明显减少 (t=3.96、- 6 .98,P <0 .0 1 ) ,内膜 /中膜横截面积比显著下降 (t=4 .2 1、- 6 .79,P <0 .0 1 ) ,在 1 4d时管腔面积明显扩大 (t=3.98,P <0 .0 1 )。PCNA于损伤后 2d在中膜见表达 ,随后表达渐少 ;损伤后 7d ,在内膜中有表达 ;1 4d可见向管腔表面聚集现象。atRA组较损伤组PCNA阳性表达指数显著下降 (t =7.2 0～ 1 5 .39,P <0 .0 1 )。④结论　atRA能抑制PCNA的过表达 ,抑制细胞周期进程 ,从而抑制内膜增生、防治再狭窄     

静脉移植桥血管内膜PCNA蛋白的表达

目的 :研究PCNA对冠脉动脉旁路移植术再狭窄的作用。方法 :2 5只健康纯种新西兰大耳白兔将按体重随机分五组 ,每组 5只。将颈外静脉间置于同侧颈总动脉 ,分别在术后 6h ,2d ,7d ,14d ,2 8d取材。应用免疫组织化学染色法和形态学分析观察不同时间PCNA阳性细胞数的表达 ,采用计算机图象分析法测量管腔内膜 ,中膜厚度及其比值。结果 :实验过程中无实验动物死亡。吻合口完成时各吻合口均通畅。 7d内膜和中膜厚度较 6h明显增厚 ,有显著性差异 (P <0 .0 1) ;在 14d、2 8d时内膜和中膜厚度较 7d没有明显变化 ,无显著性差异 (P >0 .0 5)。移植后 6h至 7d ,在血管平滑肌细胞 (VSMC)中 ,PCNA蛋白逐渐增多 ,于 7d达高峰 (P <0 .0 1)。移植后 14d ,2 8d在VSMC中PCNA蛋白开始下降 ,与 7d相比差异有显著意义 (P <0 .0 1)。结论 :PCNA阳性细胞数在移植后 7d达高峰。与内膜增殖的高峰期相吻合 ,提示PCNA蛋白表达与内膜增殖有密切联系 ,可做为一个早期反应血管损伤后内膜增殖的指标。PCNA蛋白的表达对冠脉动脉旁路移植术再狭窄起着重要作用     

针对Egr-1mRNA的10-23脱氧核酶抑制大鼠动脉损伤后内膜增生的研究

目的探讨针对Egr-1mRNA的10-23脱氧核酶对大鼠动脉损伤后内膜增生的影响和可能的机制。方法制备大鼠颈动脉球囊损伤模型,96只大鼠随机分为4组,A组为假手术组;B组为1mmol/LMgCl2对照组;C组为FuGENE6对照组;D组为FuGENE6介导的ED5转染组;每组再按术后3,7,14和21d,分为4个亚组,每组6只。术后3、7、14、21d各处死每组动物6只,分别应用RT-PCR和Western-blot技术检测血管组织Egr-1mRNA水平及蛋白合成情况;HE染色观察损伤血管内膜的增生情况;免疫组织化学染色观察PCNA的表达。结果与B组和C组比较,D组各时间点血管内膜、中膜的厚度和管腔的狭窄率均显著减小(P<0.01);正常血管组织有微量Egr-1表达,术后Egr-1mRNA和蛋白水平逐渐增高,而D组血管组织E-gr-1mRNA和蛋白水平较B组和C组均降低(P<0.01);免疫组织化学染色显示,术后3dPCNA表达开始增加,7d达高峰,14d开始下降,D组血管壁PCNA阳性细胞百分比明显低于B组和C组(P<0.01)。B组和C组之间相比较,以上各指标差异均无显著性(P>0.05)。结论ED5可能通过抑制Egr-1和PCNA的表达,而减轻血管损伤后内膜增生。     

局部缓释紫杉醇抑制犬人工血管移植术后吻合口内膜增生的初步研究

目的 探索预防周围动脉人工血管旁路移植术（VGB）后吻合口内膜增生（IH）性再狭窄的新方法。方法 取大型杂种犬5只,全麻后行双侧髂股动脉VGB,并结扎、切断人工血管桥之间的自体动脉。同一犬随机选取一侧人工血管（VG）及远近端吻合口喷紫杉醇．生物蛋白胶（FG）混合物,另一侧喷FG作为对照。4周后取出两侧包括远近端吻合口在内的VG,对吻合口进行肉眼、病理组织学及电镜检查,测量内膜厚度及内膜面积,并进行免疫组化检查。结果 5只实验犬两侧VG均通畅,远近端吻合口可见新生内膜。实验侧吻合口新生内膜厚度和内膜面积均显著小于对照侧（P〈0．05）。扫描电镜检查示：实验侧吻合口可见覆盖一层完整的内皮细胞（EC）,EC排列规则整齐,其表面有较少血液成分附着。对照侧EC排列不规则,并见大量血液成分附着。吻合口新生内膜透射电镜检查示：对照侧细胞丰富,细胞类型单一,主要为典型的平滑肌细胞（VSMC）;基质为规则密集排列的胶原纤维。实验侧可见多种类型的细胞;基质中胶原纤维稀疏,并可见大量异物颗粒。结论以FG作为载体,在VG吻合口外局部应用小剂量紫杉醇可以起到抑制吻合口IH的作用。紫杉醇能够从吻合口外渗透至吻合口内,并能在内膜中停留至少4周以上。近期安全有效。