精神分裂症病人外周血差异表达miRNA-181b的生物信息学分析

目的对精神分裂症病人外周血中差异表达的miRNA-181b进行靶基因、转录因子和信号通路的分析。方法采用DIANA-TarBase数据库分析miRNA-181b靶基因,应用DIANA-miPath V.3软件对miRNA-181b的靶基因进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析,运用DIANA-miRGen v3.0数据库分析miRNA-181b的转录因子。结果miRNA-181b靶基因共1 344个,其中显著表达的共有靶基因是ARHGAP11A、PPA1、YY1和ZC3H12B;miRNA-181b的靶基因广泛参与生物学过程的调节,包括分子功能、RNA结合、细胞组成等过程;KEGG生物信息学分析发现miRNA-181b的靶基因富集了12条信号通路,包括hippo信号通路、p53信号通路、HIF-1信号通路、赖氨酸的降解等;与miRNA-181b显著关联的转录因子有7个,其中JUN、EGR1、MEF2C与精神分裂症有显著关联。结论对精神分裂症病人外周血中差异表达的miRNA-181b进行生物信息学分析,发现了多个靶基因、信号通路和转录因子与精神分裂症的发病有密切关联。     

精神分裂症断裂基因1与精神疾病

精神分裂症断裂基因(DISC)位于在一个苏格兰大家系中发现的t(1;11)(q42.1;q14.3)平衡易位的断裂点上,在这个基因座上发现了2个基因,由于精神分裂症在该家系中高发,所以将它们命名为DISC1和DISC2。目前,很多研究结果支持DISC基因座与精神分裂症、双相情感障碍、重症抑郁等精神疾病的易感性有关。在这2个基因中,DISC1被认为最可能是精神疾病的易感基因,因为易位直接破坏了它所编码的蛋白序列。现就DISC1研究的新进展及其可能的致病机制予以简要综述。     

真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6 P-1-GST-PTEN构建

目的构建人第10号染色体缺失的磷酸酶（PTEN）真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN,研究PTEN融合质粒生物学效应。方法根据基因库中PTEN序列,设计并合成相关引物。用基因重组技术将目的片段插入pCDNA3.1-Flag和pGEX-6P-1-GST空载质粒中,通过PCR和DNA测序,鉴定插入基因序列。将pCDNA3.1-Flag-PTEN转染到HEK 293细胞,将pGEX-6P-1-GST-PTEN转到E.coli BL-21中,通过Western blotting和考马斯亮蓝染色法分别检测PTEN蛋白的表达。结果PCR显示目的基因插入成功;DNA测序显示插入序列与目的基因序列完全一致,无位点突变;Western blotting和考马斯亮蓝染色法证实融合质粒可以在生物体内正确表达。结论成功构建PTEN相关真核和原核融合质粒并正确表达,为PTEN在帕金森疾病中的机制研究奠定了基础。     

偏执型精神分裂症患者精神分裂症断裂基因 1 单核苷酸多态性研究简

目的 对偏执型精神分裂症患者精神分裂症断裂基因1（DISC1）单核苷酸多态性（SNPs）进行研究.方法 选我院自2010～2012年间收治的偏执型精神分裂症患者100例,作为观察组.同时,选自同期我院体检结果显示为健康的正常人共100例,作为对照组.对其DISC1中2个功能单核苷酸多态体位点使用基因分型芯片进行分型,探究患者疾病与多态性之间的联系.结果 两组精神指数对比具有显著差异性,两者具有统计学意义（P＜0.05）.结论精神分裂症和DISC1基因多态性之间存在密切联系,同时也是易感基因之一.     

偏执型精神分裂症患者精神分裂症断裂基因1单核苷酸多态性研究

目的 分析精神分裂症断裂基因1( DISC1)中的2个功能单核苷酸多态性(SNP)与精神分裂症关联性.方法 在河南省北部地区收集528名偏执型精神分裂症患者,并采用阳性和阴性症状量表(PANSS)评估患者的临床症状,在同一地域招募健康体检者528名作为对照,采用基因分型芯片对精神分裂症断裂基因1中的2个功能单核苷酸多态性位点进行基因分型,分析多态性与疾病的关联性.进一步分析PANSS因子分与DISCI多态性的关联.结果 关联分析显示rs3737597基因型(387∶133∶8,350∶ 164∶ 14;x2 =6.73,P=0.035)和等位基因频率(907∶149,864∶192;x2=6.16,P=0.013)分布病例和对照之间差异具有统计学意义,多重检验校正后等位基因频率(P=0.026)仍存在差异.两个单核苷酸多态性位点组成的单体型A-A和TA分布在病例和对照之间差异具有统计学意义(P=0 0046,P=0.032)rs821616不同基因型患者PANSS 阳性分(t=- 2.205,P=0.028)、妄想得分(t=-2.394,P=0.017)和情感交流障碍得分(t=-2.021,P=0.047)差异具有统计学意义.结论 DISC(1)基因多态性与精神分裂症存在关联,DISC1基因是精神分裂症的易感基因.     

DISC1基因过表达对星形胶质细胞质膜伸展的影响

目的 构建精神分裂症断裂基因1(Disrupted-In-Schizophrenia 1,DISC1)蛋白表达质粒,检测其过表达后对星形胶质细胞(Astrocytes,ASTs)质膜伸展的影响.方法 针对小鼠DISC1基因mRNA编码序列,设计合成可扩增全长引物;以小鼠脑白质cDNA为模板进行PCR扩增,构建全长表达质粒,命名为pEGFP-n1-DISC1.分别将过表达组pEGFP-n1-DISC1和空载体对照组pEGFP-n1电转染原代培养ASTs,以Western blot及免疫荧光染色检测DISC1-GFP融合蛋白的表达,利用Image-Pro Plus 5.0软件分析对照组与DISC1过表达组星形胶质细胞质膜伸展面积的大小.结果 成功从cDNA中扩增出DISC1编码序列并插入pEGFP-n1载体,双酶切和测序结果证实,DISC1蛋白编码序列插入载体,并能正确读码翻译.构建质粒转染ASTs 60 h后,可见DISC1-GFP融合蛋白表达;与对照组相比,DISC1过表达组ASTs的质膜伸展面积明显增加(P＜0.05).结论 成功构建小鼠DISC1全长基因表达载体,DISC1基因过表达后可促使ASTs质膜伸展面积增加.     

MicroRNA-29b-3p重组腺相关病毒制备及在大鼠前额叶皮质中的表达研究

目的获得表达microRNA-29b-3p 的重组腺相关病毒（rAAV-miR-29b-3p）,并检测其在大鼠前额叶皮质中的感染效果和表达水平。方法将前体miR-29b-3p 基因片段置入AAV 表达质粒中构建重组AAV质粒,将重组AAV 质粒、包装质粒和辅助质粒通过脂质体LipaFiterTM共转染HEK293 细胞包装rAAVmiR-29b-3p。从转染的HEK293 细胞中收集并通过树脂柱纯化rAAV-miR-29b-3p,通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定rAAV-miR-29b-3p滴度。通过脑立体定位仪注射rAAV-miR-29b-3p 至大鼠前额叶皮质,免疫荧光显微镜观察rAAV-miR-29b-3p的感染效果,qRT-PCR检测rAAV-miR-29b-3p表达水平。结果成功包装的rAAV-miR-29b-3p 经纯化后获得了高纯度的rAAV-miR-29b-3p,qRT-PCR检测rAAV-miR-29b-3p 的病毒滴度达到1.0×1012 vg/ml,经感染21 d后,脑组织前额叶皮质荧光表达明显,miR-29b-3p 表达水平明显提高。结论构建的rAAV-miR-29b-3p 可使大鼠前脑皮层miR-29b-3p 高表达,为进一步研究miR-29b-3p的生物学功能提供了有效工具。     

恶性疟原虫红内期p41-3基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

[目的]构建恶性疟原虫海南(FCC1/HN)株p41-3基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3;测定p41-3基因序列,并了解FCC1/HN株与其它分离株p41-3序列的差异.[方法]根据p41-3基因已知序列设计合成2对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增p41-3基因;将p41-3基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用酶切,PCR扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆.以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定p41-3基因序列,应用软件辅助分析p41-3序列及进行同源性比较.[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN株p41-3基因;正确的pcD-NA3-p41-3重组质粒被筛选和鉴定.测序表明,FCC1/HN株p41-3基因大小为2 137 bp,编码375个氨基酸.恶性疟原虫FCC1/HN株与FCBR株p41-3基因核苷酸序列同性为98.98%,编码氨基酸序列同源性为99.73%.[结论]从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中获取p41-3基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,并测定了FCC1/HN株p41-3基因的序列;FCC1/HN株与其它分离株p41-3基因有高度的同源性.     

恶性疟原虫红内期p41—3基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株p41-3基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,测定p41-3基因序列,并了解FCC1/HN株与其它分离株p41-3序列的差异。方法 根据p41-3基因已知序列设计合成3对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增p41-3基因;将p41-3基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用酶切,PCR扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆。以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定p41-3基因序列,应用软件辅助分析p41-3序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株p41-3基因;正确的pcDNA3-p41-3重组质粒被筛选和鉴定。测序表明,FCC1／HN株p41-3基因大小为2137bpo,编码375个氨基酸,恶性疟原虫FCC1/HN株与FCBR株p41-3基因核苷酸序列同性为98．98％,编码氨基酸序列同源性为99．73％。结论 从恶性疟原虫FCCl/HN株 基因组DNA中获取p41-3基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,并测定了FCC1／HN株p41-3基因的序列;FCC1／HN株与其它分离株p41-3基因有高度的同源性。     

KPNA1基因多态性与精神分裂症的关系

目的：探讨中国北方汉族人群中KPNA1基因上rs3762637位点单核苷酸多态性（SNP）与精神 分裂症的关系。方法：采用PCR技术和限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）的方法,检测101个精神分裂症核心家系(包括患者、父母)的基因型。结果：rs3762637基因型频率的分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ²=1.431,df=1,P=0.232; χ²=1.212,df=1,P=0.271);等位基因和基因型的频数分布在父母组和患者组中的差异均无显著性(χ²=0.957,P＝0.328; χ²＝3.547,P＝0.170);传递不平衡检验（TDT）显示,杂合父母传递给患病子女与未传递等位基因频数分布差异无显著性 （χ²=1.469,P=0.225）。结论：KPNA1基因上的rs3762637位点可能不是精神分裂症的易感位点。     

miR-181b-5p调节EGR1/BIM通路对ALL细胞增殖、凋亡和迁移的影响

探讨miR-181b-5p在急性淋巴细胞白血病（ALL）中的作用及其潜在的分子机制。方法 采用qRT-PCR检测四川大学华西医院2019年1月—2021年1月80例ALL患者miR-181b-5p和早期生长反应因子1（EGR1） mRNA的表达水平。分别使用miR-181b-5p模拟物、miR-181b-5p抑制物或（和）EGR1过表达质粒转染人ALL细胞系NALM-6细胞。采用MTT、流式细胞仪和划痕愈合实验检测miR-181b-5p对细胞增殖、凋亡和迁移的影响。通过双荧光素酶验证miR-181b-5p和EGR1的相互作用关系。Western blot检测细胞中EGR1蛋白和细胞增殖、凋亡和迁移相关蛋白的表达水平。结果 miR-181b-5p在ALL中表达显著上调,EGR1表达下调（P＜0.05）。抑制miR-181b-5p不仅抑制细胞增殖、迁移,诱导细胞凋亡,而且上调EGR1和BIM蛋白表达（P＜0.05）;上调miR-181b-5p则具有与之相反的效果（P＜0.05）。EGR1是ALL细胞中miR-181b-5p的靶基因（P＜0.05）。miR-181b-5p过表达可明显削弱EGR1过表达对ALL细胞增殖、凋亡和迁移的影响（P＜0.05）。结论 抑制miR-181b-5p可通过靶向上调EGR1和BIM表达在ALL中抑制细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡     

miR-376b-3p对HepG2细胞Ⅱ相代谢酶UGT2B7的调控

目的:探讨miR-376b-3p对HepG2细胞Ⅱ相代谢酶UGT2B7的调控作用.方法:构建含有UGT2B7序列的重组质粒并进行双荧光素酶基因活性检测;利用荧光定量PCR技术检测miR-376b-3p对UGT2B7 mRNA表达的影响;使用蛋白印迹法检测miR-376b-3p对UGT2B7蛋白表达的影响.结果:与miR...     

构建人血管内皮生长因子cDNA逆转录病毒表达质粒

目的 :构建人血管内皮生长因子 ( VEGF) c DNA逆转录病毒表达质粒。方法 :采用 PCR方法从 pc DNA- VEGF165质粒中扩增 VEGF165基因 ,在序列两端分别引入 Eco R 和 Bam H 限制性内切酶识别位点 ,并克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中。结果 :酶切鉴定、PCR扩增以及DNA序列分析表明已经将 VEGF165基因全长序列克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中 ,获得了 p LXSN- VEGF165重组质粒。结论 :成功地构建了人 VEGF c DNA逆转录病毒表达质粒 ,为进一步临床应用 VEGF c DNA转基因治疗奠定了基础     

小鼠DVL3基因3'UTR荧光素酶报告载体的构建及其与miR-204靶向关系的验证

[目的]构建小鼠DVL3基因野生型及突变型重组荧光素酶报告质粒,验证miR-204与DVL3的靶向关系.[方法]采用生物信息学方法预测miR-204与DVL3基因的结合位点.采用PCR法扩增小鼠DVL3基因3'UTR片段,克隆至pGL3-con-trol载体,构建野生型及突变型重组荧光素酶报告质粒.293T细胞分为6组...     

博尔纳病病毒p40基因重组质粒的构建及鉴定

目的 构建博尔纳病病毒p40基因重组表达质粒.方法 通过PCR方法扩增获得博尔纳病病毒p40基因的完整序列,将此片段定向克隆到pEGFP-N1载体多克隆位点区,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用PCR方法和核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性.结果 成功构建博尔纳病病毒p40基因重组表达质粒.结论 本文构建的重组质粒将为研究博尔纳病病毒p40基因在真核细胞中的功能和作用提供实验依据.     

miR-27b-3p调控SMAD1对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭作用的影响

目的 寻找并验证miR-27b-3p和SMAD1的关系,探讨miR-27b-3p对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移作用的影响,为骨肉瘤靶向治疗提供理论依据。 方法 采用生物信息学方法预测候选靶基因;应用双荧光素酶报告实验确定miR-27b-3p和SMAD1靶向关系;采用qRT-PCR法选择SAOS-2骨肉瘤细胞系。采用miR-27b-3p转染SAOS-2细胞后,分为miR-27b-3p inhibitor组、空白对照组和阴性对照组。采用MTT、Transwell迁移和侵袭实验检测miR-27b-3p对SAOS-2细胞的影响;采用Western blotting法检测沉默miR-27b-3p后SMAD1的表达量。 结果 生物信息学检测显示,miR-27b-3p与SMAD1-UTR存在结合位点;双荧光素酶报告实验显示,miR-27b-3p inhibitor组SMAD1的表达量高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05),SMAD1是miR-27b-3p的靶基因。SAOS-2细胞MTT、Transwell迁移实验和侵袭实验结果均显示,miR-27b-3p inhibitor组与空白对照组和阴性对照组细胞数相比降低,差异有统计学意义(P<0.05),miR-27b-3p inhibitor组细胞的增殖、迁移和侵袭能力降低。miR-27b-3p inhibitor组与阴性对照组SMAD1蛋白表达量相比明显降低(P<0.05)。 结论 miR-27b-3p可以通过调控SMAD1的表达促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭作用。miR-27b-3p可能在骨肉瘤细胞中起着促癌基因作用。     

IL-35重组卡介苗的构建及鉴定

目的构建分泌性表达白细胞介素（IL）-35真核载体pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）-重组卡介苗（BCG）。方法在化学合成的IL-35基因片段中插入pBudCE4.1/GLS/OriM,将合成后序列插入到IL-12真核共表达载体pBudCE4.1/GLS/IL12/OriM的质粒酶切回收产物pBudCE4.1/GLS/OriM中,构建表达IL-35的穿梭/共表达质粒重组质粒pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）,再以重组质粒电转化到BCG,构建表达IL-35和BCG的重组pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG。结果重组质粒pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）经PCR扩增、测序鉴定,以及在CHO 293T细胞中表达产物的Western blotting检测,从转录和翻译水平对目标基因产物进行检测验证,pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG在细胞水平经抗酸染色验证,证实基因IL-35正确插入载体pBudCE4.1/GLS/OriM中,且pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG构建成功。结论重组质粒pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG可正确表达IL-35,为进一步研究IL-35功能及其应用价值奠定了良好的基础。     

人类p27kip1基因正、反义真核表达质粒的构建

目的：克隆人类p27^kip1基因，构建其正、反义真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人类伯基特淋巴瘤细胞株Raji中扩增出人类p27^kip1 cDNA全长序列，通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1真核表达载体上，构建p27^kip1正、反义表达质粒。通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27^kip1 cDNA。结论：本实验成功地克隆了人类p27kipl基因并构建了其正、反义真核表达质粒，为进一步研究p27^kip1在淋巴瘤发生中的意义奠定了基础。     

突变型P53的pSUPER-EGFP1 RNAi系统的构建

目的构建抑制突变型p53基因siRNA表达载体。方法化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向突变型p53基因的寡核苷酸(各58个碱基),退火,克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切后的pSUPER-EGFP1(pSG)载体的polⅢH1启动子的下游,重组构建RNAi质粒,同时设立非特异对照。构建好的干扰载体瞬时转染胃癌细胞SGC-7901,用RT-PCR检测其对突变型p53基因的抑制效果。结果重组构建的pSUPER-EGFP1-p53(pSG-p53i)载体经双酶切电泳分析及插入基因序列分析,58个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。RT-PCR显示pSG-p53i对突变型p53基因的表达具有较好的瞬时抑制作用。结论载体的成功构建,有助于深入研究其对突变型p53基因的稳定抑制作用。体内合成siRNA的方法,可将RNAi技术用于细胞培养和哺乳动物研究。