心肌成纤维细胞Wnt信号通路在高糖环境下的调控变化

目的:观察乳鼠心肌成纤维细胞在高浓度葡萄糖作用下胶原蛋白分泌和细胞增殖及Wnt信号通路调控的变化。方法:基于高糖刺激诱导心肌成纤维细胞体外增殖的培养方法,CCK8法检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞的增殖周期;ELISA法观察细胞TGF-β1蛋白及I型、Ⅲ型胶原的分泌能力;western blot法检测蛋白β-catenin,GSK-3β,P-GSK-3β的表达水平;观察心肌成纤维细胞在高糖环境中Wnt信号通路传导的变化。结果:高浓度葡萄糖环境可以引起细胞的增殖(P0.01);促进TGF-β1的合成(P0.01);提高细胞I型、Ⅲ型胶原分泌的能力(P0.01);在分子水平上可以增强β-catenin的表达(P0.01),抑制P-GSK-3β的表达(P0.05)。结论:心肌成纤维细胞在高糖环境中增殖明显,心肌成纤维细胞TGF-β1和胶原的分泌会增加,引发Wnt信号通路的异常表达。研究其作用机制,对糖尿病心肌纤维化的防治及研究具有重大意义。     

人参皂苷Rg1对高糖培养的心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响

目的 建立体外高糖培养心肌成纤维细胞(CFs)的方法,观察人参皂苷Rg1对高浓度葡萄糖培养的心肌成纤维细胞增殖和蛋白分泌及Wnt信号通路的影响.方法 采用体外高糖诱导心肌成纤维细胞增殖模型,应用MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞增殖周期;ELISA法观察细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原及肿瘤生长因子β1(TGF-β1)蛋白的分泌;Western blot法检测β-catenin、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(P-GSK-3β)的蛋白表达水平以观察人参皂苷Rg1对于心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响.结果 人参皂苷Rg1可以抑制细胞增殖(P＜0.05);降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌(P＜0.05);减少TGF-β1的合成(P＜0.01);在分子水平上可以抑制β-catenin的表达(P＜0.05),上调P-GSK-3β的表达(P＜0.05).结论 人参皂苷Rg1能抑制心肌成纤维细胞的增殖,减少高糖培养心肌成纤维细胞胶原和TGF-β1的分泌,抑制Wnt信号通路的异常表达,具有潜在的抗心肌纤维化作用.     

丹酚酸A调控PTEN_PI3K/AKT信号通路对人肺癌细胞增殖的影响

目的 通过研究丹酚酸A(Salvianolic acid A,SalA)对人肺癌A549细胞PTEN_PI3K/AKT信号通路的影响,探讨SalA抑制肺癌细胞增殖的作用机制.方法 以人肺癌A549细胞为靶细胞,运用高内涵细胞成像分析系统,检测SalA对A549细胞增殖的影响;MTT法观察SalA对A549细胞增殖影响的量效关系;通过Western Blotting实验,检测SalA用于人肺癌A549细胞,对PTEN蛋白、磷酸化AKT(P-AKT)蛋白、非磷酸化AKT(T-AKT)蛋白的影响.结果 SalA对A549细胞增殖有抑制作用,并呈现剂量依赖性,而SalA可以促进PTEN蛋白及T-AKT蛋白的表达,抑制P-AKT蛋白的表达.结论 SalA具有抑制肺癌A549细胞增殖的作用,人肺癌A549细胞中存在有活性的PTEN_PI3K/AKT信号通路,SalA可能通过抑制PTEN_PI3K/AKT信号通路中P-AKT蛋白的表达,促进PTEN蛋白及T-AKT蛋白的表达,来抑制肺癌细胞增殖,促进癌细胞凋亡.     

三磷酸肌醇刺激心肌成纤维细胞的增殖

目的探讨钙调神经磷酸酶(CaN)依赖的信号通路在三磷酸肌醇(IP3)刺激的乳鼠心肌成纤维细胞(FBs)增殖中的作用.方法以培养的FBs为模型,用IP3激FBs内Ca2+释放,环孢素A(CsA)阻断CaN,维拉帕米(Ver)阻断FBs钙通道,检测FBs的CaN、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)活性,用3H-亮氨酸及3H-胸腺嘧啶掺入量作为反应FBs增殖的指标.结果IP3刺激组FBs蛋白核酸合成速率明显增高,与对照组相比差异显著(P＜0.01);CsA及Ver能明显抑制IP3介导的FBs蛋白核酸合成速率增高,与IP3刺激组相比差异显著(P＜0.01).同时发现IP3剌激组CaN、PKC活性与对照FBs相比差异显著(P＜0.05,P＜0.01).CsA和Ver抑制IP3介导的FBs的CaN活性增高,Ver抑制IP3介导的FBs的PKC活性增高.结论CaN在IP3刺激的FBs增殖中起重要作用,但CaN信号通路不是IP3剌激FBs增殖的唯一信号通路,其它信号通路也可能参与了IP3刺激的FBs增殖.     

调控肌成纤维细胞活化的信号通路

肌成纤维细胞(MyoF)是一类呈现为激活状态的成纤维样细胞,它在器官发生、修复、再生和炎症中发挥着重要的作用.然而一旦该细胞过度产生,就会对机体功能产生严重影响甚至导致死亡.近年来随着研究的不断深入,人们发现MyoF也参与了肿瘤的发生发展.本文通过综述MyoF激活机制的相关研究,介绍调控该细胞活化的信号通路,并为寻找其...     

丹酚酸B对人肺成纤维细胞TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白表达的影响及其机制

目的：观察丹酚酸B（Sal B）对人肺成纤维细胞转化生长因子β1(TGF-β1) / Smad信号通路相关蛋白表达的影响,探讨其抑制TGF-β1活化肺成纤维细胞作用的信号机制。方法：体外培养人胚肺成纤维细胞MRC-5,随机分为对照组（未加入TGF-β1或Sal B）、 Sal B(10 μmol•L^-1)组、 TGF-β1(10 μg•L^-1)组和TGF-β1（10 μg•L^-1）+ Sal B（10μmol•L^-1）组。Western blotting 法检测各组细胞内p-Smad2、p-Smad3、TGF-βⅠ型受体（TβRⅠ）和Smad7蛋白表达。结果：与对照组比较,TGF-β1组细胞内p-Smad2、p-Smad3和TβRⅠ蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）,Smad7蛋白表达水平明显下降（P<0.05）;与对照组比较, Sal B组细胞内p-Smad2、p-Smad3、TβRⅠ和 Smad7蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）;与TGF-β1组比较,TGF-β1 + Sal B组细胞内p-Smad2、p-Smad3和TβRⅠ蛋白表达水平均下降（P<0.05）,Smad7蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论：Sal B能够通过抑制肺成纤维细胞TGF-β1/Smad信号通路,从而发挥其抑制TGF-β1活化肺成纤维细胞的作用。     

经典Wnt信号通路在心肌细胞分化作用的研究进展

<正>缺血性心脏病已成为发达国家的主要死因,并有着惊人的发病率[1]。急性心肌梗死后,心脏自我更新能力有限及重构导致左室功能下降[2]。间充质干细胞(MSCs)在40年前被首次从骨髓中分离出来,并且成为细胞心肌成型术的主要种子细胞之一。以其独特的优势如易于分离、扩增,同种异体移植时无免疫原性以及多向分化潜能等受到普遍关注[3-5]。1经典Wnt信号的作用机制经典Wnt信号是通过卷曲蛋白(FZD)受体和     

高糖条件下心脏成纤维细胞对心肌细胞肥大的影响

目的: 研究高糖条件下心脏成纤维细胞对心肌细胞肥大的影响。方法: 将体外分离培养的SD乳鼠心肌细胞、心脏成纤维细胞随机分为心肌细胞低糖组（A组）,心肌细胞高糖组（B组）,心肌细胞、心脏成纤维细胞共培养高糖组（C组）,心肌细胞、心脏成纤维细胞共培养加转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）中和抗体高糖组（D组）,心脏成纤维细胞低糖组(E组),心脏成纤维细胞高糖组（F组）。培养0,6,12,24,48,72 h后,倒置显微镜观察细胞形态、拍照并计算心肌细胞表面积,RT-PCR检测心肌细胞肥大标志物心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide,ANP）、β-肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain,β MHC）mRNA表达水平,ELISA检测各组培养液中TGF β1表达量。结果： 培养48 h时,B组心肌细胞表面积比A组显著增加（P<0.05）,而C组在培养24 h时心肌细胞表面积已显著高于A组（P<0.05）。RT-PCR显示B组和D组细胞在培养12 h时,ANP、β-MHC mRNA显著升高（P<0.05）,培养24 h时达高峰;而C组在培养6 h时ANP、β-MHC mRNA即显著升高（P<0.05）,培养12 h时达高峰。ELISA检测结果显示,培养12 h起B组、D组TGF-β1的表达均显著高于A组（P<0.05）,而在培养6 h时C组TGF-β1的表达即已显著高于A组（P<0.05）。F组各时间点成纤维细胞TGF-β1的表达均高于E组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论： 心脏成纤维细胞在高糖条件下可能通过旁分泌TGF-β1促进心肌细胞的肥大。     

丝胶对高糖所致足细胞损伤和JNK信号通路的影响

目的：探讨丝胶对高糖所致足细胞损伤时c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路相关蛋白的表达及足细胞凋亡的影响,阐明丝胶的保护作用及其可能机制。方法：分化成熟的条件永生化小鼠足细胞随机分为正常对照组(含5.5 mmol·L^-1葡萄糖的培养基)、高渗对照组(含5.5 mmol·L^-1葡萄糖+24.5 mmol·L^-1甘露醇的培养基)、高糖组(含30.0 mmol·L^-1葡萄糖的培养基)、低浓度丝胶组(含30.0 mmol·L^-1葡萄糖+150.0 mg·L^-1丝胶的培养基)、中浓度丝胶组(含30.0 mmol·L^-1葡萄糖+300.0 mg·L^-1丝胶的培养基)和高浓度丝胶组(含30.0 mmol·L^-1葡萄糖+600.0 mg·L^-1丝胶的培养基)。采用光学倒置显微镜观察各组足细胞形态表现,实时荧光定量PCR (RT-q PCR)法检测各组足细胞中裂孔膜蛋白(Nephri...     

Wnt信号通路抑制对急性白血病天门冬酰胺酶耐药性的影响

目的:探讨Wnt信号通路抑制对急性淋巴细胞白血病(ALL)天门冬酰胺酶(Asp)耐药性的影响。方法:人ALL细胞株THP-1分为对照组、Asp组与si-Wnt组,Asp组与si-Wnt组分别转染siRNA阴性对照与Wnt siRNA,转染后48 h,两组均加入Asp(终浓度为0.25μM),对照组只加生理盐水。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期,Western-blot法检测蛋白表达水平。结果:Asp加药后24 h、48 h、72 h,si-Wnt组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均高于对照组和Asp组,且Asp组高于对照组(P<0.05)。Asp加药后72 h,si-Wnt组的G0/G1期细胞比例、Wnt及AKT蛋白表达均低于对照组与Asp组,Asp组低于对照组(P<0.05)。而si-Wnt组G2/M期细胞比例高于对照组与Asp组,且Asp组高于对照组(P<0.05)。结论:Wnt信号通路抑制可降低ALL细胞对Asp的耐药性,抑制AKT蛋白的表达,阻滞细胞周期,促进ALL细胞的凋亡,抑制其增殖。     

高浓度葡萄糖刺激脂肪细胞脂肪分解的效应及其机制

目的:研究高浓度葡萄糖刺激脂肪细胞脂肪分解升高血浆游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平的效应及其机制,进一步阐明高糖导致胰岛素抵抗的作用机制.方法:以Sprague-Dawley(SD)大鼠附睾原代脂肪细胞为研究对象,设为正常葡萄糖(5mmol/L)对照组和高浓度葡萄糖(25mmol/L)干预组.将细胞孵育一定时间直接或加入异丙基肾上腺素刺激后测定培养基中甘油含量作为评价脂肪分解的指标.脂肪分解数据表示为每升脂肪细胞压积的毫摩尔甘油释放量(mmol/L packed cell volume, mmol/L PCV).用Western blot方法分别检测总的及磷酸化的脂滴包被蛋白(perilipin)含量以及激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase, HSL)和脂肪组织甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)的含量.用酶化学法测定胞浆脂肪分解酶活性.结果:高浓度葡萄糖明显刺激大鼠原代脂肪细胞脂肪分解.将细胞在高糖中孵育24h,甘油累积量从4.4mmol/L PCV增加至6.4mmol/L PCV,即增加1.5倍(P<0.01);30min甘油释放量从0.11mmol/L PCV增加至0.24 mmol/L PCV,即增加2.1倍(P<0.01).高糖刺激脂肪分解的作用从细胞孵育16h开始持续到24h,且25mmol/L葡萄糖的效应较10mmol/L葡萄糖强.高糖明显增加perilipin磷酸化,但不影响该蛋白表达.高糖使胞内脂肪分解酶活性升高1.74倍并显著上调HSL蛋白表达,但不影响ATGL蛋白含量.异丙基肾上腺素刺激的脂肪分解在高糖环境下进一步增强.结论:高浓度葡萄糖通过增加perilipin磷酸化、上调HSL蛋白表达和升高脂肪分解酶活性从而直接刺激脂肪细胞脂肪分解.这提示高浓度葡萄糖单独即可以使FFA从脂肪组织向血浆中释放增加,循环FFA水平升高从而导致胰岛素抵抗.     

NMDA受体激活引起的突触活动对Wnt非经典通路的影响

目的 探讨NMDA受体激活引起的突触活动诱导Wnt非经典通路的活化.方法 构建C57BL/6J胎鼠大脑皮层神经元原代培养体系,用NMDA处理神经元细胞,并结合Western blotting、双免疫荧光染色等技术,检测神经元细胞内Wnt非经典通路的相关蛋白的变化.结果 免疫荧光染色显示成功建立了C57BL/6J胎鼠大脑皮层神经元体外培养体系,原代神经元细胞在体外培养10d生长良好,且纯度达90%;体外培养的神经元细胞内存在Wnt5a神经递质,经NMDA的刺激,发现Wnt非经典通路的两个标志性蛋白CaMKII和JNK的磷酸化水平显著增加,且Wnt非经典通路的一种受体Frizzled-5的蛋白表达水平也显著增加.进一步的研究显示,用NMDA竞争性抑制剂DAP5能够阻断NMDA引起的CaMKII和JNK蛋白的磷酸化水平的提高.结论 NMDA受体的激活会诱导Wnt非经典通路的活化.     

JNK信号通路在乙醛刺激的肝星状细胞凋亡中的作用

目的: 观察用特异性c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)特异性阻断剂SP600125阻断JNK信号传导通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)凋亡的影响.方法: 体外培养大鼠HSC株;用不同浓度的SP600125(20,60,100 μg/L)对乙醛(200 μmol/L)刺激的大鼠HSC进行处理,分别以DNA片段凝胶电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡,用Western Blotting法检测JNK激酶的活性变化.结果: 不同浓度的SP600125(终浓度为20,60,100 μg/L)对乙醛刺激的HSC内p-JNK的水平有明显下调作用,强度呈剂量依赖关系,同乙醛组相比有显著性差异[MVI: (35.6±0.9),(24.4±1.1),(3.4±0.2) vs (48.2±0.9),P<0.05];同时SP600125具有促进HSC凋亡的作用: 空白对照组及乙醛组中细胞凋亡率为[(2.0±0.2)%和(6.0±0.5)% ,两者有显著性差异(P<0.05)],经SP600125处理后细胞凋亡率上升[分别为(11.1±0.4)%,(26.9±0.9)%,(33.1±1.3)%,P<0.05],同乙醛组相比有显著性差异(P<0.05).结论: SP600125通过阻断JNK通路促进HSC凋亡,故JNK信号通路可能参与了HSC的凋亡.     

丹酚酸B盐对转化生长因子-β1刺激肝星状细胞活化与胞内信号转导的作用

目的 探讨丹酚酸B盐（SA-B）抗肝纤维化的作用机理。方法 分离大鼠肝星状细胞（HSC）,于无包被的塑料培养皿上原代培1、4、7d,细胞分别处于静止,中间活化与完全活化3种活化状态,予以100pmol/L转化生长因子β1(TGF-β1）刺激,观察细胞α-肌动蛋白表达与胶原分泌的变化。选择对TGF-β1刺激最为敏感的中间活化状态HSC为细胞模型,[^3H]胸腺嘧啶掺入法观察0.1μmol/L-1mmol/LSA-B对该细胞增殖的作用,倒置显微镜观察药物对细胞形态的影响;Western印迹与Northern印迹等方法观察SA-B对TGF-β1刺激活化的HSC胞外基质基因与蛋白表达,α-肌动蛋白表达的影响;提取细胞质与细胞核蛋白,Western印迹方法观察SA-B对TGF-β1刺激的HSCSmad2/3蛋白表达,磷酸化与核转位的影响。结果 TGF-β1促进各活化状态HSC的胶原分泌,促进率分别为128.6%,207.3%与188.2%,中间活化状态HSC对TGF-β1的促胶原分泌最为敏感,除0.1mmol/L-1mmol/LSA-B引起部分细胞死亡外,0.1μmol/L-10μmol/LSA-B对细胞形态无影响,但可浓度依赖性地抑制细胞增殖,细胞内[^3H]胸腺嘧啶掺入量分别为对照组的76%,60.1%与47.8%,1μmol/L-100644mol/LSA-B明显抑制TGF-β1刺激的HSC胶原分泌量（分别为对照组的68.6%与56.1%)。抑制α-肌动蛋白与纤维蛋白酶原激活物抑制子蛋白表达,下调I型前胶原基因表达,0.1μmol/L-10μmol/LSA-B不同程度地抑制Smad2/3的蛋白表达量,明显抑制Smad2蛋白胞内磷酸化与核转位。结论 SA-B抑制TGF-β1的HSC胞内信号转导,从而拮抗TGF-β1的促HSC活化,以上作用是SA-B抗肝纤维化的主要机理。     

化疗药顺铂对Wnt通路抑制因子的表达作用

目的 研究抗肿瘤药顺铂(cisplatin,Pt)对Wnt通路抑制因子FrpHE(frizzled relatd protein)和 DKK-1(dickkopf-1)表达的调节作用.方法 培养人肝癌HepG2、Hep3B、人大肠癌Lovo和人神经胶质瘤U251细胞,并分别加入5 μmol/L Pt作用24 h,以RT PCR技术检测FrpHE和DKK-1mRNA,以流式细胞术检测肿瘤细胞中Wnt通路的关键调节因子β-catenin的表达.结果 顺铂作用24 h后,FrpHE mRNA表达水平在人肝癌细胞较对照组表达水平显著增加(P<0.001).在人大肠癌细胞和人神经胶质瘤细胞中,未见FrpHE mRNA表达.DKK 1mRNA表达水平在加入Pt作用后的人肝癌细胞、人大肠癌细胞和人神经胶质瘤细胞均较对照组表达水平显著增加.β-catenin的阳性细胞百分比和平均荧光强度与对照组相比均降低(P<0.001).结论 化疗药顺铂能够诱导肝癌细胞FrpHE mRNA和人肝癌、肠癌、神经胶质瘤细胞DKK-1 mRNA的表达,抑制Wnt通路.     

丹酚酸B对大鼠离体工作心脏血流动力学的影响

目的 研究丹酚酸B对离体大鼠工作心脏血流动力学的影响.方法 采用Langendorff离体心脏灌流的方法,以左室内压( LVSP)、左室舒末压(LVEDP)、室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、室内压最大下降速率(- dp/dtmax)、心率(HR)等血流动力学参数为指标,观察丹酚酸B对心肌收缩性能的影响.结果 不同剂量(10、5、2.5 mg/L)的丹酚酸B可使LVSP、±dp/dtmax明显升高,同时使HR减慢,并呈剂量依赖性,但对LVEDP无明显作用.结论 丹酚酸B对离体工作心脏有剂量依赖性正性肌力作用.