免疫磁珠纯化人呼吸道合胞病毒F蛋白方法的建立

目的 利用免疫磁珠分离技术(IMS)建立快速纯化人呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白(F)的方法.方法 表达RSV F的重组腺病毒FGAd/F感染293细胞,收获细胞裂解液,利用兔抗人RSV多抗包被表面活化的免疫磁珠富集和纯化F蛋白,同时建立夹心ELISA,检测纯化的F蛋白浓度以及 F蛋白的回收率.结果 采用IMS成功纯...     

免疫磁珠法及密度梯度离心法分离纯化人外周血中性粒细胞的比较

目的比较免疫磁珠法和密度梯度离心法分离纯化人外周血中性粒细胞的可靠性。方法用免疫磁珠法和密度梯度离心法分别分离中性粒细胞,使用血球计数仪结合显微镜鉴定细胞纯度、回收率,以台盼蓝检测细胞活力。结果免疫磁珠法与密度梯度离心法分离中性粒细胞纯度分别为（98．76±0．53）％,（92．34±1．57）％,回收率分别为（90．01±2．24）％和（82．20±2．17）％,两种方法分离后中性粒细胞活力分别为（95．60±2．30）％,（94．20±3．11）％。结论免疫磁珠法分离人中性粒细胞纯度及回收率均好于密度梯度离心法,但分离后细胞活性二者差异不大。     

免疫磁珠法分离人外周血T淋巴细胞

二维超声检测103例可疑冠状动脉（冠脉）病变患者的双侧须动脉内膜－中膜厚度（IMT），根据冠脉造影结果将患者分为正常组、单支病变组及多支病变组．结果显示：冠脉有病变患者的颈动脉IMT显著大于冠脉正常者，多支病变组IMT显著大于正常组（P＜0．01）。提示颈动脉IMT与冠脉粥样硬化程度有着显著的相关关系，可作为冠脉粥样硬化病变程度的一个良好的预报因子。     

免疫磁珠法分离提纯骨髓造血干细胞方法的建立

目的 :为了建立免疫磁珠法体外分离提纯骨髓造血干细胞的方法。方法 :采用免疫磁珠阴性选择法分选 CBA(H - 2 K)小鼠骨髓细胞的 CD34+ CD38- Scal+ 细胞群 ,台盼蓝染色观察活力 ,流式细胞仪检测荧光标记的 CD34+ CD38- Scal+ 表达阳性率 ,骨髓造血干细胞 (HSCs)在体外克隆形成的分析 ,HSCs在体内造血功能重建的分析。结果 :分选后 CD34+ CD38- Scal+ 表达阳性细胞纯度达 (86 .5± 3.2 ) % ,细胞活力为 (95 .8± 2 .2 ) %。结论 :免疫磁珠阴性选择法分选系统是一种有效的骨髓造血干细胞分离提纯方法 ,省时、简便、纯度高并对细胞的生物活性无明显影响 ,提纯的细胞可直接用于后续实验     

免疫磁珠法分离和纯化人胚胎神经干细胞

目的：建立有效的人类神经干细胞分离纯化系统和方法。方法：无菌取孕24周流产胎儿的室下区脑组织，制备细胞悬液，用磁性微珠标记的CD133单克隆抗体与细胞孵育，通过磁分选器分离出CD133（＋）和CD133（－）细胞，通过体外培养并诱导分化，观察CD133阳性细胞和阴性细胞的增殖情况及分化能力。结果：经免疫磁珠分选的室下区脑组织中，CD133（＋）细胞占胚胎脑组织细胞的2％左右，该细胞体外扩增能力强，细胞呈球形生长，并易聚集成团，培养5d,10d,15d,20d进行活细胞计数，细胞增长率分别为1．79％、4．82％、7．21％，14．66％，诱导分化后的细胞经染色鉴定可分化为神经元，神经胶质等多种神经细胞，阴性细胞扩增能力弱，活细胞计数以死细胞数量居多，大约705，另外一些细胞贴壁分化。结论：免疫磁珠法简便，有效，经免疫磁珠分离的神经干细胞在体外能进一步培养扩增并分化。     

Wa细胞膜上与乙型肝炎病毒的preS1特异性结合的受体样蛋白

本文对与乙型肝炎病毒外周蛋白ｐｒｅＳ１特异结合的Ｂ细胞来源的Ｗａ细胞膜受体样蛋白进行了研究，用麦芽糖结合蛋白－ｐｒｅＳ１－直链淀粉树脂亲和层析柱分离得到了与ｐｒｅＳ１特异性结合的Ｗａ细胞膜受体样蛋白质，抗麦芽糖结合蛋白－ｐｒｅＳ１的单克隆抗体Ｆ３５．２５结合Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实确系膜蛋白与ｐｒｅＳ１的特异性结合，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，Ｗａ细胞膜上存在有三种不同的受体样蛋白，分子量分别为６００００，５６０００和４８０００．这表明在非肝细胞膜中也可能存在乙型肝炎病毒的特异性受体和直接感染途径。     

应用免疫磁珠法分离脐血CD^＋34造血细胞

分离脐血ＣＤ＾＋３４细胞，以了解其造血增殖活性。方法：应用免疫磁珠法分离脐血ＣＤ＾＋３４细胞，并对其实验方法进行了改进。结果：常规方法ＣＤ＾＋３４纯度较低，经过改进，脐血ＣＤ＾＋３４细胞由分离前的（１．３９±０．７６）％增加至（５９．４６±１７．３５）％，ＣＤ＾＋３４细胞富集倍数为（６２．３１±５５．１９）倍，分离后组分ＣＦＵ－ＧＭ，ＢＦＵ－Ｅ，ＣＦＵ－Ｍｉｘ较分离前分别增加（４１．０５±１５．７     

免疫磁珠法分选人骨髓多能成体祖细胞及初步鉴定

目的:应用免疫磁珠法分选人骨髓多能成体祖细胞,观察其分选效果,建立体外分选纯化及培养人骨髓来源多能成体祖细胞(hMAPCs)的方法.方法:取健康成人志愿者适量骨髓后采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,在自制培养基下贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、血糖蛋白A(GlyA)免疫微磁珠(miniMACS)负分选,锥虫蓝拒染实验计数MACS分选前后细胞活力.流式细胞仪鉴定分选后细胞纯度;流式细胞仪分析培养细胞CD29、CD44、CD34和HLA-DR表达情况.结果:通过MACS分选,平均每1×106/ml骨髓贴壁细胞可分选出约(5～10)×104/ml hMAPCs,分选后的hMAPCs细胞生长良好,最长传代到第20代.分选前后细胞活力分别为(96.7±1.7)%和(96.0±2.4)%,无明显差异;流式细胞仪分析获取的CD45-、GlyA-细胞纯度大于98%;流式细胞仪检测hMAPCs中CD29阳性表达细胞比率为99.2%,CD44阳性细胞比率为98.3%,CD34阳性细胞比率为1.2%,HLA-DR阳性细胞比率为5.3%.结论:CD45、GlyA免疫微磁珠负分选可从骨髓中分离高纯度的hMAPCs;分选后hMAPCs在自行研制的培养基中有较强的增殖能力.     

乙肝病毒前S1蛋白的临床诊断意义

目的 研究前S1蛋白(PreS1)与乙型肝炎病毒(HBV)复制的关系,及其诊断乙型肝炎的价值和判断预后的作用.方法 采用酶联免疫吸附法对232例慢性乙型肝炎患者血清标本和40例确诊为急性乙型肝炎患者发病后一段时间的血清标本进行PreS1测定,并与HBV-DNA、ALT间关系做对比分析.结果 HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组HBV-DNA和PreS1阳性检出率分别为87.4%和82.5%,HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组分别为32.6%和30.3%,两组患者血清PreS1与HBV-DNA检出率高度符合(P>0.05).急性乙肝患者ALT异常与PreS1阳性相关性高(P＞0.05),而与HBV-DNA阳性检出率之间有显著差异(P＜0.05).结论 PreS1蛋白能够敏感地反映乙型肝炎病毒复制的情况,在一些设备比较落后的地方可以采用PreS1法代替HBV-DNA.急性乙肝患者PreS1先于HBV-DNA转阴,提示疾病预后良好,并且可以有效监测ALT的动态变化.     

PreS_1和HBV-DNA与HBV-M相关性分析

目的:探讨乙肝病毒前S1抗原(PreS1Ag)在诊断慢性乙型病毒性肝炎病毒复制中的作用。方法:收集慢性乙型病毒性肝炎患者500例,其中HBV-DNA阳性400例(拷贝数>500/ml),按HBV-DNA含量由低到高分8组;其余为HBV-DNA阴性对照100例。检测乙肝血清标志物(HBsAg、HBeAg、HBeAb)与PreS1Ag。结果:(1)HBV-DNA<1×106/ml,PreS1Ag的阳性率比HBeAg高,两者比较差异有显著性(P<0.05);HBV-DNA1×106/ml以上,PreS1Ag与HBeAg相比差异无显著性(P>0.05)。(2)HBV-DNA<1×105/ml,PreS1Ag阳性率随着HBV-DNA含量增加而增加,不同组间的PreS1Ag阳性率相比差异有显著性(P<0.05)。(3)HBV-DNA<1×107/ml,HBeAg的阳性率随着HBV-DNA含量增加而增加,不同组间的HBeAg阳性率相比差异有显著性(P<0.05)。(4)HBV-DNA<1×106/ml,HBeAb有较高的阳性率,并随着HBV-DNA含量的增加而逐渐下降,不同组间的HBeAb阳性率相比差异有显著性(P<0.05)。(5)以HBV-DNA检测结果为金标准,HBeAg的灵敏度为68.5%(274/400),阴性预示值为43.2%(96/222),检测有效率为64.8%(324/500);均低于PreS1Ag的灵敏度90.0%(360/400),阴性预示值55.6%(50/90),检测有效率82.0%(410/500)。结论:PreS1Ag比HBeAg较准确的反映乙肝病毒的复制情况,是“乙肝五项”有益的必要补充。     

Hepatitis B Virus X Protein Upregulates Intracellular Calcium Signaling by Binding C-terminal of Orail Protein

Hepatitis B virus X (HBx) protein plays a pivotal role in the development of hepatitis B virus (HBV)-associated hepatocellular carcinoma. Although regulation of cytosolic calcium is essential for HBV replication and is mediated by HBx protein, the mechanism of HBx protein regulating intracellular calcium level remains poorly understood. The present study examined whether HBx protein elevated the intracellular calcium through interacting with storeoperated calcium entry (SOCE) components, Orail and stromal interaction molecule 1, and then identified the targets of HBx protein, with an attempt to understand the mechanism of HBx protein upsetting intracellular calcium homeostasis. By employing co-immunoprecipitation and GST-pull-down assay, we found that Orail protein interacted with HBx protein, and the C-terminus of Orail was implicated in the interaction. Confocal microscopy also revealed that HBx protein could co-localize with full-length Orail protein in HEK293 cells. Moreover, live cell calcium imaging exhibited that HBx protein elevated intracellular calcium, possibly by binding to SOCE components. Our results suggest that HBx protein binds to STIM1-Orail complexes to positively regulate the activity of plasma membrane store-operated calcium channels.     

Cos - 7 细胞表达 I L- 2 - H B Vpre S 融合蛋白的免疫原性

为了协同白细胞介素－ ２（ Ｉ Ｌ－ ２） 和乙型肝炎病毒（ Ｈ Ｂ Ｖ） 前 Ｓ 抗原（ｐｒｅ Ｓ） 的多种生物学功能,用基因重组方法将表达 Ｉ Ｌ－ ２ｐｒｅ Ｓ 的质粒ｐ Ｃ Ｗ Ｉ Ｉ Ｐ 转染 Ｃｏｓ － ７ 细胞。该细胞分泌表达的 Ｉ Ｌ－ ２ｐｒｅ Ｓ 融合蛋白保留了 Ｉ Ｌ－ ２ 和ｐｒｅ Ｓ 抗原天然分子的生物学活性,且能增强ｐｒｅ Ｓ 抗原的免疫原性,产生协同作用,促进机体免疫应答。这可能为 Ｈ Ｂ Ｖ 持续性感染者寻找新的治疗方法提供理论基础与实验依据。     

乙型肝炎患者血清病毒前S1抗原的检测及其临床应用

目的 探讨乙型肝炎病毒前S1抗原(Pre-S1Ag)与乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)、e抗原(HBeAg)、抗HBe(anti-HBe)的相关性及临床价值.方法 对848例乙肝患者血清用酶联免疫吸附法(ELISA)检测乙肝病毒血清标志物(HBV-M)、Pre-S1Ag,用荧光定量PCR测定HBV DNA、用速率法检测丙氨酸氨基转移酶(ALT).同时对乙肝HBV-M全阴性的305例健康人检测血清Pre-S1Ag.结果 848例乙肝患者中HBeAg阳性率为76.2%,Pre-S1Ag总阳性率为62.5%.其中,646例HBeAg阳性患者组中检出Pre-S1Ag阳性率62.2%;202例HBeAg阴性患者中检出 Pre-S1Ag阳性率63.4%,两组的Pre-S1Ag阳性率无明显差异(P＞0.05).Pre-S1Ag阳性患者比Pre-S1Ag阴性患者的ALT异常率显著增高(P＜0.01).结论 无论HBeAg阴性还是阳性,Pre-S1Ag同HBV的复制指标HBV DNA都有较好的一致性,是判断乙型病毒活动性的指标,是无条件开展HBV DNA检测时的最佳选择.     

乙型肝炎病毒感染者前S1蛋白检测的临床观察研究

目的：观察前S1蛋白在急慢性乙型肝炎及乙肝携带者的不同变化，评估乙肝病人的病情预后。方法：采用前展性队列研究方法，选择84例不同乙肝病毒感染者，其中急性乙型肝炎10例，慢性乙型肝炎44例，乙肝病毒携带者30例。按间隔0，1，3，6月检测随访前S1蛋白，结合肝功能和临床进行观察研究。结果：前S1蛋白在急慢性肝炎发作期间及恢复期间无统计学差异；急性肝炎发作期与恢复期间，慢性肝炎发作期与恢复期间，急慢性肝炎与乙肝病毒携带者间都有统计学差异。结论:PreS1与HBV的活动有关，与肝炎的病程长短无关，PreS1持续阳性的乙肝病毒携带者易发作肝炎。     

白细胞介素-2-乙肝病毒前S抗原融合蛋白在真核细胞中的分泌表达

为了协同人白细胞介素-2（IL－2）与乙型肝炎（乙肝）病毒（HBV）前S抗原（preSAg）的生物学功能，探索能打破持续性感染者对HBV表面抗原（HBsAg）的免疫耐受，诱导机体对HB－sAg和preSAg产生体液和细胞免疫应答的基因免疫与治疗药物，用基因重组方法构建了IL－2和HBV完整preSAg的真核表达嵌合基因及表达质粒pCWIIP。pCWIIP转染的Cos－7细胞能分泌表达IL－2－preS融合蛋白，其表达效率与pCIIL－2转染的细胞表达IL－2一致，细胞上清中IL－2活性单位大于3×103u／ml，并用酶免疫实验法（EIA）检测了preSAg，而其细胞裂解液中IL－2活性很低，preSAg未检测到。本文结果说明preSAg2～19位氨基酸序列的滞留效应是可以克服的。该发现不仅为构建带完整preSAg的新型乙肝疫苗和特异性免疫治疗剂提供了理论与实验依据，而且对蛋白质分泌表达调控的研究也有一定意义。     

HBV大分子表面蛋白基因真核重组载体的构建与鉴定

目的构建包含人乙型肝炎病毒(HBV)大分子表面蛋白基因的重组载体，以便进一步研究其基因免疫以及对宿主细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38等信号传导通路的影响。方法设计合成2对寡核苷酸引物，以adr亚型HBV质粒pHBVDNA为模板，采用PCR法分别扩增HBV大分子表面蛋白基因(preS1／S2／S基因)片段；用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后，连接到质粒pcDNA3．1( )相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论成功构建了HBV大分子表面蛋白基因的重组载体。     

B1细胞与乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒的感染

病毒性肝炎的发病机制迄今为止尚未完全明确,乙型肝炎病毒(HBV)及丙型肝炎病毒(HCV)所致肝炎可能是肝脏细胞免疫防御反应病毒入侵的结果。B1细胞是新近认识的一种B细胞亚群,CD5分子是其特征性分子标志。CD5+B1细胞是机体防御肝炎病毒入侵的重要天然免疫细胞。CD5+B1细胞与机体内HBV感染的慢性化密切相关。CD81与CD5间通过分子串话机制直接参与HCV对宿主细胞的感染。     

用T7噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒PreS1相互作用蛋白

目的:用T7噬菌体筛选系统筛选乙型肝炎病毒PreS1的相互作用蛋白.方法:应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到的乙型肝炎病毒PreS1作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行生物筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索.结果:经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与乙型肝炎病毒PreS1相互作用的蛋白可能为:细胞色素C氧化酶1(Cytochrome c Oxidase Subunit Ⅰ,COX1).结论:T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨PreSI的致病机制提供重要依据.