siRNA沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白2表达对胶质瘤细胞侵袭及增殖的影响*

目的 探讨沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白2（TNFAIP2）表达对胶质瘤细胞侵袭及增殖的影响。方法 使用Lipofectamine 2000介导siRNA转染胶质瘤细胞U87和U251下调TNFAIP2 mRNA的表达;运用细胞划痕及Transwell实验检测沉默TNFAIP2表达对U87及U251细胞迁移、侵袭的影响;通过CCK-8实验检测沉默TNFAIP2表达对胶质瘤细胞U87及U251增殖的影响。结果 Lipofectamine 2000介导si-TNFAIP2转染U87及U251细胞可下调TNFAIP2 mRNA的表达;沉默TNFAIP2表达可降低胶质瘤细胞U87和U251迁移侵袭的能力;沉默TNFAIP2表达可抑制U87及U251细胞的增殖。结论 siRNA沉默TNFAIP2表达可抑制胶质瘤细胞的侵袭和增殖。     

人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞增殖与凋亡的作用研究

目的：研究人21．5kDa人脑髓鞘碱性蛋白（MBP）基因沉默对神经胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响。方法将21．5kDaMBP序列特异性短发夹RNA（shRNA）重组质粒pGenesil‐1‐MBP‐3转染神经胶质瘤细胞株（U251）作为MBP基因沉默组,以空质粒转染为阴性对照组,脂质体转染为脂质体空转组;用实时定量PCR（RT‐PCR）和Westernblot方法检测各组21．5kDaMBPmRNA和蛋白的表达水平,CCK‐8法测定细胞增殖曲线,流式细胞法分析细胞凋亡率。结果与阴性对照组相比,MBP基因沉默组细胞中21．5kDaMBP在mRNA和蛋白水平的表达均显著下降（P＜0．05）、细胞增殖活性明显降低（P＜0．05）、细胞凋亡率显著增高（P＜0．05）。结论人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞U251具有显著的抑制增殖和促进凋亡的双重调节作用。     

多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1对U251胶质瘤细胞基因表达的影响

目的 运用基因芯片技术研究多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1,LRIG1）对U251胶质瘤细胞基因表达的影响。方法 提取正常U251细胞和转染了LRIG1的U251细胞的RNA,并反转录为cDNA,加用cy3、cy5染色标记后使用Roche-NimbleGen人全基因组表达谱芯片检测LRIG1对U251胶质瘤细胞基因表达的影响。结果 转染LRIG1的U251细胞相对U251细胞,差异基因为808条,其中上调基因有397条,下调基因有411条,包括细胞骨架、细胞增殖、细胞凋亡、生长代谢等相关基因。结论 基因芯片能够高效地初步检测差异基因表达,有助于揭示LRIG1作用于胶质瘤细胞的分子机制。     

Effect of over-expressed LRIG3 on cell cycle and survival of glioma cells

This study examined the effects of over-expression of leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 3 (LRIG3) on the cell cycle and survival of human glioma cell line U87 and U251 and explored t...     

CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251体外增殖和侵袭能力的影响,为CXCR4 shRNA治疗胶质瘤提供实验依据. 方法 用脂质体LipofectimineTM2000将CXCR4-shRNA转染U251细胞,MTT实验检测转染细胞的增殖,Transwell侵袭实验检测转染细胞的迁移和侵袭能力. 结果 与转染非特异的pGPU6/GFP/NC组和未转染组比较,转染CXCR4-shRNA载体pGPU6/GFP/Rac 1-421组的U251细胞CXCR4 mRNA显著降低(P＜0.05),并且细胞体外增殖能力减弱(P＜0.05),侵袭到滤膜底面的细胞数为36.67±9.76,分别低于对应的pGPU6/GFP/NC组和未转染组(P＜0.05). 结论 CXCR4 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-421可下调U251细胞CXCR4的表达,抑制U251细胞的增殖和迁移侵袭能力,提示CXCR4在胶质瘤发展过程中具有重要作用.     

RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响

目的  探讨RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响。方法  分别构建3种靶向c-Met基因的短发卡RNA（shRNA）序列,以脂质体转染的方式导入人脑胶质瘤U251细胞,并筛选出稳定表达的细胞株。采用PCR和Western blot检测c-Met-shRNA转染后U251细胞c-Met的表达情况,以筛选出可有效沉默c-Met基因的shRNA。c-Met基因沉默后,采用MTT法和流式细胞术检测U521细胞增殖情况,采用Transwell法和细胞划痕实验检测U251细胞侵袭和迁移情况,采用裸鼠荷瘤实验研究U251细胞体内成瘤性。结果  成功构建可有效沉默c-Met基因的c-Met-shRNA1。沉默c-Met后,c-Met mRNA以及蛋白的表达均显著下降,差异有统计学意义（P <0.05）;而且可明显抑制U251细胞的增殖、侵袭、迁移以及体内成瘤能力,差异有统计学意义（P <0.05）。结论  RNAi沉默c-Met基因可有效抑制人脑胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭、迁移以及体内成瘤能力。

     

干扰linc00152抑制胶质瘤细胞增殖与侵袭

目的 观察干扰linc00152的人胶质瘤细胞株U251的增殖与侵袭情况.方法 培养胶质瘤U251细胞,将U251细胞分为观察组和对照组,观察组转染linc00152-shRNA,对照组转染control-shRNA,采用qRT-PCR法检测两组U251细胞中linc00152 mRNA的表达,采用MTT法观察两组细胞增殖能力,侵袭实验检测两组细胞的侵袭能力.结果 qRT-PCR结果显示,观察组U251细胞中linc00152的mRNA表达量为(0.313±0.020),明显少于对照组的(1.017±0.082),差异有显著统计学意义(P<0.01);MTT结果显示,观察组的U251细胞的OD值为(0.444±0.032),少于对照组的(0.679±0.052),差异具有统计学意义(P<0.05);侵袭实验结果显示,观察组穿过基质胶的U251细胞数量为(66.9±9.1),明显少于对照组的(146±12.2),差异具有显著统计学意义(P<0.01).结论 在人胶质瘤细胞株U251中敲低linc00152能抑制细胞的增殖与侵袭.     

LRIG1基因功能域载体的构建及亚细胞定位

目的 构建含LRIG1胞外段＋跨膜段（ET）及跨膜段＋胞内段（TC）基因的真核表达载体, 并研究它们的亚细胞定位.方法 以人LRIG1全长的质粒p3XFLAG-CMV-9-LRIG1为模板, PCR扩增出3XFLAG-LRIG1-ET和LRIG1-TC, 并将之分别亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP-N1和p3XFLAG-CMV-9中. 酶切和DNA测序鉴定, 脂质体法将构建的质粒转染U251细胞, 观察标记基因荧光蛋白EGFP的表达, 间接免疫荧光检测标记基因3XFLAG的表达. 结果 构建的质粒序列正确, 转染细胞后可检测到EGFP和3XFLAG基因的表达; LRIG1-ET和LRIG1-TC均主要表达在U251的胞膜上, 少量表达在胞浆. 结论 包含LRIG1亚单位ET和TC的真核表达载体均构建成功, 其表达产物均主要位于胞膜, 少量位于胞浆.     

干扰miR-21表达抑制胶质瘤U251细胞增殖迁移与侵袭

目的 探讨干扰miR-21表达对胶质瘤细胞U251增殖、迁移和侵袭的影响。方法使用脂质体将miR-21抑制物(人工合成干扰miR-21表达的核苷酸片段,miR-21处理组)以及对照组转染于U251细胞,利用qRT-PCR验证miR-21处理组转染的细胞中miR-21表达水平;通过MTT法、细胞划痕、transwell等实验观察miR-21处理组和对照组对U251细胞增殖迁移和侵袭的影响。结果miR-21 处理组中miR-21的表达量明显下调。即转染miR-21 抑制剂能有效降低U251细胞中miR-21的表达。miR-21 处理组的 U251细胞与对照细胞相比,增殖速度明显下降,差异具有显著性。细胞划痕实验显示干扰miR-21抑制U251细胞迁移能力。Transwell侵袭实验结果显示,miR-21 处理组的U251细胞的侵袭能力较对照组细胞明显下降。结论miR-21能促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力,它可能在胶质瘤的发生和进展中发挥重要作用。     

Livin siRNA重组腺病毒对胶质瘤U251细胞的增殖、凋亡的作用研究

目的通过小分子干扰RNA(siRNA)沉默livin的表达,探讨其对胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响。方法制备livin siRNA重组腺病毒后感染U251细胞,采用RT-PCR、蛋白质印迹法检测livin基因的干扰效果,用MTT法和流式细胞术检测U251细胞的增殖和凋亡情况。同时观察重组腺病毒对荷瘤小鼠的治疗效应。结果重组腺病毒Ad-livin siRNA能有效抑制U251细胞的livin mRNA和蛋白水平的表达;抑制U251细胞增殖,促进凋亡;在小鼠体内有效抑制U251细胞的生长和提高荷瘤小鼠的平均生存期（P<0.05）。结论用livin siRNA重组腺病毒介导抑制livin基因的表达,可抑制U251细胞增殖,促进凋亡,为胶质瘤的治疗提供了新策略。     

PTTG靶向siRNA表达载体构建及其沉默效率评价

目的：构建针对人脑胶质瘤细胞系U251的高效率沉默垂体瘤转化基因(PTTG)的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体。 方法：合成特异性干扰PTTG 的siRNA片段,并与pGenesil2 载体连接,构建PTTG干扰载体（pGenesil2-PTTG siRNA）。利用脂质体将其转染U251细胞,分为正常细胞对照组、HK阴性对照组和3个siRNA干扰组（pGenesil2-PTTG siRNA1、pGenesil2-PTTG siRNA2和pGenesil2-PTTG siRNA3）,应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法和流式细胞术对转染后U251细胞中PTTG 的mRNA和蛋白表达水平进行分析。 结果：酶切证实PTTG-siRNA表达载体构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;转染pGenesil2-PTTG siRNA后,3个干扰组的U251 细胞中PTTG基因和蛋白表达水平均较正常对照组显著降低（P<0.01）。 结论：成功构建了能高效率沉默PTTG 的RNAi表达载体;pGenesil2-PTTG siRNA高效地抑制了胶质瘤U251细胞中PTTG基因的表达。     

PPM1D silencing by lentiviral-mediated RNA interference inhibits proliferation and invasion of human glioma cells

To construct a lentiviral shRNA vector targeting human protein phosphatase 1D magnesium-dependent(PPM1D) gene and detect its effectiveness of gene silencing in human gliomas,specific siRNA targets with short hairpin frame were designed and synthesized.DNA oligo was cloned into the pFU-GW-iRNA lentiviral expression vector,and then PCR and sequencing analyses were conducted to verify the constructs.After the verified plasmids were transfected into 293T cells,the lentivirus was produced and the titer of virus was determined.Real-time quantitative PCR and Western blot were performed to detect the PPM1D expression level in the infected glioma cells.PCR and Western blot analyses revealed the optimal interfering target,and the virus with a titer of 6×108 TU/mL was successfully packaged.The PPM1D expression in human glioma cells was knocked down at both mRNA and protein levels by virus infection.The expression of PPM1D mRNA and protein was decreased by 76.3% and 87.0% respectively as compared with control group.The multiple functions of human glioma cells after PPM1D RNA interference were detected by flow cytometry and cell counting kit-8(CCK-8).Efficient down-regulation of PPM1D resulted in significantly increased cell apoptosis and reduced cell proliferation and invasion potential in U87-MG cells.We have successfully constructed the lentiviral shRNA expression vector capable of stable PPM1D gene silencing at both mRNA and protein levels in glioma cells.And our data gave evidence that the reduced cell growth observed after PPM1D silencing in glioma cells was at least partly due to increased apoptotic cell death.     

siRNA沉默GPNMB对人胶质母细胞瘤细胞系生物学特性的影响

目的探讨小干扰RNA（siRNA）干扰非转移性黑色素瘤糖蛋白B（GPNMB）表达对人胶质母细胞瘤细胞系生物学特性的影响。方法将GPNMB siRNA片段通过脂质体转染人胶质母细胞瘤细胞系U251和SHG44,Western blot检测GPNMB蛋白表达水平;Annexin V/PI双染法检测GPNMB-siRNA对细胞凋亡的影响;MTT法检GPNMB-siRNA对细胞增殖的影响;Transwell法检测GPNMB-siRNA对细胞侵袭性的影响。结果 GPNMBsiRNA能有效抑制人胶质母细胞瘤细胞系U251和SHG44中GPNMB的表达,与空白对照组比较,GPNMB的缺失对细胞凋亡影响不大,可显著抑制细胞的增殖和侵袭（P〈0.05）。结论 GPNMB基因敲除对人胶质母细胞瘤细胞系U251和SHG44的凋亡无显著影响,但可显著抑制其增殖力和侵袭力,表明GPNMB在人胶质母细胞瘤的发生、发展中起着重要作用,提示GPNMB可以作为治疗人胶质母细胞瘤的潜在靶点。     

shRNA-PAX6慢病毒载体构建及其对胶质瘤U251细胞增殖的影响

目的 构建shRNA-PAX6慢病毒载体并观察其对胶质瘤U251细胞增殖的影响.方法 根据文献报道的PAX6靶点序列,设计两条PAX6基因的siRNA靶点干扰序列,引物退火形成带粘性末端的双链,与经BamH I、EcoR I双酶切后线性化的慢病毒载体进行连接、转化,构建shRNA-PAX6慢病毒重组载体,再经菌落PCR及测序鉴定重组载体;在293T细胞中包装病毒,将包装后的shRNA-PAX6慢病毒重组载体感染U251细胞.Real-time PCR检测PAX6 mRNA的表达水平,Western blot检测PAX6蛋白的表达,MTT法检测U251细胞增殖.结果 慢病毒载体pLKD-CMV-G&NR-U6-shRNA经双酶切后可见线性化的8208 bp大片段,菌落PCR及测序鉴定证实shRNA-PAX6慢病毒重组载体构建成功,构建的shRNA-PAX6慢病毒载体在293T细胞完成包装,测得慢病毒滴度为6.73×108TU/mL;Real-time PCR结果显示,沉默PAX6的表达可见U251细胞PAX6 mRNA表达水平明显低于正常对照组及慢病毒空载体组(P<0.05);Western blot结果显示,PAX6蛋白表达亦明显低于正常对照组及慢病毒空载体组(P<0.05);MTT结果显示,与正常对照组及慢病毒空载体组细胞比较,感染shRNA-PAX6慢病毒重组载体组的细胞,细胞增殖能力明显增强(P<0.05).结论 成功构建人PAX6基因的shRNA-PAX6慢病毒重组载体,沉默PAX6基因的表达,U251细胞的增殖能力增强.     

Id2 shRNA慢病毒载体的构建及其转染后对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的构建能高效敲减分化抑制因子2(Id2)基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,并观察敲减Id2对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法设计并合成特异性针对Id2基因的shRNA序列,将其构建到慢病毒载体pGCSIL-GFP中。以含有Id2基因的质粒为模板,扩增Id2基因cDNA序列的特异性片段,插入真核表达载体pEGFP-N1-3FLAG。构建含Id2基因质粒和不同靶点的RNAi慢病毒载体,共转染入工具细胞293T,筛选出适合浓度慢病毒感染U251细胞株。MTT法检测敲减Id2后胶质瘤细胞增殖的改变,RT-PCR检测Id2敲减后U251细胞caspase 3的表达。结果构建后载体的PCR鉴定及DNA测序结果与预期一致。与对照组相比,转染Id2 shRNA的U251细胞增殖降低,凋亡率升高,caspase3表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建的针对Id2基因的RNA干扰慢病毒载体体外转染可抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡。     

Mig-7通过MEK/ERK信号通路抑制胶质瘤U251侵袭及血管生成拟态

目的研究迁移诱导基因7（Mig-7）通过MEK/ERK信号通路抑制人脑胶质瘤细胞株U251体外血管生成拟态（VM）形成能 力和迁移、侵袭能力的影响。方法采用RNA干扰技术将特异性针对Mig-7基因的sh-Mig-7 转入人脑胶质瘤U251细胞中,并 观察感染效率;用携带有sh-Mig-7和阴性对照（sh-NC）的慢病毒感染U251 细胞后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中 Mig-7的表达水平;采用体外三维培养和Transwell小室侵袭实验观察Mig-7基因沉默对各组U251细胞VM 形成能力和侵袭能 力的影响。采用western-blot检测各组细胞中MEK/ERK的蛋白表达水平。结果携带有sh-Mig-7和sh-NC的慢病毒成功感染 U251细胞,并获得稳定低表达Mig-7基因的U251细胞株;与感染sh-NC慢病毒和未感染病毒的的细胞相比,sh-Mig-7感染组 U251细胞中Mig-7的表达水平以显著降低（P均<0.01）;与空白对照组和sh-NC感染组相比,sh-Mig-7 感染组U251细胞的侵袭 能力明显下降（P<0.01）,并且sh-Mig-7 感染组U251 细胞VM形成能力明显下降（P<0.05）。与空白对照组和sh-NC感染组相 比,sh-Mig-7感染组U251细胞的MEK、ERK蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）。结论沉默Mig -7 基因的表达,可能通过 MEK/ERK信号通路抑制U251 细胞的VM 形成及侵袭能力,提示Mig -7 基因在人脑胶质瘤细胞的VM 和侵袭中发挥重要 的作用。     

siRNA沉默COX-2基因对胶质瘤细胞放射敏感性的影响

目的 利用小分子RNA(small interfering RNA,siRNA)技术体外沉默人胶质瘤细胞COX-2基因表达,探讨其对放射敏感性的影响,以期为胶质瘤的治疗提供新的思路和方法。 方法 体外培养胶质瘤U251细胞,使用siRNA技术构建U251细胞COX-2基因沉默模型,Western blot检测转染后细胞COX-2蛋白表达情况,筛出最适序列。将实验分为对照组与转染组,分别予以2、4、6、8 Gy四个剂量组予以X线照射,实验重复3次,使用MTT法检测辐射后细胞增殖抑制情况,平板克隆形成实验检测细胞存活分数(SF)并通过单击多靶拟合曲线计算增敏比(SER),流式细胞术检测细胞凋亡情况。 结果 转染组COX-2蛋白表达情况较对照组均下降,其中以siRNA600序列降低最为明显,差异具有统计学意义(P<0.05),后续实验均以siRNA600序列进行转染。辐射后转染组的细胞增殖抑制率为(84.87±3.50)%、(63.62±0.35)%、(55.05±4.87)%、(36.85±3.00)%,较对照组增殖抑制作用明显增强,并随放射剂量增加而增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。辐射后的转染组SF低于对照组,且转染组D0为4.110,Dq为1.387,均低于对照组,对照组D0为6.908,Dq为2.772,放射增敏比SER为1.680,差异有统计学意义(P<0.05)。辐射后的转染组细胞凋亡率为(3.63±0.45)%、(6.08±0.87)%、(47.97±2.13)%、(59.56±3.07)%均高于对照组,且在6 Gy、8 Gy照射后升高更为明显。 结论 siRNA技术沉默人胶质瘤U251细胞COX-2基因表达可以提高细胞的放射敏感性,增加了放射后细胞的凋亡率及增殖抑制作用,降低了克隆形成率。      

靶向PTTG和survivin双干扰siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建同时干扰人垂体瘤转化基因(PTTG)和生存素(survivin)基因表达的RNA共干扰载体,并检测其对人脑胶质瘤U251细胞中PTTG基因和survivin基因的干扰作用.方法:根据GenBank数据库中PTTG和survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰PTTG和生存素基因的重组干扰质粒pGene...     

miR-638通过靶向调控Notch 4促进神经胶质瘤细胞的侵袭能力

目的 研究微小RNA-638(miR-638)在恶性胶质瘤中的表达,探讨miR-638在胶质瘤细胞侵袭过程中的作用及可能机制.方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测正常神经组织、胶质瘤组织、正常胶质细胞株、胶质瘤细胞株中miR-638的表达水平;Transwell实验检测分别转染miR-638模拟物和miR-638抑制物后U251细胞侵袭水平的改变;生物信息学预测和验证miR-638对Notch 4的靶向调控关系;构建Notch 4真核表达重组质粒(pCMV-Notch 4 cDNA)过表达U251细胞中的Notch 4表达水平,并检测U251细胞侵袭水平的改变.结果 miR-638在胶质瘤组织和细胞株中表达上调,而Notch 4在胶质瘤细胞中表达下调,两者表达呈负相关性;过表达miR-638使U251细胞的侵袭细胞数上升(P<0.01),而抑制miR-638表达后U251细胞的侵袭细胞数减少(P<0.01);miR-638在U251细胞中能直接靶向抑制Notch 4的表达,提升Notch 4在U251细胞中的表达能使侵袭细胞数减少(P<0.01).结论 miR-638在胶质瘤中高表达,其可能通过靶向抑制Notch 4的表达促进胶质瘤细胞的侵袭能力.