BMP2诱导C3H10T1／2细胞成软骨分化的分子机制研究

目的：探讨骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1／2向成软骨分化的可能分子机制。方法：20μg／mLBMP2诱导C3H10TI／2细胞0,4h,1,3,6,10,13,15d后,RT—PCR检测BMP信号通路中关键分子BMPRI,BMPRII,Smadl／5／8的表达,Westernblot检测smad蛋白及MAPK信号通路中p38磷酸化水平变化,QRT—PCR检测成软骨标志基因aggrecan,Col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平,同时用Alcine Blue染色,观测C3H10T1／2细胞成软骨分化情况。结果：经BMP2诱导后,C3H10T1／2细胞表现出成软骨分化,smad蛋白及p38磷酸化水平有所上升,同时成软骨标志基因col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平都有增加。与未诱导组相比,Col2a1,FGFR3,Sox9在3d的表达与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）,FGFR3,Sox9在6d的表达与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：在一定培养条件下,BMP2具有诱导C3H10T1／2细胞成软骨分化能力。     

低氧诱导因子-1α和VHL对小鼠软骨内成骨过程的调控机制

目的 研究低氧诱导因子1α (HIF-1α)和von Hippel-Lindau (VHL)在成骨细胞水平对小鼠软骨内成骨过程的调控机制.方法 以HIF-1α或VHL基因条件性敲除小鼠为实验对象,分别于4、8、12周龄时,采用组织化学染色观察、显微CT扫描、骨小梁面积测量、钙元素含量检测、四环素荧光双标记观察、Real-time PCR及Western blotting等方法,观察和比较基因敲除小鼠与野生型小鼠(对照组)软骨内成骨过程的差异.结果 与野生型对照小鼠比较,HIF-1α基因敲除组小鼠在软骨内成骨过程中血管内皮生长因子(VEGF)表达减少,新骨形成速度减慢,钙元素含量和骨小梁面积减少(P<0.05);而VHL基因敲除组小鼠在软骨内成骨过程中VEGF表达增加,新骨形成速度加快,钙元素含量和骨小梁面积增加(P<0.001).结论 在小鼠软骨内化骨过程中,VHL/HIF-1α信号通路对VEGF表达具有调控作用,通过调节血管形成,最终影响骨量形成.     

低氧诱导因子-1α和VHL对小鼠软骨内成骨过程的调控机制

目的 研究低氧诱导因子1α (HIF-1α)和von Hippel-Lindau (VHL)在成骨细胞水平对小鼠软骨内成骨过程的调控机制.方法 以HIF-1α或VHL基因条件性敲除小鼠为实验对象,分别于4、8、12周龄时,采用组织化学染色观察、显微CT扫描、骨小梁面积测量、钙元素含量检测、四环素荧光双标记观察、Real-time PCR及Western blotting等方法,观察和比较基因敲除小鼠与野生型小鼠(对照组)软骨内成骨过程的差异.结果 与野生型对照小鼠比较,HIF-1α基因敲除组小鼠在软骨内成骨过程中血管内皮生长因子(VEGF)表达减少,新骨形成速度减慢,钙元素含量和骨小梁面积减少(P<0.05);而VHL基因敲除组小鼠在软骨内成骨过程中VEGF表达增加,新骨形成速度加快,钙元素含量和骨小梁面积增加(P<0.001).结论 在小鼠软骨内化骨过程中,VHL/HIF-1α信号通路对VEGF表达具有调控作用,通过调节血管形成,最终影响骨量形成.     

骨形态发生蛋白-2、-3对胚胎小鼠椎间盘细胞的成软骨及成骨作用

目的探索成骨作用的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)及抑制成骨作用的骨形态发生蛋白-3(BMP-3)对胚胎小鼠椎间盘细胞的成软骨及成骨作用,为BMPs临床治疗椎间盘相关疾病提供实验依据。方法运用腺病毒介导的BMP-2和BMP-3在胚胎小鼠椎间盘细胞中表达,RT-PCR检测Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、蛋白多糖(ACAN)、骨钙素(OC)、骨保护素(OPG)和骨桥蛋白(OPN)成软骨及成骨相关指标mRNA水平的表达,甲苯胺蓝染色检测软骨基质的表达,碱性磷酸酶(ALP)读数及ALP染色检测ALP的活性。结果 BMP-2和BMP-3表达对于椎间盘纤维环(AF)细胞的成软骨和成骨均没有作用。对椎间盘髓核(NP)细胞的软骨相关指标ColⅠ、ColⅡ、ACAN mRNA的表达同样没有影响,但可促进NP细胞的成骨,其中BMP-2和BMP-3均可促进OC mRNA的表达升高,而仅BMP-2可促进其OPG和OPN的mRNA表达升高。甲苯胺蓝染色证明BMP-2和BMP-3对椎间盘细胞软骨基质分泌的影响并不显著。NP细胞在BMP-2和BMP-3腺病毒感染后ALP活性明显增强,在AF细胞中则未观察到这种变化。结论 BMP-2和BMP-3均可促进胚胎小鼠NP细胞的成骨作用,但对AF细胞的成骨及成软骨作用及对NP细胞的成软骨作用没有影响。     

低氧激活ERK／JNK通路促进Smad2／3蛋白磷酸化诱导小鼠心脏成纤维细胞表型转换的实验研究

目的研究体外低氧诱导小鼠心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）向心脏肌成纤维细胞（cardiac myofibroblasts,CMFs）表型转换过程中,促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）信号通路与Smad2／3蛋白磷酸化的关系。方法新生小鼠第1代CFs低氧（37℃、3％O2）无血清培养48h,免疫荧光检测α-SMA蛋白;新生小鼠CFs给予3种MAPK（ERK、JNK和p38）特异性抑制剂常氧培养1h,进行低氧培养30min,免疫印迹检测ERK、JNK、p38和Smad2／3蛋白磷酸化水平。结果①低氧显著上调新生小鼠CFs中α-SMA蛋白的表达;②低氧能显著地促进ERK、JNK和P38蛋白磷酸化,PD98059（ERK特异性抑制剂）、SP600125（JNK特异性抑制剂）和SB203580（P38特异性抑制剂）能抑制低氧诱导的ERK、JNK和P38蛋白的磷酸化;③PD98059（ERK特异性抑制剂）和SP600125（JNK特异性抑制剂）能抑制低氧诱导的Smad2／3蛋白的磷酸化,SB203580（P38特异性抑制剂）无此作用。结论①低氧可诱导小鼠CFs细胞发生表型转化为CMFs;②ERK和JNK信号通路能调控Smad2／3蛋白的磷酸化表达;③MAPK和Smad信号通路可能参与低氧诱导的小鼠CFs细胞的表型转化。     

ERK1/2信号通路参与LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞iNOS表达的调节

目的：探讨ERK1/2信号通路与LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞iNOS表达的关系。方法：采用RT-PCR和蛋白免疫印迹方法观察ERK1/2信号通路特异性抑制剂PD98059对LPS诱导的iNOS表达的影响。结果：PD98059能够以剂量依赖方式抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞iNOS表达。结论：LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞iNOS表达部分依赖了ERK1/2信号通路。     

MEK／ERK信号通路活性表达与乳腺癌干细胞增殖和凋亡的关系

目的探讨MEK／ERK信号通路在乳腺癌干细胞增殖和凋亡中的作用。方法体外培养乳腺癌干细胞,采用MEK抑制剂PD98059抑制MEK／ERK信号通路表达,Western blot检测PD98059对p—ERK1／2表达的影响,进一步应用MTT法测定PD98059对乳腺癌干细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞周期变化;同时,TUNEL荧光染色分析、Histone／DNAELISA和流式细胞术检测评价细胞凋亡。结果PD98059可有效下调p—ERK1／2表达,抑制乳腺癌干细胞生长,诱导G0／G1期抑制;TUNEL荧光染色,Histone／DNAELISA检测和流式细胞术检测分析显示PD98059可有效诱导乳腺癌干细胞凋亡。结论MEK／ERK信号通路在乳腺癌干细胞增殖和凋亡中发挥重要作用。     

持续阻断p44/42MAPK信号通路促进成骨前体细胞系MC3T3-E1分化

目的:探讨p44/42MAPK信号通路对成骨前体细胞系MC3T3-E1分化的调控作用。方法:应用MEK1激酶的特异性抑制剂PD98059持续阻断p44/42MAPK信号通路在成骨前体细胞系MC3T3-E1中的活化;通过组织化学染色试验观察成骨前体细胞碱性磷酸酶活性以及体外钙质沉积情况;半定量RT-PCR试验检测成骨前体细胞特异性基因 mRNA的表达;荧光素酶分析试验测定成骨前体细胞特异性转录因子CBFA1基因启动子的活性。结果:PD98059不仅提高MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性,同时促进成骨前体细胞体外钙沉积和成骨特异基因的表达。而且PD98059作用后成骨特异性转录因子CBFA1启动子的活性也显著提高。结论:持续阻断p44/42MAPK信号通路促进成骨前体细胞分化。     

蛋白激酶CβⅡ负调控小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

目的观察蛋白激酶C(PKC)各亚型在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化中的作用。方法Western blot检测小鼠BMSCs成骨分化中PKC各亚型的活化情况;利用PKC阻断剂GFX分析PKC在BMSCs体外成骨分化中的作用;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测成骨早期分化指标ALP的活性;茜素红染色检测BMSCs体外矿化能力;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测成骨分化相关基因Runx2、Ⅰ型骨胶原a1(ColⅠa1)和ALP的表达情况。结果小鼠BMSCs成骨分化过程中,仅检测到PKCβⅡ亚型活化,其他亚型均无明显活化。利用PKC阻断剂GFX抑制PKCβⅡ活化后,茜素红染色结果显示BMSCs的成骨分化过程受到促进;PCR结果显示成骨分化相关基因Runx2、ColⅠa1和ALP的mRNA水平均有不同程度增加;ALP活性检测结果也显示BMSCs的成骨分化过程受到促进。结论PKCβⅡ可负调控小鼠BMSCs的成骨分化。     

FGF-2真核表达质粒的构建及对C3H10细胞增殖及成软骨分化的影响

目的：构建成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2,FGF-2）真核表达质粒,检测其对小鼠间充质干细胞C3H10增殖、成骨及成软骨分化作用的影响。方法：以质粒pAd-Trace-FGF-2为模板,PCR扩增目的基因FGF-2,经BglⅡ、SalⅠ双酶切后连接至pIRES2-EGFP表达载体中获得pIRES2-EGFP-FGF-2真核表达质粒,脂质体转染到C3H10细胞中,另设pIRES2-EGFP空载体转染对照组和空白细胞对照组。RT-PCR及Western blot法验证各组FGF-2的表达水平,MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖活力及细胞周期分布,RT-PCR检测成骨及成软骨、Wnt信号通路相关基因的mRNA水平表达变化,Western blot法检测Ⅱ型胶原（collagenⅡ,ColⅡ）的表达,甲苯胺蓝染色检测软骨基质的表达。结果：重组表达质粒pIRES2-EGFP-FGF-2经双酶切及测序证实构建正确;质粒转染C3H10细胞后,其FGF-2基因的mRNA和蛋白水平表达较2个对照组明显增高,细胞增殖活力明显增高（P<0.05）,软骨相关标志物Ⅰ型胶原（collagenⅠ,ColⅠ）、ColⅡ、蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）mRNA转录水平较2个对照组均明显增高（P<0.05）,骨钙蛋白（osteocalcin,OC）、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）mRNA转录水平无明显升高（P ＞0.05）,Wnt5a及Fzd8 mRNA转录水平降低（P<0.05）,FGF-2转染组细胞甲苯胺蓝染色呈现紫红色异染。结论：成功构建FGF-2基因重组真核表达质粒,FGF-2过表达可提高C3H10细胞的增殖活力,对C3H10细胞有成软骨效应,但短期成骨效应不明显,可能与下调Wnt5a及受体Fzd8的表达有关。     

牵张应力刺激下Erk1/2在人牙周膜细胞成骨化的作用分析

研究牵张应力刺激下细胞外调节蛋白激酶(Erk)1/2在人牙周膜细胞成骨化的作用,本实验收集行口腔正畸治疗拔除的健康前磨牙,组织块法和消化法原代培养人牙周膜细胞。振幅10%、频率0.5Hz的周期性牵张应力刺激细胞,以不加牵张应力的细胞为对照组;并于牵张应力刺激前分别使用ERK1/2通路抑制剂PD98059处理细胞,ERK1/2显性负性突变体转染细胞。实验结果显示,牵张应力刺激不同时间p-ERK1/2蛋白表达水平均明显提升(P<0.05),其中以刺激1 h、3 h时p-ERK1/2蛋白表达水平最高;ERK1/2蛋白表达水平在牵张应力刺激不同时间差异无统计学意义(P>0.05);牵张应力刺激3、6 h时Runt相关基因2蛋白表达水平明显提升(P<0.05)。加入抑制剂PD98059或ERK1/2显性负性突变体转染后,Runt相关基因2、碱性磷酸酶(ALP)、成骨相关基因骨钙素(OCN mRNA)表达水平明显下调;p-ERK1/2、Runt相关基因2蛋白表达水平明显下调。实验证明,Erk1/2信号通路在牵张应力刺激下牙周膜细胞成功分化中发挥重要作用,Erk1/2被力学刺激激活后可通过上调Runt相关基因2蛋白表达介导成骨相关基因ALP、OCN的表达。     

ERK通路在单核巨噬细胞集落刺激因子调控成纤维细胞血管内皮生长因子表达中的作用

目的 研究单核巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）对成纤维细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响,初步探讨细胞外信号调节激酶（ERK）通路对此过程的调控作用。方法 在对数生长期人皮肤成纤维细胞培养液中添加GMCSF和（或）ERK通路特异性抑制剂（PD98059）进行干预,实验分为空白对照组、PD98059组、GMCSF组及PD98059+GMCSF组。收集各组细胞及培养上清液,采用RT-PCR技术和Western blotting方法分别检测各组人皮肤成纤维细胞内VEGF mRNA和蛋白表达;ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF蛋白分泌水平。结果 与空白对照组和PD98059组比较,GMCSF组人皮肤成纤维细胞内VEGF mRNA和蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中VEGF蛋白质量体积浓度明显升高（P<0.05）;而在GMCSF+PD98059组中,人皮肤成纤维细胞内和细胞培养上清液中相应指标表达水平均显著低于GMCSF组（P<0.05）。结论 GMCSF可促进人皮肤成纤维细胞VEGF表达,ERK通路在此过程中发挥重要作用。     

ERK通路在单核巨噬细胞集落刺激因子调控成纤维细胞血管内皮生长因子表达中的作用

目的研究单核巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）对成纤维细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响,初步探讨细胞外信号调节激酶（ERK）通路对此过程的调控作用。方法在对数生长期人皮肤成纤维细胞培养液中添加GMCSF和（或）ERK通路特异性抑制剂（PD98059）进行干预,实验分为空白对照组、PD98059组、GMCSF组及PD98059＋GMCSF组。收集各组细胞及培养上清液,采用RT-PCR技术和Western blotting方法分别检测各组人皮肤成纤维细胞内VEGFmRNA和蛋白表达;ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF蛋白分泌水平。结果与空白对照组和PD98059组比较,GMCSF组人皮肤成纤维细胞内VEGFmRNA和蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中VEGF蛋白质量体积浓度明显升高（P〈0.05）;而在GMCSF＋PD98059组中,人皮肤成纤维细胞内和细胞培养上清液中相应指标表达水平均显著低于GMCSF组（P〈0.05）。结论 GMCSF可促进人皮肤成纤维细胞VEGF表达,ERK通路在此过程中发挥重要作用。     

ERK信号通路对钛合金诱导成骨细胞RANKL、OPG表达的作用

目的 探讨钛合金颗粒对体外培养的小鼠成骨细胞核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)及骨保护素(OPG)基因表达和蛋白分泌的影响,以及细胞外信号调控激酶1/2(ERK1/2)信号通路在其中的作用.方法 体外培养成骨细胞.实验分3组:对照组(A组);钛合金组(B组):给予浓度为0.1 g/L钛合金颗粒干预;抑制剂组(C组):给予钛合金颗粒+ERK信号通路抑制剂PD98059,每组6个样本.采用RT-PCR和ELISA法分别检测成骨细胞RANKL、OPG基因和蛋白表达.结果 3组各个时间点均可见RANKL、OPG的表达;但B组RANKL、OPG mRNA的表达和蛋白分泌量以及RANKL/OPG比值显著高于A组(P<0.01);而C组RANKL、OPG mRNA的表达和蛋白分泌水平以及RANKL/OPG比值的增幅显著小于B组(P<0.01).结论 钛合金颗粒可刺激成骨细胞RANKL mRNA、OPG mRNA的表达并促进RANKL、OPG蛋白的分泌,增加RANKL/OPG比值;ERK信号通路抑制剂PD98059可一定程度抑制RANKL和OPG的表达,降低RANKL/OPG比值,对减少假体周围骨溶解的发生可能起重要作用.     

大鼠神经干细胞中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号转导通路的实验研究

 目的应用丝裂原激活的蛋白激酶激酶(MAPKK/MEK)特异性阻滞剂PD98059孵育大鼠神经干细胞(NSC),探讨MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路在NSC中的作用。方法体外分离、培养大鼠NSC,应用不同浓度的PD98059孵育NSC后进行WTS-8、Nestin,BrdU、β-tubulin-Ⅲ、Western
      blot检测。结果PD98059对NSC的存活、增殖和分化的影响呈剂量依赖性,在PD98059较高浓度时NSC的存活率明显下降(P<0.05),BrdU和β-tubulin-Ⅲ的阳性细胞数明显少于正常对照组(P<0.05)。PD98059阻断ERK表达的作用呈剂量依赖性。结论MAPKK/MEK-MAPK/ERK信号通路对大鼠NSC的存活、增殖、分化起重要作用。     

高糖引起小鼠肾小球足细胞podocalyxin蛋白的表达下调

目的:探讨高糖对肾小球足细胞podocalyxin蛋白表达的影响及其信号途径.方法:免疫组织化学法检测db/db(自发糖尿病小鼠)肾小球足细胞podocalyxin蛋白表达,野生型小鼠(WT鼠)为对照,计算机图像半定量分析.以体外培养的足细胞为研究对象,应用Western印迹分析技术,检测高糖培养不同时间点对足细胞表达podocalyxin蛋白的影响; 检测细胞外信号调节激酶(ERK1/2)信号途径的活化,及其特异性阻断剂PD98059对podocalyxin蛋白变化的阻断效应.结果:免疫组织化学半定量分析显示db/db小鼠肾小球podocalyxin蛋白表达明显少于对照组[(0.18±0.07)比(0.25±0.05), P＜0.05].培养的足细胞表达基础水平的podocalyxin蛋白,高糖培养不同时间点其表达均下降,以第6天最明显(为对照组的5.5%, P＜ 0.01),正常糖和甘露醇组没有明显变化.高糖可以活化足细胞ERK1/2信号途径,于培养30 min时ERK1/2开始活化,6 h达高峰,持续活化至24 h,至48 h时接近基础水平;高糖培养不能活化P38和 JNK.正常糖和甘露醇在各个时间点均不影响丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路.ERK1/2特异阻断剂PD98059可以消减高糖引起的podocalyxin表达下降的效应.结论:自发糖尿病小鼠的肾小球足细胞podocalyxin蛋白表达下降.高糖经ERK1/2信号通路下调体外培养的足细胞podocalyxin蛋白表达.     

小鼠胫骨骨折愈合中FGFR3基因表达的原位定位

目的观察成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因在小鼠胫骨骨折愈合中的时空表达模式,分析FGFR3在骨折愈合中可能的作用.方法选用标准的小鼠胫骨骨折模型,常规石蜡切片,观察FGFR3 mRNA在骨折愈合过程中不同时期的基因表达情况.结果骨折后软骨痂中前软骨细胞中出现微弱的FGFR3 mRNA信号.至7 d,骨痂肥大前软骨细胞和肥大软骨细胞中均可见FGFR3 mRNA强阳性表达.到14 d和28 d,骨痂软骨细胞被成骨细胞取代,FGFR3阳性表达信号消失.结论 FGFR3在小鼠胫骨骨折愈合中的肥大前软骨细胞和肥大软骨细胞中表达,提示参与调节胚胎骨骼发育中软骨细胞增殖的FGFR3基因,可能在成年骨折愈合中参与调节了软骨细胞的分化而影响骨折愈合.     

乃豆蛋白A通过ERK信号分子对小鼠脾脏细胞表达纤维化蛋白的诱导作用

目的：探讨刀豆蛋白A（ConA）对小鼠脾脏细胞表达纤维化蛋白（FBRS）的诱导作用及可能的分子信号机制。方法：选择雄性BALB／c小鼠,制备小鼠脾脏细胞悬液。采用实时荧光定量PCR检测ConA刺激不同时间脾脏细胞后FBRS的mRNA表达水平,Westernblot检测ConA刺激不同时间后FBRS的蛋白表达水平,以及信号通路阻滞剂对FBRS的蛋白表达的影响和ConA对胞外信号调节激酶（ERK）信号表达的活化作用。结果：ConA能刺激小鼠脾脏细胞FBRS的mRNA和蛋白表达,ERK信号通路阻断剂PD98059可以明显抑制ConA引起的FBRS蛋白表达,且ConA刺激后能够明显活化ERK的表达。结论：ConA可通过活化ERK信号通路,诱导小鼠脾脏细胞FBRS的表达。     

ERK1/2信号通路在OX-LDL诱导的血管平滑肌细胞TLR4 mRNA表达中的作用

目的探讨ERK1/2信号通路在氧化性低密度脂蛋白（OX-LDL）诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）Toll样受体-4（TLR4）mRNA表达中的作用。方法采用贴块法培养大鼠VSMCs,在氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）及PD98059（ERK1/2特异性抑制剂）作用下采用RT-PCR检测VSMCs TLR4 mRNA的表达,用Westernblotting检测ERK1/2磷酸化水平的变化。结果OX-LDL使VSMCs ERK1/2磷酸化水平升高;PD98059抑制ERK1/2的磷酸化;OX-LDL刺激VSMCs上调TLR4 mRNA的表达（P〈0.05）;PD98059预孵育后TLR4 mRNA的表达较单独OX-LDL刺激情况下降低（P〈0.05）。结论OX-LDL通过或部分通过ERK1/2信号通路介导VSMCs TLR4 mRNA的表达。