四种气管上皮细胞分离培养方法的比较研究

目的：比较四种不同的方法在培养气管上皮细胞中的异同，改进其培养技术，为组织工程气管提供种子细胞。方法：用两步酶消化法（使用0.1％ Dispase 4℃消化18h后，用0．25％的胰酶37℃消化5min）、Dispase冷消化法（用0．1％Dispase 4℃消化18h）、胰酶温消化法（0．25％的胰酶37℃消化10min）和机械刮刷法四种方法分离、培养兔气管上皮细胞，测定分离细胞的数量和纯度。结果：两步酶消化法、Dispase冷消化法较其他两种方法得到的气管上皮细胞纯度高，细胞状态好；Dispase冷消化法得到细胞数量较其他方法少，其余三种方法得到的细胞数统计学上不存在差异。结论：两步酶消化法较其他方法所得细胞数量多、纯度高、细胞成活率高，是一种较好的气管上皮细胞体外分离培养方法。     

不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的比较研究

目的比较不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的效率,确定体外培养兔结膜上皮细胞的最佳方法,建立兔结膜上皮细胞系,为进一步研究结膜上皮干细胞的鉴别、定位及其增殖分化提供基础。方法分别采用DispaseⅡ消化法、组织块培养法、胰酶／EDTA混合消化法获得兔结膜上皮细胞后进行体外培养,在不同时间观察细胞的形态,并应用免疫组化的方法进行细胞鉴定。结果组织块培养法细胞生长较慢,胰酶／EDTA混合消化法容易有成纤维细胞等污染,DispaseⅡ化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞,细胞生长增殖快,免疫荧光pan-cytoeratin染色阳性．部分细胞MUC5AC染色阳性。结论DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的最佳方法。     

小鼠气管上皮细胞的气液相界面培养

目的通过气液相界面培养将小鼠气管上皮细胞诱导分化成具有纤毛和黏液分泌功能的上皮细胞,从功能和结构上,使其更贴近体内气管上皮细胞的自然生长状态。方法采用低温酶消化法、气液相界面培养、无血清条件培养基培养小鼠的气管上皮细胞,通过扫描电镜以及细胞免疫化学观察和鉴定细胞。结果此方法获得的细胞具有纤毛和黏液分泌功能。细胞角蛋白表达阳性。结论低温酶消化法、小鼠气管上皮细胞气液相界面培养的细胞更贴近生理状态,为进一步研究呼吸系统疾病提供了良好的模型。     

不可分型流感嗜血杆菌对气管黏膜上皮细胞的作用

目的:探讨不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)与气液界面无血清培养原代兔气管黏膜上皮细胞的相互作用.方法:利用低温酶消化法分离兔气管黏膜上皮细胞,无血清培养液及胶原覆盖膜形成的气液界面培养,使上皮细胞分化成假复层黏膜纤毛上皮细胞,然后加入NTHi感染上皮细胞,通过扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察其形态结构变化.结果:NTHi感染24 h后,SEM示气管黏膜上皮细胞表面结构破坏,90%细胞凋亡或死亡,纤毛倒伏、断裂,细菌与非纤毛上皮细胞连接;TEM示细菌黏附在细胞表面,细胞表面有较多微绒毛,伴微绒毛延伸或伪足包绕细菌,将其吞噬胞内.结论:NTHi黏附在上皮细胞表面,上皮细胞通过伪足形成和微绒毛延伸包绕细菌,将细菌吞噬在胞内;NTHi对上皮细胞有毒性作用,致细胞变性坏死或凋亡.     

气管黏膜上皮细胞无血清培养的初步实验研究

目的:探讨应用无血清培养液培养气管黏膜上皮细胞的可行性。方法:取4只Beagle犬的气管黏膜,在无血清培养基中分别采用酶消化分散法、机械分散法、组织块培养法行气管黏膜上皮细胞的体外培养,于培养后的第10天、第14天和第16天行细胞学观察、扫描电镜观察和纤毛运动频率的测量。结果:酶消化分散法和机械分散法培养的气管黏膜上皮细胞生长缓慢,无纤毛长出。组织块培养法培养的气管黏膜上皮细胞增殖较旺盛,有纤毛生长。纤毛摆动频率最大值为9.33Hz,最小值为3.85Hz,平均(6.8±0.52)Hz。结论:应用无血清培养液可进行气管黏膜纤毛上皮细胞的体外培养。组织块培养法培养的纤毛上皮细胞的分化能力保持较好。     

豚鼠支气管平滑肌细胞的分离

目的　探讨豚鼠支气管平滑肌细胞的分离方法。方法　通过链霉蛋白酶E消化气管和肺组织 ,并辅以离心、机械吹打等手段 ,获取细胞后观察其形态、数目。结果　获得带状或纺锤状细胞 ,其细胞膜光滑、胞质均匀、核呈圆形或椭圆形 ;用乙酰胆碱刺激细胞能产生收缩。结论　用酶消化 30min ,以 12 0 0r/min离心 60min ,可获得形态较好、数目多、收缩良好的支气管平滑肌细胞     

TCP液在兔眼虹膜色素上皮细胞培养中的应用

目的寻求一种更好的培养兔眼虹膜色素上皮细胞的方法。方法采用TCP液和胰酶消化与培养IPE细胞,对比消化后的细胞形态及贴壁率。结果TCP液消化获取IPE细胞分散均匀,细胞呈圆形,胞质内充满棕黑色颗粒,几乎见不到细胞核,贴壁率为83.6%±2.3%。胰酶消化细胞多呈现絮状、团块及集落样,单个细胞散在,数量较低细胞贴壁率为67.7%±3.5%。结论TCP液对于消化获取IPE细胞较胰酶有更好的效果。     

采用组织工程技术建造人工膀胱组织的实验研究

目的　通过将扩增的膀胱种子细胞与一定形状聚合材料复合后植入裸鼠体内进行培育 ,尝试采用组织工程技术建造人造膀胱组织的可行性。方法　从幼兔取膀胱 ,机械分离与酶消化获取上皮细胞和平滑肌细胞 ,在体外培养并扩增细胞 ,之后将上皮细胞和平滑肌细胞分别接种到聚合材料的内外表面 ,将其植入到裸鼠体内进行培育。对植入术后4、8周的标本取材 ,进行大体、组织学观察及免疫组化检测。结果　培育的细胞材料复合体的内壁可形成数层移行上皮细胞层 ,外壁由数层平滑肌细胞层构成。随着聚合材料的降解 ,移行上皮细胞与平滑肌细胞不断增殖并达汇合。结论　采用组织工程技术可再造出类似于正常膀胱壁的人造膀胱组织     

大鼠气管上皮细胞体外培养方法及生长条件

体外原代气管上皮细胞培养技术近年来有较快的发展,主要应用于呼吸毒理学和呼吸道肿瘤方面的研究。从最早整段气管组织的体外培养发展到现在以酶消化法获取纯的气管上皮细胞进行体外培养。在培养方法的研究中比较注重对不同种属动物的气管上皮细胞最适合的培养条件选择,从而提高细胞的增殖能力和生存时间。本文介绍了我们在建立原代大鼠气管上皮细胞培养方法中,对细胞的培养条件和生长规律方面的一部分研究工作。     

小鼠气管–支气管上皮细胞的气–液界面培养

目的建立一种小鼠气管–支气管上皮细胞气–液界面(ALI)培养及纤毛摆动频率测量的方法,最大程度还原气道上皮的生理功能。方法利用1 mg/mLⅪⅤ型链蛋白酶冷消化的方法获取BALB/c小鼠气管–支气管上皮细胞,筛选出最佳消化时长以保证所得细胞的数量及活力。差速贴壁法去除成纤维细胞后,接种于Ⅰ型鼠尾胶原预包被的Transwell小室,用不同培养基进行增殖期和ALI分化期培养。结果采用链蛋白酶冷消化12 h、14 h和16 h所得细胞数目分别为(1.78±0.33)×10~5、(1.93±0.26)×10~5和(2.01±0.28)×10~5,经台盼蓝染色活细胞率分别为(96.86±0.25)%、(94.73±1.63)%和(86.87±5.95)%。1周左右细胞铺满小室,继续ALI培养2～3周后光学显微镜下可见纤毛节律性摆动,电镜及免疫荧光均证实纤毛结构。培养所得细胞纤毛摆动频率与小鼠气管在体纤毛摆动频率与一致。结论本实验建立的气管–支气管上皮细胞分离、ALI培养及纤毛摆动频率测量体系简便、稳定、高效、可靠,为探索气道疾病的致病和治疗机制创造了基础,亦可为其他物种气道上皮和(或)其他器官上皮的培养提供参考依据。     

Technique of enzyme digestion adding brushing for isolating bronchial epithelial cells]

This study improved the previous techniques of harvesting rabbit bronchial epithelial cells. With 0.05% of trypsin on the epithelial side of trachea and bronchus, a mild digestion was used before a brushing protocol. The cells were identified with immunocytochemistry and electron microscope, both the cell viability and the membrane integrity of cells were evaluated. A comparison analysis of this method with the simple mechanic brushing and the simple digestion method were done. The results showed that, with this method, cells in a high purity and high viability could be obtained and the recovered cell number could be enough for experiments. It can be concluded that the method is useful and effective for isolating bronchial epithelial cells especially for small animals.     

人支气管上皮细胞体外不同培养基培养效果比较

目的：比较胎牛血清培养基,小牛血清培养基对经纤维支气管镜（纤支镜）刷检人支气管上皮细胞培养存活率的差异。方法：采用不同细胞培养液,对经纤支镜刷检获得的人支气管上皮细胞进行原代培养,并通过倒置相差显微镜观察原代培养细胞,比较细胞的存活率。结果：胎牛血清培养基细胞成活率比其他培养基高。结论：胎牛血清培养液可提供较为满意的生长条件。     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

大气细颗粒物对人支气管上皮细胞的活性抑制和炎性作用

目的：研究大气细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)对人支气管上皮细胞活性的影响及其炎性作用。 方法：用PM2.5采样器采集上海地区大气PM2.5样本,扫描电镜观察PM2.5形态特征。将人支气管上皮细胞BEAS-2B暴露 于不同浓度(0,50,100,200,400,800 μg/mL)的PM2.5 12,24,48 h,细胞活力检测试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)法检测PM2.5暴露对细胞活性的影响。实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测细胞粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和TNF-α mRNA的表达,Western印迹检测 GM-CSF和TNF-α蛋白的表达。结果：扫描电镜观察发现,PM2.5形态多样,大小不一,直径大多等于或小于2.5 μm。 与同时间点未暴露组比较,各暴露组(50~800 μg/mL)细胞活性呈不同程度的下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与 未暴露组比较,暴露于100,400或800 μg/mL PM2.5 24 h后,GM-CSF和TNF-α mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05), 且PM2.5暴露浓度越高,GM-CSF和TNF-α的mRNA和蛋白升高水平越显著。结论：大气PM2.5可引起人支气管上皮细胞 的炎症反应,降低细胞活性,这可能与PM2.5促发和加重支气管肺部炎性疾病有关。     

Polymorphism of apolipoprotein A5 is a risk factor for cerebral infarction in type 2 diabetes

Summary To establish a better method of primary culture for alveolar epithelial type II cells (AEC II) and to study its bionomics, alveolar epithelial type II cells were isolated by digestion with trypsin and collagenase, which were then purified by plated into culture flask coated with rat immunoglobulin G. The purified AEC II were identified by alkaline phosphatase staining, electron microscopy, immunocytochemical staining of pulmonary surfactant protein A (SPA). The SPA expression and transfection characteristics were compared with those of A549 cell line. The results showed that AEC II could be isolated by digestion with trysin and collagenase and purified by adhesive purification by using IgG, with a yield of about 2–3 × 10⁷, and a purity of about 75%–84%. Cells could be quickly identified with AKP staining. AEC II were different from A549 cell line in terms of SPA expression and transfection characteristics. It is concluded that adhesive purification with IgG can improve the purity of AEC II, and AKP staining is simple in cell identification. AEC II can not be completely replaced by A549 cells in some studies because the differences between them, such as SPA expression. This project was supported by grants from the National Natural Sciences Foundation of China (No. 30500224 and No. 30400193).     

三种人脐静脉内皮细胞分离方法的比较

目的 建立人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分离和培养的方法.方法 分别采取“灌注消化法”、“机械刮取法”和“灌注搓揉法”来分离HUVECs.通过苔盼蓝排斥法检测细胞活力并计数,进行免疫荧光法鉴定,比较这3种方法在获取的细胞数目、细胞活力和纯度方面的差异.常规进行细胞的原代培养和传代培养.取第3代培养细胞绘制细胞生长曲线,根据细胞生长特点,形态及表型特征对培养细胞进行鉴定.结果 “灌注搓揉法”所分离的细胞无论从细胞数目、细胞活力和纯度方面均优于传统的“灌注消化法”和“机械刮取法”.培养的细胞从形态、生长特点和表型鉴定证实为血管内皮细胞（ECs）.结论 “灌注搓揉法”是一种获取血管ECs成功率高,可靠的方法.     

子宫内膜异位症体外细胞模型的建立

目的从子宫内膜组织分离腺上皮细胞和间质细胞，建立子宫内膜异位症体外多细胞模型。方法收集子宫内膜异位症和其他良性疾病的在位子宫内膜，采用高浓度胶原酶消化法进行内膜细胞的原代培养，以及传代培养。观察两组细胞形态，SABC免疫细胞化学进行细胞鉴定，MTT法绘制两组细胞的生长曲线。结果高浓度胶原酶消化后，子宫内膜异位症组和对照组腺上皮细胞和间质细胞大部分在48h内都能贴壁；腺细胞平均生长时间为6周；间质细胞平均生长时间为15周。腺上皮细胞角蛋白（cytokeratin）免疫细胞化学染色呈阳性，渡形蛋白（vimentin）为阴性；间质细胞角蛋白染色为阴性，而波形蛋白为阳性。两组生长曲线接近。结论高浓度胶原酶消化法建立子宫内膜异位症体外多细胞模型简单、易行。子宫内膜异位症在位内膜细胞的形态、生长和正常内膜细胞无明显差异。可以用作研究子宫内膜异位症细胞基因型特征、及其他因素对异位内膜细胞的影响的模型。     

小鼠子宫内膜上皮细胞的分离和原代培养

目的 建立一种高效的子宫内膜上皮细胞分离和体外培养方法,为子宫疾病的发病机制或治疗药物筛选的进一步研究提供一个比较理想和有价值的的实验模型.方法 用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养小鼠子宫内膜上皮细胞,以上皮细胞角蛋白为抗原的免疫荧光法对分离培养的细胞进行纯度鉴定.结果 小鼠子宫内膜上皮细胞培养4～...     

睾丸FasL+Sertoli细胞的制备及功能测定

目的 简化大鼠睾丸支持细胞分离培养方法,获取高成活率、高数量、高表达的Fas配体阳性支持细胞。方法 取2～3周龄大小的Wistar雄性大鼠．应用胶原酶、胰蛋白酶及脱氧核糖核酸酶消化制备大鼠睾丸支持细胞,体外与活性淋巴细胞共同培养,了解其对淋巴细胞的杀伤作用。用不同方法进行形态学观察、鉴定,免疫组化检测Fas配体和卵泡刺激素受体的表达情况,进一步鉴定睾丸支持细胞。结果 大鼠睾丸支持细胞的分离培养中,支持细胞存活率在90％以上．并有明显的Fas配体表达。支持细胞可杀伤与之共同培养的活性淋巴细胞。结论 本法提高了支持细胞的获取量,获取的对活性淋巴细胞具有的杀伤作用的Fas配体阳性睾丸支持细胞可以作为联合移植的供体,发挥其局部免疫豁免作用。     

树鼩角膜原代上皮细胞的分离培养、纯化与鉴定

目的 建立树鼩角膜上皮细胞(CECs)稳定的体外培养技术,为人类角膜疾病研究提供新的实验材料.方法 使用改进的双酶消化法取得树鼩CECs,用转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂配合梯度消化对树鼩CECs进行纯化,角蛋白3/12抗体对CECs进行免疫荧光检测及鉴定.结果 优化的酶消化法可以快速、有效得到高纯度的树鼩CECs. TGF-β抑制剂及梯度消化法可以达到良好的纯化目的,纯化的CECs在传代过程中仍保持良好形态.树鼩CECs免疫荧光染色显示角蛋白3/12单克隆抗体阳性.结论 成功建立了一种有效、简单、经济适用的树鼩角膜上皮原代细胞的体外培养技术,所获得的原代细胞具有较好的上皮细胞形态特征并可以连续传代,为眼科疾病的研究提供一种新材料.