重组hPTEN基因修饰对PDGF诱导的体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响

目的:探讨重组hPTEN基因修饰对PDGF诱导的体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响及具体作用机制.方法:构建真核表达质粒pcDNA4/myc-His-PTEN,通过脂质体介导转染VSMC细胞.MTT法检测在人PDGF条件培养基诱导下转染后的VSMC细胞及未转染的VSMC细胞的增殖情况.实验分6组,采用RT-PCR方法观察各组细胞Akt和NF-κB的mRNA表达.结果:经脂质体介导转染人VSMC细胞系,RT-PCR检测证实PTEN在VSMC细胞内稳定表达.MTT法检测转染后的VSMC细胞可抑制PDGF诱导的体外培养血管平滑肌细胞( VSMC)的增殖.RT-PCR结果显示,在各组细胞Akt及NF-κB均有表达,PDGF组与空白对照组比较,AktmRNA及NF-κB mRNA呈高表达,而LY294002组、PDTC组及PTEN组VSMCs中AktmRNA及NF-κ B mRNA表达量均较PDGF组显著降低.结论:PTEN基因转染在一定程度上可抑制PDGF诱导的体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖.     

阻断ERK2信号转导通路对血小板源生长因子-BB诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移和表达转化生长因子-β1的影响

目的 观察ERK2信号转导通路在血小板源生长因子(PDGF-BB)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移和表达转化生长因子(TGF)-β1中的作用.方法 将原代培养的大鼠VSMC分为4组:(1)对照组;(2)PDGF刺激组;(3)Ad-LacZ组;(4)Adanti-ERK2组.用Westernblot检测细胞磷酸化ERK2蛋白水平;噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖率;流式细胞仪检测细胞细胞周期;Boyden小室测定细胞的跨膜迁移能力;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养液上清中TGF-β1的浓度.结果 Adanti-ERK2组和对照组细胞增殖率、S期细胞百分比及跨膜迁移细胞数目明显低于PDGF刺激组和Ad-LacZ组(细胞增殖率:2.75%、0.00%比64.45%、61.88%;s期细胞百分比:14.18%、13.58%比38.14%、32.99%;跨膜迁移细胞数:8.2±3.2、6.3±2.6比24.8±6.1、23.3±5.8,均P<0.05);(2)Adanti-ERK2组和对照组细胞培养上清液中TGF-β1含量明显低于PDGF刺激组和Ad-LacZ组(P<0.05);而Adanti-ERK2组明显高于对照组(P<0.05).结论 ERK2信号转导通路参与调控PDGF-BB诱导的VSMC增殖、迁移和基因表达.反义ERK2基因预先转染阻断ERK信号转导能显著抑制PDGF-BB刺激的VSMC增殖、迁移,阻断细胞周期由G1期进入S期,并且部分下调TGF-β1的合成分泌.     

丝裂素激活蛋白激酶活化与肾小管上皮细胞生物学行为的关系

目的探讨丝裂素激活蛋白激酶(MAPK)信号通路对血小板源生长因子(PDGF)诱导肾小管上皮细胞表型转化的作用及其对细胞移行能力的影响.方法以PDGF(20 ng/ml)刺激培养的人近端肾小管上皮HK-2细胞,分别观察细胞形态、增殖和移行能力的变化.采用蛋白免疫印记法检测MAPK各亚类活性及α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达,同时观察分别采用细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38信号通路特异阻断剂PD98059、SP600125和SB203580后上述指标的变化.结果 PDGF刺激6～12 h使α-SMA表达上调近2倍,但刺激24～48 h反而使α-SMA表达低于基础水平.PDGF刺激24 h后HK-2细胞从立方形转变为梭形,细胞虽尚无增殖反应但移行能力增强至3倍(P＜0.01).PDGF诱导的ERK、JNK和p38活性均在2 min时迅速增高,分别在2～5 min达高峰,分别为基础水平的5.7倍、2.6倍和1.6倍(P＜0.05),ERK和JNK活性增高可持续至120 min,而p38活性则于60 min以后恢复至基础水平.在PDGF刺激24 h的情况下,PD98059和SP600125不影响基础状态及PDGF对α-SMA表达的作用,但SP600125可抑制PDGF上调的细胞移行能力(P＜0.01);而SB203580既可抑制α-SMA的基础表达(P＜0.01)及PDGF下调的α-SMA表达(P＜0.001),同时还可显著抑制PDGF诱导的细胞移行能力(P＜0.05).结论 PDGF可刺激MAPK的不同亚类信号通路磷酸化,并可诱导肾小管上皮细胞形态改变及其移行能力增强.在PDGF诱导的表型转化和移行功能改变中,ERK信号通路无介导作用,JNK通路主要与细胞移行能力变化相关,而p38可能是调控α-SMA表达和细胞移行改变的主要信号通路.     

丹参酮ⅡA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及机制探讨

目的:观察丹参酮ⅡA(TanⅡA)对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖与迁移的影响。方法:采用CCK8法筛选VSMC增殖的最适胎牛血清(FBS)浓度,然后将VSMC分为3组:(1)对照组:VSMC加入5%FBS培养液;(2)增殖组:VSMC加入30%FBS培养液;(3)TanⅡA干预组:110 mg/L TanⅡA+30%FBS;220 mg/L TanⅡA+30%FBS;340 mg/L TanⅡA+30%FBS,分别培养24、48、72 h后检测细胞增殖情况;伤口愈合实验观察VSMC迁移指数;免疫细胞化学法检测细胞血小板生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)的表达变化;应用Western blot法观察细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及金属基质蛋白酶2(MMP2)、金属基质蛋白酶9(MMP9)的表达情况。结果:与增殖组相比,TanⅡA干预后细胞增殖明显缓慢,其抑制作用呈时间、剂量依赖性,20 mg/L TanⅡA干预48 h对VSMC增殖的抑制作用比较显著,且无明显细胞损伤。伤口愈合实验显示TanⅡA干预后VSMC的迁移指数明显低于增殖组(P0.05);免疫细胞化学结果显示,与增殖组相比,TanⅡA干预后PDGF表达减少,差异具有统计学意义(P0.05),各组间b FGF表达差异无统计学意义;Western blot结果显示,与增殖组比较,TanⅡA干预组随药物浓度的提高,Bcl-2、MMP2、MMP9表达水平降低,Bax提高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:20 mg/L TanⅡA对高浓度FBS诱导的VSMC增殖与迁移的抑制作用较为明显,且无明显细胞损伤,其抑制作用可能与调节Bcl-2、Bax表达,阻断PDGF、MMP2、MMP9生长因子活化有关。     

血小板源生长因子通过PI3K/AKT途径促肝星状细胞增殖与Ⅰ型胶原合成

目的研究磷脂酰肌醇3激酶（P13K）特异性的抑制剂LY294002对血小板源生长因子（PDGF）诱导的肝星状细胞增殖与I型胶原合成的影响，并初步探讨P13K信号通路在PDGF诱导肝星状细胞活化中的机制。方法HSC细胞用LY294002和PDGF—BB共同孵育处理。收集细胞和培养液上清。细胞增殖用噻唑蓝（MTr）法检测，I型胶原蛋白用ELISA法检测，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测I型胶原mRNA的表达。利用P13K通路下游效应物AKT作为活化指标，ELISA法检测AKT和磷酸化AKT蛋白的表达。结果PDGF—BB能激活P13K通路，并导致AKT磷酸化。LY294002抑制P13K信号通路后，PDGF—BB刺激的HSC—T6增殖与促I型胶原合成作用被抑制。结论PDGF促HSC增殖和I型胶原合成是通过P13K信号通路，其作用可以被P13K抑制剂LY294002抑制。     

SHH信号通路参与FOXQ1基因对胃癌细胞凋亡诱导作用的实验研究

目的 :探讨Sonic Hedgehog(SHH)信号通路是否参与转录因子叉头框Q1(FOXQ1)基因诱导的胃癌细胞凋亡。方法:采用q RT-PCR检测永生化胃黏膜上皮细胞及不同胃癌细胞系中FOXQ1的表达情况,FOXQ1 siRNA转染人胃癌SGC-7901细胞设为si-FOXQ1组,同时设置转染正常对照组(Normal)和阴性对照组(si-Control),q RT-PCR和Western blot检测FOXQ1基因和蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测Bax和Cleaved Caspase3蛋白及SHH信号通路相关蛋白SHH、Smo及下游分子Gli1和Gli3蛋白表达水平。结果:FOXQ1在胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达显著低于胃癌细胞(P0.05),胃癌SGC-7901细胞中FOXQ1的表达最高,作为后续实验研究对象。转染FOXQ1 siRNA后SGC-7901细胞中FOXQ1的表达显著下降(P0.05)。si-FOXQ1组凋亡率及Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达显著高于si-Control组(P0.05),而SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达显著低于si-Control组(P0.05)。Normal组和si-Control组间以上各指标差异无统计学意义(P0.05)。SHH特异性激活剂purmorphamine能够逆转转染FOXQ1 siRNA诱导的SGC-7901细胞凋亡。结论:FOXQ1基因在胃癌细胞中呈高表达,SHH信号通路参与FOXQ1基因对胃癌SGC-7901细胞凋亡的诱导作用,通过上调Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达来实现。     

Hedgehog信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响

目的 研究特异性阻断hedgehog信号通路对人胰腺癌Mia PaCa-2细胞增殖的影响.方法 用Western blot方法检测7种胰腺癌细胞系中hedgehog信号蛋白表达情况,筛选出hedgehog通路活化明显的Mia PaCa-2细胞系进行研究;应用特异性hedgehog通路阻断剂KAAD-cyclopamine阻断Mia PaCa-2细胞的hedgehog信号通路,Western blot方法检测Gli1蛋白表达变化;MTT法检测阻断hedgehog信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响;RT-PCR方法检测胰岛素样生长因子2(IGF2)mRNA表达的变化.结果 KAAD-cyclopamine处理后hedgehog信号通路中关键效应蛋白Gli1表达水平明显下调(P=0.032);KAAD-cyclopamine明显抑制胰腺癌Mia PaCa-2细胞增殖,其作用呈剂量及时间依赖性;阻断hedgehog信号通路后,胰腺癌细胞中胰岛素样生长因子2(IGF2)mRNA表达水平下调(P=0.037).结论 Hedghog信号通路异常活化参与促进胰腺癌细胞增殖;特异性阻断hedgehog信号通路后胰腺癌细胞增殖明显受抑制,其部分机制可能通过下调IGF2表达水平实现.     

丝裂素活化蛋白激酶信号转导途径对血小板源生长因子所致鼠肾系膜细胞表型转化的调控作用

目的 研究血小板源生长因子（PDGF）对肾小球系膜细胞（MC）表型转化的影响,并探讨丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号转导途径在其作用中的调控机制。方法 以体外培养的大鼠MC为对象,观察PDGF对细胞增殖、α-平滑肌肌动蛋白（SMA）表达和细胞内c-Jun氨基末端激酶（JNK）活性的作用;观察细胞外信号调节激酶（ERK）途径上游信号MEK-1阻断剂PD98059对PDGF所致上术作用的影响;应用raf-1基因转染并稳定高表达的MC观察其对α-SMA表达,细胞形态及其超微结构的影响。结果 PDGF可刺激MC持续增殖;刺激6～48h可使α-SMA表达增加,但持续刺激72h以上则可导致其表达被抑制近50%,PDGF对JNK活性无明显影响,阻断ERK活化不影响JNK活性及PDGF对α-SMA表达的短时刺激作用。Raf-1蛋白激酶稳定高表达的MC细胞内α-SMA表达缺失,同时细胞内微丝、微管结构减少,细胞形态改变。结论 PDGF对系膜细胞表型转化的影响表现为促进细胞持续增殖、短时作用刺激α-SMA表达而持续作用则抑制α-SMA表达,提示其为具有调控MC增殖和分化双重作用的细胞因子。PDGF的作用可能与MAPK不同亚类的调控有关,其中Raf-1和JNK活性可能对细胞表型具有关键调控作用。     

sonic hedgehog信号通路蛋白在人胚胎前列腺发育不同阶段的表达及意义

目的:探明son ic hedgehog信号通路中几个关键的效应蛋白son ic hedgehog(SHH)、Patched1(PTC1)、Smoothened(SMO)及GLI1在人胚胎前列腺组织中的定位表达及变化。方法:应用免疫组织化学方法研究SHH、PTC1、SMO及GLI1在不同胎龄(10~39周)人胚胎前列腺组织中的表达变化情况。结果:随胎龄增大,SHH、PTC1、SMO及GLI1在前列腺组织中的表达水平呈由弱变强,由强渐弱,又由弱转强的双峰变化趋势。SHH和SMO仅表达在胚胎前列腺上皮细胞中;而PTC1和GLI1主要表达在上皮细胞外,也可表达在腺体周围的间质中。结论:SHH信号通路参与了人胚胎前列腺发育的调控过程,可能对于腺体发育初期的诱导发生,以及后期的增殖、分化都具有重要的调控作用。     

可诱导共刺激分子研究进展

可诱导共刺激分子(inducible co-stimulator,ICOS)是一组对T细胞活化提供共刺激信号的分子。近年来的深入研究发现,ICOS与其配体(ICOSL)的相互作用对T和B淋巴细胞的增殖与活化、各种细胞因子的产生与分泌具有十分重要的作用。在多种同种异体器官移植动物模型中,通过各种途径阻断ICOS共刺激通路可诱导受者对供者特异性的免疫耐受,延长了移植物的存活时间。