两种检测乙型肝炎病毒DNA定量方法的比较与评价

目的：评价两种检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA方法的特点。方法用美国DIGENE公司生产的Hybrid Capture-I HBV DNA试剂(HC-I )和深圳匹基生物工程股份有限公司生产的HBV DNA定量荧光PCR检测试剂(PG),定量检测HBsAg阳性的慢性乙肝患者血清中的HBV DNA。结果 HC-I 试剂的HBV DNA检测阳性率达98.6豫,PG试剂达到94.6豫,两者的符合率为93.2豫。用系列稀释的患者血清,测定两种定量检测方法的灵敏度,PG试剂略高于GC-I 试剂。HC-I 在HBV DNA浓度较高时的定量关系精度较好,而在HBV DNA低滴度时,两者的定量误差均加大。用两种方法检测HBV DNA定量监测抗病毒药物治疗慢性乙型肝炎的疗效,所测定的HBV DNA滴度呈相同变化趋势。结论两种HBV DNA定量检测方法均较高的灵敏度,在抗病毒药物疗效观察方面有较高的应用价值。     

套叠式（Nested） PCR检测乳汁中HBV—DNA

本文应用Nested—PCR技术．检测752例血清HBV—DNA阳性(PCR检测)产妇和15例血清HBV-DNA阴性(PCR检测)产妇乳汁中的HBV—DNA。结果表明：52例阳性产妇乳汁中HBV-DNA经第一次扩增后．12例HBV—DNA阳性。经第二次扩增后，40例阳性(阳性率76．9％)；15例阴性产妇乳汁中HBV-DNA经两次扩增后均为阴性。作者认为，Nested—PCR技术是检测血清HBV-DNA阳性产妇乳汁是否排泌HBv的简便、灵敏、特异的方法。乳汁中含有HBV应停止哺乳。     

乙肝母婴阻断"成功"儿童外周血中检出HBV DNA

目的 检测乙型肝炎母婴阻断成功儿童血清HBV DNA,提出应该完善母婴阻断效果评价指标的建议.方法 采集乙肝疫苗母婴阻断后HBsAg阴性的儿童血清标本,经试剂盒提取HBVDNA,采用巢式PCR方法 扩增HBV DNA S区基因片段后纯化测序.结果 140例儿童血标本中,12例HBV DNA阳性,阳性率8.6%;S基因测序检测未发现突变株.结论 鉴于血清学检测方法 敏感性低于PCR扩增方法 .在评价乙型肝炎母婴阻断效果时,加入HBV DNA指标,可使其更完善.     

荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究

目的：建立一种高效﹑简便的荧光实时定量PCR方法，用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度的检测。方法：利用Bac-to-Bac载体系统在昆虫细胞中构建含人IL-18基因的重组杆状病毒，收获的病毒母液以10倍梯度系列稀释后，提取病毒基因组DNA。以10倍梯度稀释的重组杆状病毒穿梭质粒（bacmid）作为标准模板，进行荧光定量PCR反应扩增IL-18基因片段并绘制标准曲线，然后以上述的重组杆状病毒基因组DNA作为模板，采用同样体系进行实时PCR反应检测，同时用琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度。结果：成功构建了重组杆状病毒并建立了病毒滴度的实时荧光PCR检测方法。运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线形范围为101-108拷贝，病毒母液的DNA拷贝浓度（vg/mL）值约为空斑检测的滴度 pfu/mL值的10倍。结论：荧光定量PCR方法可灵敏快速地鉴定重组杆状病毒，并在较大的线形范围内检测重组杆状病毒滴度，较之空斑法更准确地反映了重组杆状病毒的实际数量。     

荧光定量 PCR与半定量PCR检测HBV DNA的对比分析

目的：对照分析荧光定量PCR与半定量PCR检测血清HBV DNA的载量，为临床基因检测实验室提供方法学选择依据。 方法： 取164份临床检测标本各用荧光定量PCR与半定量PCR检测，结果作统计学分析。 结果: 两种检测方法的灵敏度和特异度没有显著差异（χ2 =1.75，P>0.05）。 结论: 临床基因检测实验室可用半定量PCR法替代荧光定量 PCR法检测血清HBV DNA的载量。     

基因芯片技术在乙型肝炎病毒基因分型检测中的应用探讨

目的：探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性。方法：查阅国际上主要的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型诊断标准和现行技术，通过将基因芯片技术与目前用于HBV基因分型的技术方法进行对比，探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性。结果：HBV的基因分型，既可通过全基因序列比对，也可通过片段基因序列比对，片段基因序列比对是实际工作中HBV基因分型的主要方法，现有报道的技术主要为型特异引物(SSP)PCR扩增法和PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法。基因芯片技术具有高敏感、高通量和能够平行检测DNA类型等特点，技术类型属于PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法。尚未见有应用基因芯片技术进行HBV基因分型检测的报道。结论：借鉴现有的PCR扩增型特异探针（SSO)杂交法，如微板核酸杂交一ELISA显色技术，理论上利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断的方法是完全可能的，并且具有高效、快速和廉价等特点。     

Real-time PCR检测风疹病毒方法学建立及临床应用

为了建立一种能广泛应用于临床快速、简便、灵敏度和特异性较好的风疹病毒(RV)定量诊断方法。针对RV基因保守序列设计两对引物和一条荧光双标记探针。将PCR扩增所得到的产物片段克隆,作为定量检测的标准品,进行Real-time PCR检测,绘制标准曲线。将此方法和ELISA试剂盒平行检测50份孕妇血清,评估两种方法检出阳性率的差异显著性。Real-time PCR法能较好地检出RVcDNA载量。曲线的相关系数(r)为0.998,可检测线性范围大约在103~109copies/μl,灵敏度接近103copies/μl;批间、批内CV值分别为3.36%、0.94%;也有较好的特异性。与经典的ELISA方法相比,有显著性差异。Real-time PCR方法操作简单、快速,并能避免PCR后处理导致的假阳性污染,实现实时定量。此方法对RV感染的临床诊断和疗效判断等方面有较大的指导意义。     

细胞人基因组DNA对荧光实时定量PCR检测细胞培养液中HBV DNA的影响

 目的 研究细胞人基因组 DNA 对荧光实时定量 PCR（FQ-PCR）检测细胞培养上清液中 HBV DNA 含量的可能干扰影响，提高细胞培养上清液中 HBV DNA 定量检测的准确性。方法 取 HBV DNA 阳性血清，以 DMEM 培养基分别配制出 HBV DNA 拷贝数为 5 × 107/ml（高拷贝组）、5 × 105/ml（中拷贝组）、5 × 103/ml（低拷贝组）的不同样本组；各组内再分 5 个亚组，分别加入终浓度为 0（对照组）、12.5、25、50、100 μg/ml 的细胞人基因组 DNA（提取自人肝癌细胞系 HepG2）。以不含 HBV DNA 阳性血清的 DMEM培养基加入上述浓度细胞人基因组 DNA 为空白组。采用基于 TaqMan 技术的 FQ-PCR 检测各组样本的 HBV DNA 拷贝数并绘制 HBV DNA 定量曲线。每组均重复检测 10 次。根据 HBV DNA 定量检测结果确定受干扰样本和未受干扰样本，分别计算其定量曲线线性期斜率和平均扩增效率。 结果 高拷贝组中加入不同浓度细胞人基因组 DNA 的各个亚组与相应对照组比较，HBV DNA 拷贝数差异均无统计学意义。中拷贝组中加入细胞人基因组 DNA 浓度为 50 和 100 μg/ml 的 2 个亚组，其 HBV DNA 拷贝数结果明显高于相应对照组，增高可达 50 ~ 100 倍，且重复性差。低拷贝组中只有加入细胞人基因组 DNA 浓度为 12.5 μg/ml的亚组可通过提高基线值取得与相应对照组接近的定量检测结果，而其他亚组 HBV DNA 定量曲线指数扩增期斜率明显异常，无法确定其定量检测结果。空白组各亚组均未观察到明显的 HBV DNA 指数扩增期。受干扰样本线性期斜率（-1.01 ± 0.06）和平均扩增效率（90.0% ± 2.1%）与对照组样本（分别为 -1.52 ± 0.06，97.0% ± 0.4%）比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 细胞人基因组 DNA 对应用 FQ-PCR 技术进行的HBV DNA 定量检测可产生非特异性干扰，尤其在 HBV DNA 拷贝水平较低时。在细胞培养上清液作 HBV DNA 定量检测时应尽量去除细胞人基因组 DNA。     

微量酶联杂交法定量检测HBV基因 竞争PCR扩增产物

目的 建立一种简便、敏感、精确的微反应板酶联杂交技术,以鉴定HBV基因的竞争PCR扩增产物。方法 设计了两种捕获探针,能分别与竞争PCR扩增产物中的野生片段和突变片段杂交。捕获探针通过3′－端修饰的氨基与微量DNA结合板孔表面的NOS基团化学结合而被“竖直”地包被在反应板上;将热变性后的产物加入两种捕获探针反应孔内,产物中带有生物素的野生或突变片段的一条单链与相应的捕获探针杂交;最后用链亲和素－碱性磷酸酶及底物检测杂交信号。结果 该方法检测PCR产物DNA的灵敏度为80ng/ml,大于琼脂糖凝胶电泳染色鉴定法。获得野生片段和突变片段杂交信号值后,可根据公式计算扩增前野生模板的初始量。结论 本方法操作简单、灵敏度高、结果数据化、特异性强,适用于竞争PCR产物分析。     

恶性疟原虫已糖转运体编码基因的体外扩增及克隆

目的：体外扩增恶性疟原虫海南分离株的已糖转运体基因(PfHT1)，并将该基因克隆至pEGFF真核表达载体内使其高效表达，为研究DNA疫苗创造条件。方法：特定PCR引物的设计；恶性疟原虫FCC1／HN株的体外培养；提取基因组DNA；PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析；酶切、连接及PCR分析鉴定。结果：从恶性疟原虫簿南分离株基因组DNA中扩增出特异性的编码FfhTl的基因序列．片段太小为1516bp，克隆鉴定结果表明插人片段大小正确。结论：体外成功扩增出恶性疟原虫PfHTl编码序列，与预期长度相符，并成功构建pEGFF-Htl真核表达载体。为研究其结构、功能和免疫原性奠定基础，     

Simplified PCR protocols for INNO-LiPA HBV Genotyping and INNO-LiPA HBV PreCore assays.

BACKGROUND: INNO-LiPA HBV Genotyping (LiPA HBV GT) and INNO-LiPA HBV PreCore (LiPA HBV PC) are commercially available assays for hepatitis B virus (HBV) characterization. These assays are labor-intensive and may be prone to exogenous DNA contamination due to their use of nested PCR amplification procedures and lack of contamination control measures. OBJECTIVE: Standardized, single-round INNO-LiPA PCR amplification protocols incorporating uracil N-glycosylase and automated sample processing by the MagNA Pure LC instrument were evaluated. STUDY DESIGN: HBV standards containing 10,000, 1000, 100, 10, and 0 IU/mL were analyzed to determine the analytical sensitivity and reproducibility of these modified procedures. One hundred clinical serum specimens with viral titers ranging from 390 to 16,900,000 IU/mL were tested by modified LiPA HBV GT, while 34 specimens with viral titers ranging from 378 to 11,600,000 IU/mL were tested by modified LiPA HBV PC. RESULTS: Modified LiPA HBV GT and LiPA HBV PC each yielded analytical sensitivities of 100% at an HBV DNA level of 1000 IU/mL and 90% at a level of 100 IU/mL. Among clinical specimens, success rates for both INNO-LiPA procedures were > or =94%. CONCLUSIONS: Both modified INNO-LiPA procedures were sensitive and reproducible, with improved efficiency and suitability for routine laboratory use.     

Improved rolling circle amplification (RCA) of hepatitis B virus (HBV) relaxed-circular serum DNA (RC-DNA)

For functional analysis of HBV isolates, epidemiological studies and correct identification of recombinant genomes, the amplification of complete genomes is necessary. A method for completely in vitro amplification of full-length HBV genomes starting from serum RC-DNA is described. This uses in vitro completion/ligation of plus-strand HBV RC-DNA and amplification using Rolling-Circle Amplification, eventually followed by a genomic PCR. The method can amplify complete HBV genomes from sera with viral loads ranging from >1.0E + 8 IU/ml down to 1.0E + 3 IU/ml. The method can be applied to archived sera that have undergone long-term storage or to archived DNA serum extracts. The genomes can easily be cloned. HBV genotypes A–G can all be amplified with no apparent problems. A recombinant subgenotype A3/genotype E genome was identified and fully sequenced.     

乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变株复制质粒的构建

目的　构建乙型肝炎病毒 (HBV)前C区和基本核心启动子区 (BCP)突变株的复制质粒。方法　以含 1 2倍拷贝HBVDNA全基因的质粒 (pHBV1 2 )为工具 ,采用分子克隆、PCR定点诱变、限制性酶切长度多态性和序列分析等技术构建目的质粒。转染肝癌细胞株Huh7后 ,测定培养上清HBsAg、HBVDNA来了解病毒抗原的表达和病毒复制。结果　成功构建了 10种HBV全基因前C区 /BCP区突变的表达质粒 ,转染肝癌细胞株 ,获得病毒的表达和病毒颗粒的分泌。其中 ,pUC HBVT176 2、A176 4双突变以及pUC HBVT175 3突变株复制效率较高 ,转染细胞培养上清的HBVDNA为3 16× 10 5拷贝 ml。野生型复制子培养上清HBVDNA含量稍低于BCP突变复制子。结论　获得 10株含有不同前C区和BCP区突变的HBV全基因复制质粒 ,为体外进一步研究上述变异的生物学意义提供基本模型。     

Typing of hepatitis B virus genomes by a simplified polymerase chain reaction

The amplification of hepatitis B virus (HBV) DNA sequences in sera for molecular epidemiology of HBV is an important application of the polymerase chain reaction (PCR) with regard to HBV. To simplify the PCR for this purpose, the optimal concentrations of SDS and detergents for carrying out the proteinase K digestion and the amplification of DNA by Taq polymerase were evaluated. It was found that by using 1% deoxycholic acid as detergent for the proteinase K step and diluting the digest 10 times before carrying out the PCR, the phenol extraction of DNA became superfluous. The sensitivity of this procedure equalled that of PCR after phenol extraction on comparable amounts of serum. Four pairs of oligonucleotide primers were compared for amplification of HBV DNA sequences in 48 sera previously subtyped with respect to hepatitis B surface antigen (HBsAg), and in eight sera with different genotypes of HBV, representing the subtypes of HBsAg P1 to P8, defined at an international meeting [Couroucé-Pauty et al.: "HBs Antigen Subtypes." Basel: Karger, 1976]. Two primer pairs, selected from conserved regions in the X and S genes of HBV, gave a positive PCR with sera harbouring all the eight different strains of HBV, resulting in DNA fragments consistent with the sizes deduced from genome sequence data. Two other primer pairs were selected in order to discriminate genotypes with regard to differences between d/y and w/r strains.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

Levels of pre-S antigens and HBV DNA in sera from high and low viremic HBV carriers.

The biological and clinical significances of pre-S antigens and HBV replication were investigated. Some 125 sera, 28 from HBeAg and 97 from anti-HBe-positive HBsAg, carriers were studied. The aim was to verify whether pre-S antigens could be expressed in serum in complete absence of viremia. Pre-S proteins, determined by an enzyme immunoassay, were found in sera regardless of the presence of HBV DNA, as detected by spot-hybridization. The sera without detectable HBV DNA were investigated further by PCR using specific primers for the S and C regions of HBV. PCR analysis of samples revealed that 4 out of 5 HBeAg and 33 out of 41 (80.5%) anti-HBe positive sera contained HBV-amplified sequences of S and C regions. Pre-S antigen values correlated well with the amounts of HBV DNA in serum detected by PCR in anti-HBe-positive subjects with high titers of pre-S antigens (10(4)-10(6)). In addition, PCR highlighted the presence of HBV DNA sequences in 8 out of 17 (47.1%) pre-S-negative HBsAg-positive sera.     

HBV携带者血清病毒标志物和HBV DNA与肝组织中HBVcccDNA相关性的研究

目的探讨HBV携带者血清病毒标志物和HBV DNA与肝组织中HBVcccDNA之间的关系。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测30例经肝组织活检病理检查确定为HBV携带者的肝组织中HBVcccDNA、HBVtDNA和血清HBV DNA,同时用化学发光免疫分析法检测HBsAg、HBeAg定量,分析感染者肝组织内HBVcccDNA与肝组织内HBVtDNA、血清HBVDNA、HBsAg及HBeAg定量水平之间的关系。结果HBV携带者肝组织中均可检出HBVcccDNA,范围在3．15×10^3拷贝／mg～1．06×10^7拷贝／mg（对数值：5．66±O．93）;肝组织cccDNA定量与肝组织总HBVDNA定量呈正相关（r=0．375,P〈0．05）,与血清HBVDNA无相关性（r=0．174,P〉0．05）。肝组织中HBVcccDNA水平与血清HBsAg定量呈高度正相关（r=0．562,P〈0．001）;而与血清HBeAg定量无相关性（r=0．152,P〉0．05）。结论HBV携带者肝组织内HBVcccDNA成稳定的中等水平复制;血清HBVDNA载量不能直接代表其肝组织中的HBVcccDNA水平;血清HBsAg定量可作为反映肝幺日织中HBVcccDNA水平的指标。     

恩替卡韦治疗拉米夫定失效慢性乙型肝炎的疗效预测初探

目的观察恩替卡韦治疗拉米夫定失效慢性乙型肝炎24周时对HBV的抑制程度，与治疗48周疗效之间的关系，探讨临床实用的疗效预测指标。方法拉米夫定治疗失效慢性乙型肝炎患者33名，采用恩替卡韦每日1．0mg治疗。根据治疗24周时血清HBVDNA的水平，将患者分为4组：PCR低于检测下限（QL）组（〈300拷贝／ml）、QL～〈10^3拷贝／ml组、103拷贝／ml～〈10^4拷贝／ml组和≥10^4拷贝／ml组，比较各组治疗48周时HBVDNA低于检测下限、ALT复常、HBeAg血清转换及发生病毒学反弹的比率。结果治疗48周时，血清HBV DNA自基线下降4．91log。HBV DNA低于检测下限的比例为33．3％。24周时HBV DNA水平越低，在48周HBV DNA达到PCR检测不到的水平和ALT复常的比率越高，发生病毒学反弹的比率越低。结论恩替卡韦治疗拉米夫定失效慢性乙型肝炎治疗24周时，PCR检测不到HBV DNA，提示在48周可达到较佳疗效，24周对HBV DNA的抑制程度可作为48周疗效的预测指标。     

外周血单个核细胞中乙型肝炎病毒前S／S基因变异？…

目的 研究外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）包膜抗原基因变异的意义。方法 收集１９例慢性乙肝患者的ＰＢＭＣ和配对血清,用ＰＣＲ扩增ＰＢＭＣ及血清中ＨＢＶ包膜基因片段９Ｓ,ｐｒｅＳ１,ｐｒｅＳ２）,并对其中各５例ＰＢＭＣ及配对血清中的ｐｒｅＳ１和ｐｒｅＳ２基因片段,分别进行核苷酸序列分析。结果 Ｓ,ｐｒｅＳ１和ｐｒｅＳ２片段在血清和ＰＢＭＣ中的检出率,分别为１００％,９４．＆％,１     

阿德福韦治疗慢性乙型肝炎过程中HBV DNA及丙氨酸氨基转移酶水平的变化

目的 研究新药阿德福韦(ADV)治疗慢性乙型肝炎过程中HBV DNA及丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的变化情况,从而指导临床用药. 方法 采集16例慢性乙型肝炎(CHB)患者用ADV治疗前血清,即基线(BL)血清,以及持续服药12、16、28、40、48、52、68、80、92周共10个时段的系列血清.用荧光定量PCR法检测其HBV DNA的水平.用全自动生化仪检测其ALT的水平. 结果 从BL到48周时段,HBV DNA中位数显著下降;在52周,HBV DNA中位数出现反弹;从52至92周时段,HBVDNA中位数再次下降.16例不同时段血清ALIT中位数的变化与HBV DNA中位数变化一致.ADV治疗12周时,HBV DNA中位数较基线下降了2.34 lg拷贝/ml,无HBV DNA阴转、HBeAg血清学转换;治疗28周时,HBV DNA中位数较基线下降了2.91 lg拷贝/ml,有2例HBV DNA阴转、ALT恢复正常、HBeAg血清学转换;治疗40、48周时,HBV DNA中位数较基线分别显著下降了3.83、3.95 kg拷贝/ml,有4例HBV DNA阴转、ALT恢复正常、HBeAg血清学转换;治疗52周时,HBV DNA中位数较基线下降了2.90 lg拷贝/ml,出现反弹,但仍有4例HBV DNA阴转、ALT恢复正常、HBeAg血清学转换;治疗68、80、92周时,HBV DNA中位数较基线显著下降了3.51、3.81、4.01 lg拷贝/ml,分别有4、6、6例HBV DNA阴转、ALT恢复正常、HBeAg血清学转换.16例患者接受ADV治疗的两年中,有9例患者分别从16、28、40周开始HBV DNA的水平显著下降;7例患者HBV DNA的水平下降但不显著. 结论 阿德福韦治疗慢性乙型肝炎过程中,HBV DNA及ALT中位数的变化情况基本一致.52周时段HBV DNA水平出现反弹,提示52周可能是抗病毒的关键时段.