网孔过滤法分离纯化肌源性干细胞

探讨乳大鼠肌源性干细胞的体外培养及纯化分离方法.采用Ⅺ型胶原酶和胰蛋白酶消化乳大鼠骨骼肌,网孔过滤纯化肌源性干细胞后,通过体外原代和传代培养,经生长曲线、细胞融合率等指标研究肌源性干细胞的增殖和分化能力,免疫细胞化学染色法进行鉴定.结果表明:通过上述方法分离得到小圆形或短梭形的细胞,免疫细胞化学染色desmin及CD34为阳性.说明网孔过滤法可提高肌源性干细胞的纯度.     

大鼠脑源性神经干细胞的分离培养

目的 探讨大鼠不同年龄组来源的神经干细胞体外培养和诱导分化的最佳条件。方法 分离12～15d大鼠胚胎、1～2d新生鼠的脑组织和成年大鼠脑的海马区和嗅球，在条件培养基(包含生长因子)中增殖培养，用神经干细胞的特异性单克隆抗体巢蛋白(nestin)鉴定克隆细胞；去除生长因子，降低血清浓度到2％后，诱导细胞分化，用神经细胞的特异性单克隆抗体鉴定分化细胞。结果 获得了大量可自我增殖并分化为3种神经细胞(神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞)的神经前体细胞。结论 在适当的分离培养条件下，可以获得大量的神经前体细胞，为神经干细胞的基础和临床研究提供细胞基础。     

大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞的分离及鉴定

背景：前期研究在大鼠阴茎海绵体组织中检测到了具有干细胞标志物及肌源性标志物的干细胞。 目的：在前期研究基础上,对大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞进行分离及表型鉴定。 方法：取2月龄SD大鼠阴茎海绵体组织,采用Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶消化分离组织,采用Preplate差速贴壁技术对细胞进行初步纯化,获得PP1~PP6贴壁细胞,并进行流式细胞仪检测、免疫荧光细胞化学鉴定及Western blotting检测。 结果与结论：连续6步差速贴壁分离后,PP1~PP6细胞贴附能力逐渐减弱,PP6细胞两三天后开始贴壁形成圆形或梭形。流式细胞仪检测PP6细胞中干细胞抗原1(+)5.7%、胚胎抗原(+)2.6%、结蛋白(+) 41.2%。免疫荧光细胞化学显示仅有少量细胞分别表达干细胞抗原1和胚胎抗原,均散在分布,干细胞抗原1主要表达于胞浆,胚胎抗原主要表达于胞核,表达结蛋白的细胞聚集,数量较多,主要表达于胞浆;亦发现有极少量双阳性表达细胞,即干细胞抗原1/胚胎抗原、干细胞抗原1/结蛋白和胚胎抗原/结蛋白。PP1~PP5细胞中未检测到干细胞抗原1及胚胎抗原蛋白明显表达,但在PP6细胞中则检测到干细胞抗原1及胚胎抗原蛋白的表达。结蛋白在PP1~PP6细胞中的表达逐渐增强。提示在大鼠阴茎海绵体中发现具有干细胞及肌源性干细胞表型的细胞。     

大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定

背景：脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。 目的：构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。 方法：切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。 结果与结论：体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈“S”型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。     

肝干细胞分离培养技术的研究进展

干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,存在于许多组织中;肝干细胞在肝脏的形成和再生中有重要作用,可以分化为肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞等.随着对其特性的深入了解,它将代替肝细胞移植和肝脏移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源,在体外对肝干细胞进行分离纯化和培养扩增,将对肝的细胞移植、组织工程和基因治疗等有重要作用.     

软骨细胞培养液诱导肌源性干细胞转化为软骨样细胞

目的:体外定向诱导大鼠肌源性干细胞(MDSCs)向软骨细胞转化,并对诱导细胞进行鉴定.方法:用差速贴壁的方法对SD大鼠MDSCs进行分离和培养.同时将软骨细胞进行体外培养,收集软骨细胞培养液作为MDSCs诱导液.将MDSCs进行诱导分化,9d后取出标本,行甲苯胺蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA表达.结果:5d后镜下见细胞形态由梭形向多边多角形转化.9d后诱导组甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达.结论:软骨细胞培养液可诱导MDSC向软骨细胞转化.     

与肌源性干细胞共培养修复大鼠胰岛功能

目的采用体外共培养方式研究肌源性干细胞(MDSCs)修复大鼠胰岛功能的作用。方法提取新生大鼠MDSCs原代细胞,差速贴壁培养后行结蛋白免疫细胞化学鉴定,取第2代MDSCs接种在transwell底板。提取大鼠胰岛后,双硫腙染色鉴定,胰岛放入transwell板上层与MDSCs共培养作为实验组,用放射免疫法测胰岛功能,Western blot检测胰岛Bax、caspase3蛋白表达。另选胰岛单独培养作为对照组。结果实验组胰岛素释放指数(SI)值降低不明显,Bax、capase3蛋白定量升高不明显,与对照组相同时间比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 MDSCs与大鼠胰岛共培养后,大鼠胰岛功能被修复。     

兔肌源性干细胞的生物学特性及表型研究

目的:探讨兔肌源性干细胞(MDSCs)的分离及特征和表型研究。方法:取1.5月龄新西兰兔大腿肌肉，采用差速贴壁分离Preplate技术，分别用Ⅺ胶原酶、dispase蛋白酶以及胰蛋白酶分步消化肌肉，并用差速贴壁法分离晚期贴壁的细胞，流式细胞仪(FCM)、免疫细胞化学以及Western blotting等检测初步确定细胞表型。结果:进行连续6 d的差速贴壁分离。第3 d开始得到较多量的圆形或短梭形细胞，簇样生长，体积明显小于骨骼肌细胞及其它杂细胞，10 d左右汇合，有极强的融合生长倾向。细胞在汇合度<30%传代可较好地保持原形态，流式细胞仪检测示MDSCs>80%为desmin+，>70%为Bcl-2+，>95%为CD45-，免疫细胞化学定性示desmin+。Western blotting检测显示随着细胞的纯化，α-SMA表达越来越弱。而细胞高汇合度(>50%)或低血清培养时极易融合成肌管或肌细胞链，skeletal myosin+。结论:MDSCs具有desmin、Bcl-2高水平表达和CD45极低水平表达的特性，具有多向分化能力的MDSCs是组织工程研究的一种新型种子细胞。     

损伤脊髓组织提取液对大鼠肌源性干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究

目的:探讨大鼠肌源性干细胞在损伤脊髓组织提取液中向神经细胞分化的可能性,为神经再生及脊髓损伤的治疗提供一种新方法。方法:从大鼠乳鼠骨骼肌中分离培养肌源性干细胞,将正常、伤后1d,伤后1周及伤后3周脊髓提取液加入细胞培养基中,观察细胞形态的变化,并采用免疫组织化学法检测诱导后的细胞表达NSE特异性标志物。结果:加入脊髓提取液诱导后24h,部分细胞的形态已发生改变,3d后大部分细胞不仅在形态上表现为神经元样特征,而且NSE等特异性抗体呈阳性表达。结论:损伤脊髓组织液能将肌源性干细胞诱导成神经元样细胞。     

动物组织细胞分离纯化方法学

要了解某种特定细胞的结构、功能或表面标志等特征,就必须将其在体外培养增殖获得足够的数量以供研究,这首先就必须获取种子细胞。从血液、淋巴液等液体中分离细胞时,可直接进行纯化,从心脏、肝脏等器官分离细胞时,一般的方法是先获得细胞悬液,再对其进行分离     

大鼠胚胎神经干细胞的纯化、诱导分化及鉴定

探讨胚胎神经干细胞 (Neural stem cell,NSCs)的体外纯化扩增、保存标记、诱导分化及其鉴定方法。将14 .5 d胎龄大鼠大脑额叶皮质 NSCs在无血清 DMEM/ F12 (含 2 0 ng/ ml b FGF,2 0 ng/ m l EGF及 B2 7辅助培养液 )培养 ,利用有限稀释法将悬浮生长的单个细胞所形成的克隆球挑选出来、通过亚克隆连续传代大量扩增而纯化 ,免疫组化鉴定 nestin抗原阳性 ;选取部分 NSCs冻存、复苏后 nestin抗原阳性 ;用 Brd U孵育 NSCs,被 Brd U标记的 NSCs及其血清诱导分化后仍均呈 Brd U阳性。用血清或饲养层诱导 NSCs分化为大量表达 Tubulin- (神经元特异性抗原微管蛋白 3)阳性的神经元和 GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白 )阳性的神经胶质细胞。由该实验可知有限稀释单细胞克隆连续传代是分离纯化、大量扩增胚胎期大脑 NSCs的简单有效方法。饲养层细胞也能诱导 NSCs分化为神经细胞。 Brd U可标记、示踪神经系统疾病动物模型 NSCs的实验治疗。掌握 NSCs的体外纯化培养、保存标记、诱导分化及鉴定方法可为进一步研究 NSCs的生物学特性及神经系统疾病的治疗提供新方法。     

The Therapeutic Effect of Human Adult Stem Cells Derived from Adipose Tissue in Endotoxemic Rat Model

Excessive systemic inflammation following sepsis, trauma or burn could lead to multi-organ damage and death. Bone marrow stromal cells (BMSCs), commonly referred to as mesenchymal stem cells (MSCs), has been studied in several immune-associated diseases in human and animal by modulating the inflammatory response. Adipose tissue derived mesenchymal stem cells (ATSCs), which can be obtained more easily, compared with BMSCs, has emerged as an attractive alternative MSCs source for cell therapy. We investigated the therapeutic effects of human ATSCs (hATSCs) in endotoxemic rat model and their capacity to modulate the inflammatory response. Endotoxemia was induced with Lipopolysaccaride intravenously injection (LPS, 10mg/kg). Animals were divided into the following three groups: (1) saline + saline (n=5), (2) LPS + saline (n=5) and (3) LPS + hATSCs (2x10⁶) (n=5). The administration of LPS caused a consistent systemic inflammatory responses, increased concentrations of the pro-inflammatory cytokines that have an important role in sepsis. Treatment of endotoxemia with hATSCs decreased the level of inflammatory cytokines both in serum and in the lung, reduced inflammatory changes in the lung, prevented apoptosis in the kidney and improved multi-organ injury. In conclusion, our data demonstrates that hATSCs regulate the immue/inflammatory responses and improve multi-organ injury and they could be attractive candidates for cell therapy to treat endotoxemia.     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的实验研究

目的：建立一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs)的方法，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础。方法：用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，筛选合适培养基及适应血清含量，传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性。结果：MSCs属骨髓中的单个核细胞，密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs,MSCs在含10％小牛血清L-DMEM培养液中生长性状相对稳定，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，增殖速度快，群体倍增时间约为34小时，贴壁存活率高，适应性强，传代后12小时贴壁率达89％。细胞呈均一的成纤维细胞样，表达CD44、CD54、纤维粘连蛋白（Fibronectin,FN)、I型胶原（Collagen I)。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，在含10％小牛血清的L－DMEM培养液中，细胞稳定扩增。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离和培养方法,并用黄芪体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞样细胞。方法利用梯度离心从大鼠骨髓中分离单核细胞进行培养,去除不贴壁的细胞,分离纯化,对其生长特性进行分析。采用含黄芪的无血清L-DMEM诱导分化为神经细胞样细胞,观察细胞形态变化,用免疫组织化学方法检测分化细胞中巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果用含10%胎牛血清(FCS)的培养基培养,原代细胞贴壁生长,细胞形态均一,为纺锤形,有克隆团形成。传代培养时,形态变为成纤维细胞样,有较强的增殖能力。经黄芪诱导后,骨髓间充质干细胞形态发生改变,nestin、NSE和GFAP阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞。结论骨髓间充质干细胞可以体外分离、培养,在一定条件下向神经样细胞分化。     

成骨诱导:兔骨髓间充质干细胞的形态和功能特征

目的 探讨体外成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的形态和功能特征，为骨组织工程中种子细胞的研究提供依据。方法 选用生长状态良好的传l代的兔MSCs，在体外进行成骨活性诱导，并进行形态学观察和碱性磷酸酶、骨钙紊等功能性指标的检测。结果 体外成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞从诱导的第2周即开始表达成骨细胞的活性，到第4周趋于成熟，此过程中性态和功能均具有一定的阶段性。结论 经过体外成骨诱导的兔MSCs表现出典型的成骨细胞阶段性形态特征和功能特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

丹参诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化及相关基因的表达

目的分析骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后相关基因的表达。方法用丹参诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化,诱导后90mins,提取诱导前后的骨髓基质干细胞总RNA,RT-PCR检测ngn-1,mash-1的表达及观察其诱导前后的表达情况,免疫组化检测NSE和GFAP的表达情况。结果未经诱导的骨髓基质干细胞ngn-1,mash-1 mRNA为阴性,诱导后有表达。诱导后的细胞NSE和GFAP呈阳性反应。结论骨髓基质干细胞向神经元样的分化与ngn-1,mash-1可能有关。     

胎儿关节和兔关节软骨细胞的体外培养

本文报告了人胎儿关节软骨细胞和兔关节软骨细胞的体外培养,结果表明：胎儿关节软骨细胞和兔关节软骨细胞在胰蛋白酶和胶原酶作用下,在无ＣＯ２培养条件下,获得了大量的软骨细胞,且能生长分裂,复制。为将此法用于生物材料的人工软骨研究奠定了基础。     

机械拉伸刺激对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的调节

目的　以大鼠骨髓间充质干细胞(rat marrow mesenchymal stem cells, rMSCs)为实验对象，考察拉伸的加载对体外的调节作用。方法　采用密度梯度离心法分离培养rMSCs，免疫细胞化学染色观察细胞表面相关抗原的表达，流式细胞技术分析细胞周期分布。采用拉伸加载实验装置对培养细胞进行不同应变大小和作用时间的拉伸加载，MTT分析rMSCs的增殖，RT-PCR技术检测c-fos基因表达变化。结果　Percoll密度梯度离心结合差异贴壁法能有效分离rMSCs，在含15%胎牛血清的DMEM培养基中稳定生长，呈长梭形或纺锤形。rMSCs均一表达CD44和Fibronectin，不表达CD34，G0/G1期细胞占90%以上。拉伸刺激后rMSCs的OD值增加，在研究的时间(15~60 min)和应变范围(2%~8%)内表现出时间和应变依赖特征。RT-PCR结果表明rMSCs在1.0Hz、8%应变条件下拉伸60 min后，c-fos基因表达明显增加。结论　研究提示，rMSCs的体外生长受机械拉伸作用的调节；适宜的拉伸刺激可明显促进体外培养rMSCs的增殖。     

GFP转基因鼠咀嚼肌卫星细胞的培养及影响因素

探索骨骼肌卫星细胞作为组织工程种子细胞的可能性。取新生绿色荧光蛋白(GFP)转基因鼠面部咀嚼肌,分离出肌卫星细胞,体外进行原代和传代培养,建立GFP转基因小鼠肌卫星细胞系。通过倒置显微镜观察肌卫星细胞的形态、生长曲线测定等,观察肌卫星细胞的增殖与分化能力,荧光显微镜观察GFP荧光的保持及表达,并观察不同浓度的FBS,IGF-1以及不同种植密度对肌卫星细胞生长的影响。结果表明:体外培养的咀嚼肌卫星细胞增殖速度快,15%的FBS,接种密度在5×104 cells/ml,IGF-1在100ng/ml有显著的促进增殖作用。荧光显微镜观察发现,肌卫星细胞经传代后仍然保持其特有的GFP荧光表达。