BQ123对慢性缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞电压门控钾通道活性的影响

目的：探讨内皮素-1受体（ETA）拮抗剂BQ123对慢性缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs) 电压门控钾通道（KV）活性的影响。方法： 将12只Wistar大鼠随机分为对照组和慢性缺氧组，每组6只。用急性酶分离法（胶原酶+木瓜酶）获得单个PASMCs，用全细胞膜片钳记录方法，观察BQ123对2组大鼠PASMCs电压门控钾电流（IKV）的影响。结果：(1)在2组大鼠，ET-1（10-8 mol·L-1）对PASMCs IKV都可产生抑制作用，+50 mV时的抑制率分别是（60.21±5.32）%和 (71.04±6.58)%。(2)对照组大鼠，单独使用BQ123对PASMCs IKV无影响（P>0.05，n=5），在此基础上使用ET-1， ET-1对IKV的抑制作用依然存在。(3)慢性缺氧组大鼠，单独使用BQ123可增加PASMCs IKV，+50mV从（98.36±12.04）pA/pF至（105.76±12.13）pA/pF，但差异无显著（P>0.05，n=6），同时使用ET-1后发现BQ123可部分抵消ET-1对IKV的抑制作用，+50 mV从（28.49±6.69） pA/pF升至（74.19±9.74）pA/pF（P<0.01，n=6）。结论：常氧时，ET-1对IKV的抑制作用不是通过ETA介导的。但在缺氧条件下，ETA拮抗剂BQ123可部分拮抗ET-1对IKV的抑制作用，说明缺氧时ETA受体介导了ET-1对IKV抑制作用。     

cGMP对慢性低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞膜电压门控钾通道的作用

目的:探讨cGMP对慢性低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)膜电压门控钾通道(Kv通道)的作用, 为进一步阐明慢性低氧性肺动脉高压的发病机理提供理论依据。方法: Wistar大鼠, 随机分为对照组和慢性低氧组, 低氧组大鼠每天低氧(氧浓度10%±1%)8 h, 连续4周。单个大鼠PASMC的获得采用急性酶分离法(胶原酶Ⅰ型和木瓜蛋白酶)。采用全细胞膜片钳技术测定两组PASMC的静息膜电位(Em)和电压门控钾通道的钾离子电流(I_KV), 观察并比较cGMP (1 mmol/L) 以及cGMP和蛋白激酶G(PKG)抑制剂H-8 (1 mmol/L) 应用后两组PASMC I_KV的不同变化。结果:慢性低氧大鼠PASMC的静息膜电位和电压门控钾通道电流明显低于正常对照组。cGMP可抑制正常和慢性低氧大鼠PASMC +50 mV刺激时的峰值I_KV[正常组从(118.0±5.0)pA/pF下降到(89.9±16.5) pA/pF, n=6, P<0.05;慢性低氧组则从(81.0±5.0) pA/pF 下降到(56.8±9.1) pA/pF, n=6, P<0.05], 该抑制作用可被PKG的抑制剂H-8阻断[正常组(119.2±10.3) pA/pF vs (117.8±9.1)　pA/pF, n=6, P>0.05;慢性低氧组(96.8±6.2) pA/pF vs (98.0±2.2)　pA/pF, n=6, P>0.05]。结论:慢性低氧抑制肺动脉平滑肌细胞的电压门控钾通道。cGMP可能通过磷酸化作用而抑制正常和慢性低氧肺动脉平滑肌细胞的电压门控钾通道电流。     

慢性缺氧对大鼠肺内动脉平滑肌细胞Kv1.3、Kv2.1、Kv3.1钾通道基因在急性缺氧时表达的影响

目的与方法:用半定量RT-PCR方法,研究慢性连代缺氧对大鼠肺内动脉平滑肌细胞(PASMC)Kv13、Kv21、Kv31钾通道基因在急性缺氧时表达变化的影响。结果:①正常及慢性缺氧鼠PASMC中均有Kv13、Kv21、Kv31基因表达;②急性缺氧可使PASMC中Kv21、Kv31mRNA表达明显上调,其mRNA分别由0.646±0.092、0.782±0.104升高到1.059±0.134、0.985±0.116(P<0.01);③慢性缺氧后复氧12h再急性缺氧6h,PASMCKv21mRNA、Kv31mRNA水平均降低,其中Kv21mRNA由1.008±0.117下降到0.649±0.097,差异有极显著意义(P<0.01)。结论:Kv21、Kv31基因可能是缺氧反应基因,慢性缺氧可改变PASMC的Kv21、Kv31钾通道基因对急性缺氧的反应,使其由表达上调转变为下调,可能因而降低此钾通道在HPV中的作用。     

慢性低氧对大鼠肺组织电压门控钾通道表达的影响

目的:探讨慢性低氧对大鼠肺组织电压门控钾通道亚型Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3表达的影响。方法:将12只Wistar大鼠随机分为对照组和慢性低氧组,每组6只。采用RT-PCR和Westernblot对大鼠肺组织匀浆中Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3mRNA和Kv1.5蛋白质的表达进行观察。结果:慢性低氧组大鼠肺组织匀浆中Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3mRNA和Kv1.5蛋白质表达明显低于对照组(P<0.01)。结论:慢性低氧可以从转录、翻译两个水平抑制大鼠肺组织中Kv1.5、Kv2.1Kv9.3的表达,Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3表达的减少必将导致Kv数目的减少和电流的降低。Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3可能是氧敏感钾通道亚型。     

肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞钾通道的研究

目的：观察肺动脉高压大鼠（PHR）肺动脉平滑肌细胞膜电容(Cm)、膜电流(I)、电流密度(pA/pF)及I-V曲线，并与正常SD大鼠进行比较。观察盐酸埃他卡林对正常血压及肺动脉高压大鼠动脉平滑肌钾通道的影响。方法：SD大鼠,置于常压缺氧（10%O2）舱内，每天6 h，每周6 d，持续4周,使之平均肺动脉压升高,建立肺动脉高压大鼠模型。急性分离大鼠肺内动脉平滑肌细胞，用全细胞记录（whole cell recording）技术记录细胞钾电流、膜电容并计算电流密度。结果：PHR肺动脉平滑肌细胞Cm值、细胞膜钾电流值均显著高于正常血压SD大鼠（P<0.05）；PHR肺动脉平滑肌细胞钾电流密度值显著低于正常血压大鼠(P<0.05)。与正常SD大鼠比较，PHR钾电流I-V曲线下移。盐酸埃他卡林在10 μmol·L-1浓度下，可显著增强正常血压SD大鼠及PHR动脉平滑肌钾电流(P<0.05)。结论：PHR肺动脉平滑肌细胞的膜电容、膜钾电流比正常血压SD大鼠高；钾电流密度比正常血压SD大鼠低，I-V曲线下移。盐酸埃他卡林对正常血压大鼠及肺动脉高压大鼠动脉平滑肌钾电流都有增强作用。     

大鼠肺动脉平滑肌细胞的分离及电压门控性钾电流的记录方法

目的介绍一种大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的急性分离方法并观察电压门控性钾电流电生理特性。方法应用胶原酶和木瓜蛋白酶联合消化法获得大鼠PASMCs,利用全细胞膜片钳技术记录PASMCs膜上的电压门控性钾通道(Kv)电流。结果在相差显微镜下观察大鼠PASMCs呈舒展梭形,边界清晰,有完整的细胞膜,胞浆均匀,数量多,活性好。结论用酶急性分离的大鼠PASMCs,容易进行全细胞膜片钳记录,方法简单、稳定、可靠。     

Pinacidil对低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉压和血浆内皮素-1的影响

目的：探讨钾通道开放剂pinacidil对低氧性肺动脉高压（HPH）及对血浆内皮素-1（ET-1）含量的影响。方法：将45只雄性Wistar大鼠分为3组：①对照组;②低氧组,每天低氧8 h,共4周;③治疗组,每天低氧前半小时腹腔注射pinacidil 3 mg/kg,共4周,4周后观察3组平均肺动脉压（mPAP）,右心室肥厚指标、血浆中ET-1的水平。结果：低氧组大鼠mPAP明显高于对照组。右心室肥厚显著,血浆中ET-1含量明显高于对照组;治疗组mPAP明显低于低氧组,右心室肥厚轻于低氧组,血浆中ET-1含量明显低于低氧组。结论：pinacidil能有效降低HPH中肺动脉压力、阻抑右心室肥厚,并影响血浆中ET-1的水平。     

缺氧对肺动脉平滑肌细胞钾通道Kv1.2、Kv1.6基因表达的影响

目的:研究不同缺氧时间对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)不同亚型钾通道(Kv)mRNA和蛋白质表达的影响。方法:采用半定量RT-PCR和Western-blot方法对常氧和不同缺氧时间后PASMC上Kv1.2、Kv1.6mRNA和蛋白质的表达进行测定。结果:(1)PASMC在常氧和缺氧时均有Kv1.2、Kv1.6mRNA和蛋白质表达;(2)缺氧18h使Kv1.2mRNA和蛋白质表达增强,缺氧48h则使其表达减弱且低于常氧时的表达;(3)缺氧18h、48h对Kv1.6的mRNA和蛋白质表达无影响。结论:Kv1.6不是氧敏感的钾通道;作为氧感受器的Kv1.2,其mRNA和蛋白质表达随缺氧时间而改变。     

二十二碳六烯酸对大鼠肺动脉平滑肌细胞大电导钙激活性钾通道的影响

 目的： 探讨二十二碳六烯酸（DHA）对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）大电导钙激活性钾离子通道（BKCa）的作用。方法：采用酶解法获得单个活性良好的PASMC,PASMCs的BKCa电流变化采用全细胞膜片钳技术记录,PASMCs胞浆内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)采用激光共聚焦显微镜技术测定。结果：DHA 0.01 μmol/L对BKCa无显著激活作用;0.1、1、10 μmol/L DHA可显著激活BKCa。不同浓度的DHA（0、0.1、1、10 μmol/L）在指令电压为+60 mV时,BKCa电流密度分别为(30.5±6.5) pA/pF、(59.4±5.8) pA/pF、(87.2±4.3) pA/pF和(117.3±7.1) pA/pF (P<0.01)。急性缺氧在指令电压为+60 mV时,BKCa电流密度从(32.7±8.5) pA/pF降低至(11.9±5.8) pA/pF (P<0.01)。DHA (10 μmol/L) 能明显逆转急性缺氧对BKCa的抑制作用（P<0.01）,同时DHA触发PASMCs内［Ca2+］i的增加,最大增加速率为（71.9±4.1）%（P<0.01）。结论：DHA通过增加PASMCs［Ca2+］i激活BKCa,逆转急性缺氧对BKCa的抑制作用,具有舒张肺血管的作用。     

慢性阻塞性肺疾病合并慢性缺氧患者肺动脉平滑肌细胞电压门控钾通道亚型基因表达的变化

目的：探讨人肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的几种Kv通道亚型：Kv1.2、 Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv3.1等，在COPD合并慢性缺氧时基因表达的变化。旨在探索预防人类肺源性心脏病的发生和找到新的防治方法提供试验依据。 方法： 从手术室切取人正常肺组织、单纯COPD患者和COPD合并慢性缺氧患者肺组织，将标本分为：①正常对照的PASMCs、单纯COPD和COPD合并慢性缺氧患者的PASMCs；②正常对照的PASMCs和经过慢性缺氧培养的PASMCs。利用半定量RT-PCR技术，分析Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv3.1等的基因表达。 结果： ①Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv3.1等基因在正常PASMCs和单纯COPD患者PASMCs中均有表达，而且两者无显著差异；②Kv1.2、Kv1.5、Kv2.1在患者在体慢性缺氧和离体慢性缺氧时的表达均明显降低（P<0.05）；Kv1.3在患者在体慢性缺氧时表达明显降低（P<0.05），而离体慢性缺氧时无显著变化（P>0.05）；Kv3.1在患者在体慢性缺氧和离体慢性缺氧时的表达均无显著变化（P>0.05）；③Kv1.2、Kv1.5、Kv2.1、Kv3.1等基因在单纯COPD时表达显著上调（P<0.05）。 结论： 在慢性缺氧情况下，Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1 4种亚型基因表达明显下降，提示可能在促进人肺动脉高压的形成和发展中起重要作用。而慢性缺氧对Kv3.1基因表达无显著影响，提示它们可能对缺氧不敏感，在人肺动脉高压发生中处于次要地位。至于在单纯COPD时几种亚型的表达上调，原因不清楚，需进一步研究证实。     

Biophysical properties of Ca2+- and Mg-ATP-activated K+ channels in pulmonary arterial smooth muscle cells isolated from the rat

A novel class of Ca²⁺-activated K⁺ channel, also activated by Mg-ATP, exists in the main pulmonary artery of the rat. In view of the sensitivity of these K_Ca,ATP channels to such charged intermediates it is possible that they may be involved in regulating cellular responses to hypoxia. However, their electrophysiological profile is at present unknown. We have therefore characterised the sensitivity of K_Ca,ATP channels to voltage, intracellular Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) and Mg-ATP. They have a conductance of 245 pS in symmetrical K⁺ and are approximately 20 times more selective for K⁺ ions than Na⁺ ions, with a K⁺ permeability (P _K) of 4.6×10^–13cm s^–1. Ca²⁺ ions applied to the intracellular membrane surface of K_Ca,ATP channels causes a marked enhancement of their activity. This activation is probably the result of simultaneous binding of at least two Ca²⁺ ions, determined using Hill analysis, to the channel or some closely associated protein. This results in a shift of the voltage activation threshold to more hyperpolarized membrane potentials. The activation of K_Ca,ATP channels by Mg-ATP has an EC₅₀ of approximately 50 M. Although the EC₅₀ is unaffected by [Ca²⁺]_i, channel activation by Mg-ATP is enhanced by increasing [Ca²⁺]_i. One possible interpretation of these data is that Mg-ATP increases the sensitivity of K_Ca,ATP channels to Ca²⁺. It is therefore possible that under hypoxic conditions, where lower levels of Mg-ATP may be encountered, the sensitivity of K_Ca,ATP channels to Ca²⁺ and therefore voltage is reduced. This would tend to induce a depolarising influence, which would favour the influx of Ca²⁺ through voltage-activated Ca²⁺ channels, ultimately leading to increased vascular tone.     

H2O2对大鼠肺动脉平滑肌细胞Kv通道的作用

 目的:观察H₂O₂在常氧时对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的Kv的影响, 探讨H₂O₂对肺动脉平滑肌细胞的Kv通道的作用。 方法:用酶解法急性分离单个PASMCs，以全细胞膜片钳技术记录PASMCs膜上的电压依赖性钾通道 (voltage-gated potassium channel, Kv) 电流。 结果:常氧下 H₂O₂可显著增加Kv电流，电流-电压关系曲线左上移；而且Kv电流呈浓度依赖性增加。 结论:常氧下H₂O₂ 可使Kv通道开放。     

钾通道对大鼠肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i的调节

目的:探讨在常氧、低氧条件下钾通道对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)[Ca²⁺]_i的调节。方法:采用钙荧光探针(Fura-2/AM)负载培养的大鼠PASMCs,观察常氧、低氧培养后3种钾通道抑制剂(4AP,TEA、Glib)对PASMCs[Ca²⁺]_i的调节,同时用四唑盐(MTT)比色法比较4AP、TEA、Glib对大鼠PASMCs增殖的影响。结果:(1)常氧状态下,PASMCs[Ca²⁺]_i为(156.91±8.60)nmol/L,低氧时为(294.01±16.81)nmol/L(P＜0.01)。(2)常氧状态下,4AP可引起PASMCs[Ca²⁺]_i升高,达(280.52±23.21)nmol/L(P＜0.01),而TEA、Glib无此作用。(3)低氧时,4AP和TEA都可引起PASMCs[Ca²⁺]_i的升高,分别为(422.41±24.28)nmol/L、(380.84±11.02)nmol/L(P<0.01),Glib无作用。(4)MTT比色法中,常氧和低氧状态下4AP均引起吸光度(A)值升高,分别是0.582±0.062,0.873±0.043(P＜0.01)。TEA仅在低氧时A值升高(0.729±0.041,P＜0.05),而Glib无论常氧还是低氧均无影响。结论:无论常氧还是低氧条件下,电压依赖性钾通道(K_V)对PASMCs[Ca²⁺]_i及其增殖起主要作用。钙激活的钾通道(K_Ca)在常氧条件下对[Ca²⁺]_i不起调节作用,而在低氧下使[Ca²⁺]_i降低,反应性地调节PASMCs增殖。ATP敏感性钾通道(K_ATP)无论在常氧还是低氧情况下对[Ca²⁺]_i的调节不起作用。     

慢性吸烟大鼠肺动脉平滑肌细胞钾通道Kv1.5、BKCa表达的变化

目的：观察吸烟对大鼠肺动脉平滑肌大电导的钙激活的钾通道（BK_Ca）和电压依赖性延迟整流钾通道Kv1.5蛋白和mRNA表达的影响，以阐明吸烟引起的肺血管反应性改变中钾通道表达的变化。方法：复制大鼠的慢性吸烟模型，采用HE染色、免疫组织化学染色、原位杂交等方法。结果：（1）慢性吸烟可降低大鼠肺动脉平滑肌 BK_Ca 蛋白和mRNA表达；（2）慢性吸烟可降低大鼠肺动脉平滑肌Kv1.5蛋白和mRNA表达；（3）大动脉 BK_Ca的降低程度大于Kv1.5，小动脉 BK_Ca和Kv1.5的降低程度无明显差异。结论：慢性吸烟可下调大鼠肺动脉平滑肌钾通道 BK_Ca和Kv1.5的表达水平，是导致肺血管反应性增高的机制之一。     

低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞中细胞因子信号转导负调控因子3基因表达的影响

目的：研究低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）中细胞因子信号转导负调控因子3（SOCS3）基因表达的影响。方法： 低氧处理体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，采用半定量RT-PCR，免疫细胞化学法和Western blotting法检测常氧组，低氧2 h、6 h、10 h、16 h、24 h组SOCS3 mRNA和蛋白表达水平。结果：常氧培养肺动脉平滑肌细胞SOCS3 mRNA表达呈阴性，低氧培养2 h组肺动脉平滑肌细胞中SOCS3 mRNA表达升高，6 h组达高峰，10 h组开始下降，24 h检测不到其表达；免疫细胞化学定位分析示SOCS3蛋白仅于肺动脉平滑肌细胞胞浆内表达；Western blot定量分析示SOCS3蛋白与SOCS3 mRNA表达的改变基本一致。 结论： 低氧刺激肺动脉平滑肌细胞中SOCS3表达，提示SOCS3在低氧所致肺血管重建过程中可能发挥重要调节作用。