多次小剂量pEgr-IFNγ-Endostatin基因-放射治疗对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用

目的：探讨多次小剂量pEgr-IFNγ-Endostatin基因-放射治疗对荷Lewis肺癌小鼠的抑瘤 效应。 方法：将荷瘤小鼠随机分为对照组、10 Gy照射组、4次2.5 Gy照射组、4次质粒组、质粒 + 10 Gy组和4次(质粒+2.5 Gy）组。小鼠肿瘤局部注射脂质体包裹的质粒后36 h,接受X射线照射,观察各组小鼠治疗后不同时间肿瘤生长速率, 18 d后计数各组小鼠肺转移 结节数, 并称量瘤重。 结果：治疗后12~18 d,4次（质粒+2.5 Gy）组肿瘤生长速率明显低于质粒+10 Gy组（P<0.001）。治疗后18 d,4次（质粒+2.5 Gy）组小鼠肺转移结节数和瘤重明显低于质粒+10 Gy组（分别为P<0.001和P<0.01）。 结论：多次小剂量pEgr-IFNγ-Endostatin基因-放射治疗的抑瘤效应优于单次大剂量基因-放射治疗。     

pEgr-MIP3α重组质粒的构建及其在Lewis肺癌细胞中的辐射诱导表达

目的探讨辐射对转染pEgr-MIP3α质粒的Lewis肺癌细胞MIP3α表达的影响.方法用PCR方法扩增出MIP-3α基因,构建pEgr-MIP3α重组表达质粒,脂质体介导转染Lewis肺癌细胞,用RT-PCR和Western方法检测不同剂量X射线照射后的MIP-3α表达水平.结果所构建的重组质粒pEgr-MIP3α中MIP-3αcDNA正确插入表达载体;各照射组在不同剂量电子线照射后,MIP-3α表达均高于未转染组和假照射组.结论 Egr-1启动子具有辐射启动和诱导下游MIP-3α基因在Lewis肺癌中增强表达的功能,为pEgr-MIP3α用于放射-基因治疗的体内研究提供了实验基础.     

γ-干扰素在NRK细胞中的表达

以pＢＳ－ＫＳ为中间载体,通过一步亚克隆,获得了两端结构为ＨindⅢ/Ｘba Ⅰ的γ－ＩＦＮ片段,将该片段与真核表达载体ＲＣ/ＣＭＶ进行定向重组,制备出γ－ＩＦＮ真核表 达质粒ＲＣ/ＣＭＶ－ＩＦＮγ,转染ＮＲＫ细胞后,经标准ＡＢＣ法检测表明：γ－ＩＦＮ在ＮＲＫ细胞中获得稳定表达。这一体系的建立为γ－ＩＦＮ真核基因工程提供了稳定表达的工程细胞株,并为利用γ－ＩＦＮ进行基因治疗提供重要的实验依据。     

小鼠干扰素γ基因克隆、测序及辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ的构建

目的：克隆小鼠干扰素γ（IFN-γ）编码区cDNA序列并构建含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。 方法：利用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法,以小鼠脾细胞mRNA为模板,扩增获得全长IFNγcDNA,与pGEMT载体连接做全自动测序,并利用基因重组技术构建含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。 结果：经测序证实获得的小鼠IFNγ cDNA序列与文献报道完全一致,并构建了含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。结论：成功克隆了小鼠IFNγ的cDNA序列,构建了辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。     

骨桥蛋白在Lewis肺癌生长转移过程中的表达

目的建立能够模拟肿瘤生长、侵袭转移动态全过程的动物模型,利用该模型探讨骨桥蛋白在肿瘤生长转移过程中的作用。方法Lewis肺癌（LLC）在C57BL/6小鼠体内连续传代,观察第2代（早期组）、第8代（中期组）和第15代（晚期组）荷瘤小鼠肿瘤生长和肺转移的情况,采用免疫组化法检测各组荷瘤鼠肿瘤组织中骨桥蛋白（OPN）和微血管密度（MVD）的表达。结果①随传代次数的增加肿瘤生长速度加快、侵袭力增强,肺转移率升高。②OPN和MVD在早、中、晚三组小鼠瘤组织中的表达均呈升高趋势（P〈0．05）,且二者的表达呈正相关。结论OPN可能通过促进肿瘤血管生成的途径加速肿瘤的生长转移。     

PMA诱导小鼠Lewis肺癌细胞节律基因的表达

目的采用体外节律诱导剂以研究小鼠Lewis肺癌细胞近日节律基因的表达情况。方法采用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐（PMA）刺激体外培养的小鼠Lewis肺癌细胞（LLC），RT—PCR检测不同时间点mPer1的mRNA表达水平。Real—time PCR和RT—PCR检测mClock的mRNA表达水平。结果发现LLC细胞的节律基因mClock、mPer1存在近日节律振荡。结论经PMA诱导后，LLC细胞的节律基因存在近日节律振荡，为体外研究授时因子对近日节律的导引机制提供证据。     

miR-223在CXCR4~+Lewis肺癌细胞中的显著低表达及其靶基因预测

目的 分析miR-146a、miR-206、miR-223、let-7c-1等细胞分化相关miRNAs,在小鼠Lewis肺癌细胞株(theLewis lung cancer cell lines,LLC)CXCR4~+与CXCR4~-亚群间的差异表达.方法 免疫磁珠分选CXCR4~+和CXCR4~-LLC细胞,Trizol法抽提细胞总RNA,实时荧光定量PCR(TaqMan探针)检测miRNAs表达,对表达差异最为显著的miRNAs进行潜在靶基因预测,应用免疫组化方法 初步分析具有研究价值的关键分子在两个不同亚群小鼠种植瘤组织中的表达情况,并通过BLAST对其3'非翻译端(untranslated region,UTR)进行直向同源基因序列比对分析.结果 CXCR4~+与CXCR4~-LLC比较,各检测mirna表达均较低,其中以miR-223差异最为显著(Fold Change=8.26),通过软件分析预测,miR-223与IGFIR、IGFBP5、Pik3cb、ELK-1和E2F1等基因均具有可能靶位点,免疫组化检测发现CXCR4~+亚群种植瘤组织IGFIR表达显著高于CXCR4~-亚群,IGF1R 3'UTR的238～244 nt和688～695 nt两个结合位点具有高度的进化保守性.结论 miR-223在CXCR4~+LLC中显著低表达,可能与肺腺癌细胞IGFIR信号通路调控有关.     

mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细胞中的表达

目的:构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞。方法:利用PCR方法扩增mGITRL基因,克隆至pIRES2-eGFP载体,选择阳性克隆并进行序列测定。以电穿孔法转染Lewis细胞,通过G418筛选,获得稳定表达细胞株。结果:构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,基因测序与GenBank中发表的序列完全一致,体外转染Lewis细胞,经G418筛选,体外传代30代以上,RT-PCR及流式细胞仪检测该细胞株稳定表达mGITRL。结论:成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,并在小鼠Lewis细胞中稳定表达,为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。     

HA14-1诱导小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的实验研究

目的 观察HA14-1是否有诱导体外小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞凋亡作用.方法 将LLC细胞培养传代,细胞分为空白组和实验组,空白组只加培养液,实验组分别加入5种不同浓度的HA14-1(12.5,25,50,75,100 μmol/L),分别作用24,48,72 h,MTT法测定LLC细胞存活分数,流式细胞学方法测定LLC细胞凋亡情况、免疫组织化学方法测定LLC细胞Bcl-2蛋白的表达情况及HA14-1作用前后Bcl-2蛋白的表达情况.结果 两组细胞中,与空白组比较,不同浓度的HA14-1实验组作用LLC细胞后,细胞存活率随浓度增加和时间延长越来越低,细胞的凋亡率随着浓度的增加有增加趋势,其差异在统计学上有显著性意义(P<0.01);免疫组织化学结果显示LLC细胞高表达Bcl-2,且HA14-1作用后Bcl-2蛋白的表达减少.结论 HA14-1有促小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的作用.     

苦参碱增强环磷酰胺抑制小鼠Lewis肺癌的生长作用

目的:研究苦参碱(Mat)的体内抗肿瘤活性及机制.方法:采用动物移植性肿瘤实验法,腋窝皮下接种Lewis瘤株,随机分为模型组,环磷酰胺(CTX)组,单用Mat 80,40,20 mg/kg不同剂量组,CTX联合Mat组.灌胃给药21 d后,计算平均抑瘤率,绘出肿瘤动态生长曲线,称小鼠体质量及各组肺、脾、肝、肾质量.应用放免法检测血清中表皮生长因子(EGF)含量.结果:单用Mat组对Lewis瘤株没有抑制作用(P>0.05).CTX联合Mat 80 mg/kg组,抑瘤率为56.78%,与CTX组抑瘤率42.69%相比较,抑瘤率升高,差异具有统计学意义(P<0.01).CTX联合Mat 80,20 mg/kg组血清中EGF浓度分别为(0.14±0.03),(0.11±0.02)mg/L,低于CTX组和模型组(P<0.01).结论:Mat可以增强CTX对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用,其町能机制与降低EGF有关.     

pEgr-sHemopexin重组质粒的构建及体外辐射诱导表达

目的：克隆小鼠分泌型Hemopexin (sPEX) 编码区的cDNA序列,构建含Egr-1启动子的pEgr-sPEX真核表达载体,检测辐射诱导重组质粒在B16F10细胞中的表达。 方法：用RT-PCR从NIH3T3细胞中扩增出sPEX,经测序证实后,构建pEgr-sPEX重组质粒,以脂质体转染B16F10细胞,用Western blotting方法检测B16F10细胞上清中辐射诱导PEX的表达。 结果：测序表明扩增的sPEX cDNA序列与GenBank中登录的序列完全一致,sPEX cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1-Egr-1,转染入B16F10细胞内PEX基因在体外辐射诱导下成功获得表达。结论：成功地克隆了小鼠sPEX基因,并在体外证实了pEgr-sPEX具有辐射诱导表达特性。     

CXCR4阳性Lewis肺癌细胞具有促发新生血管形成的特征

目的 研究CXCR4阳性Lewis肺癌细胞(LLC)在新生血管形成时的始动作用.方法 激光共聚焦检测LLC细胞系中CXCR4抗原表达情况,观察小鼠移植瘤组织内CXCR4阳性LLC与新生血管的毗邻关系;以CXCR4作为磁珠分选细胞的表面标志,检测CXCR4阳性和阴性LLC中VEGF、MMP9 mRNA表达情况,同时免疫组化检测两亚群细胞移植瘤中VEGF、MMP9以及CD31表达情况.结果 CXCR4阳性LLC多毗邻内皮细胞,周围形成血管样结构;CXCR4阳性LLC的VEGF mRNA表达(0.439 8±0.059)明显高于CXCR4阴性LLC (0.289 9±0.003 1)(P＜0.01);CXCR4阳性LLC的MMP9 mRNA表达(0.622 3±0.013 6)明显高于CXCR4阴性LLC(0.579 2±0.017 4)(P＜0.05);CXCR4阳性LLC移植瘤组织MVD(56.87±4.83)明显高于CXCR4阴性LLC移植瘤(43.52±4.91)(P＜0.01). 结论 LLC中的CXCR4阳性亚群具有更强上调VEGF、MMP9表达的能力,具有促发新生血管形成的特征.     

腺病毒介导的小鼠γ-干扰素在小鼠肺上皮细胞中的表达

目的：观察腺病毒介导的小鼠γ干扰素（ｍＩＦＮγ）在小鼠肺上皮细胞内的转基因表达。方法：腺病毒介导的ｍＩＦＮγ在小鼠肺上皮细胞内的转基因，其表达的ｍＩＦＮγｍＲＮＡ、蛋白质及生物活性分别经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交、ＥＬＩＳＡ和抑制鼠弓形体在小鼠巨噬细胞内生长等检测技术确定。结果：病毒的细胞感染增殖率（ＭＯＩ）５０为腺病毒介导的ｍＩＦＮγ在小鼠肺上皮细胞内表达的最适浓度：在感染６ｈ后经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交发现ｍＩＦＮγｍＲＮＡ转录信号，２４ｈ达高峰；在感染１２ｈ后经ＥＬＩＳＡ检测ｍＩＦＮγ蛋白的表达阳性，４８ｈ后达峰值。经重组腺病毒感染的小鼠肺上皮细胞培养上清液中的ｍＩＦＮγ可明显抑制鼠弓形体在经大肠杆菌脂多糖刺激的小鼠巨噬细胞内的生长。结论：小鼠的ＩＦＮγ可经腺病毒介导向小鼠肺上皮细胞的转移，并可实现早期、高效且相对持久的表达，为细胞因子的体内转基因免疫治疗机制研究奠定了基础。     

18氟-脱氧葡萄糖诱导Lewis肺癌细胞凋亡的实验研究

目的：观察不同浓度18氟-脱氧葡萄糖（18F-FDG）对Lewis肺癌细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法：指数生长期Lewis肺癌细胞分为18F-FDG实验组（为92.5×104Bq/ml组、185×104Bq/ml组、370×104Bq/ml组和740×104Bq/ml组）和对照组,应用光镜、电镜、流式细胞术（flow cytometry,FCM）和免疫组化技术检测不同浓度18F-FDG作用于体外培养的Lewis肺癌细胞后,诱导脂质氧化、细胞凋亡及bcl-2和bax基因表达情况。结果：18F-FDG能诱导Lewis肺癌细胞产生凋亡形态学变化,随着18F-FDG浓度增加,脂质氧化增强、细胞凋亡率增加、bcl-2表达减弱、bax表达增强（P〈0.01）。结论：18F-FDG能诱导Lewis肺癌细胞凋亡,且凋亡具有剂量依赖性。     

γ-IFN对星形细胞肿瘤HLA-G mRNA表达的影响

目的 在细胞学层次上研究γ-IFN对星形细胞肿瘤HLA-G mRNA表达的影响.方法 原代细胞培养成功的基础上,用不同浓度γ-IFN处理,应用RT-PCR检测HLA-G mRNA表达水平的变化.结果γ-IFN处理后,HLA-G基因表达阴性的肿瘤细胞仍未见HLA-G mRNA的表达;不同浓度γ-IFN均可上调HLA-G基因表达阳性肿瘤细胞的HLA-G mRNA水平,并呈刑量依赖关系.结论 γ-IFN可以上调HLA-G基因阳性表达肿瘤细胞的HLA-G基因表达.     

Lewis肺癌在小鼠体内传代过程中生长转移能力的演变与炎症的关系

目的：观察Lewis肺癌细胞株（LLC）在C57/BL6小鼠体内连续传代过程中其生长转移能力及瘤组织中炎性因素的变化,探讨肿瘤生长转移能力的演变与炎症的关系.方法：将LLC细胞接种于C57/BL6小鼠腋下,建立第1代荷瘤鼠模型,荷瘤鼠连续传代,于第2,8,15代各传15只小鼠分为早期、中期、晚期组,观察3组小鼠的岀瘤速度及肺转移情况.免疫组化法检测3组瘤组织中巨噬细胞密度、微血管密度（MVD）、核转录因子-κB（NF-κB）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达情况.结果：随着荷瘤鼠传代次数的增加肿瘤的生长转移能力逐渐增强,早期、中期、晚期3组小鼠的岀瘤速度明显加快;肺转移率明显增加,分别为13%,60%,100%（P〈0.01）.早期、中期、晚期3组小鼠瘤组织中浸润的巨噬细胞分别为（24.87±8.54）,（36.33±10.02）,（47.20±13.49）个/HP;微血管密度分别为（24.73±10.38）,（41.27±13.50）,（55.80±21.31）个/HP;NF-κB,MMP-9的表达明显增强,差异具有统计学意义（P〈0.05）.肿瘤组织中MVD,NF-κB,MMP-9的表达均与巨噬细胞的增多呈正相关,差异具有统计学意义（P〈0.01）.结论：Lewis肺癌在小鼠体内连续传代过程中生长转移能力逐渐增强,这种演变与肿瘤组织中炎症浸润的增强有重要的关系.     

拓扑替康对小鼠Lewis肺癌的抑制作用

目的：探讨拓扑替康对小鼠Lewis肺癌的抑制作用及抗血管生成作用。 方法：将Lewis肺癌模型小鼠随机分为对照组10只及拓扑替康小、中、大（0.312、0.624 和1.248 mg•kg^-1）剂量组各15只,第21天处死小鼠,观察肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线,计算原发瘤抑瘤率,免疫组织化学染色计数肿瘤组织微血管密度（MVD）及检测血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达。 结果：拓扑替康各剂量组较对照组小鼠的肿瘤生长缓慢,原发瘤抑瘤率与对照组相比差异有显著性（P<0.05）;拓扑替康大、中剂量组MVD与对照组比较差异有显著性（P<0.05）;各剂量组VEGF阳性率均较对照组低。 结论：拓扑替康明显地抑制小鼠Lewis肺癌原发瘤的生长,并可抑制肿瘤的微血管生成。     

肺金生方对Lewis肺癌小鼠VEGF-C、 nm23表达的影响

目的:探讨肺金生方对Lewis肺癌小鼠VEGF-C、nm23表达的影响。方法:取60只C57BL/6小鼠,常规接种Lewis肺癌瘤株,随机分为生理盐水组、环磷酰胺(CTX)组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、CTX加中药组,每组10只。各组给予相应药物灌胃14天后处死,取肺组织观察肺转移数,取肿瘤组织甲醛固定后免疫组化检测VEGF-C、nm23表达。结果:肺金生方中、高剂量对Lewis肺癌小鼠自发肺转移有抑制作用(P<0.01),中药肺金生方各剂量组及CTX、CTX加中药组均能降低VEGF-C表达(P<0.01、P<0.05),而中药中、高剂量组、CTX加中药组均能提高nm23的表达(P<0.01),中药中、高剂量组nm23表达比CTX加中药中剂量组更高(P<0.05)。结论:肺金生方抑制Lewis肺癌小鼠自发肺转移可能与其降低VEGF-C表达和提高nm23的表达有关。     

早幼粒细胞白血病蛋白在肺癌中的表达及其临床意义

目的研究早幼粒细胞白血病蛋白（PML）在肺癌中的表达及其与临床预后的关系。方法利用组织芯片进行SP免疫组织化学染色,检测PML蛋白在148例肺癌、5例良性肺肿瘤和7例肺正常组织中的表达。结果4例肺癌组织没有达到评价标准而被排除。2例肺良性肿瘤和1例正常支气管黏膜细胞核明显表达PML;非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）细胞核PML表达率分别为31．4％和8．7％（x^2=4．968,P=0．026）。PML在SCLC和NSCLC细胞质的表达率分别为39．1％和14％（x^2=6．609,P=0．010）。PML阳性和阴性SCLC的术后5年累积生存率分别为50％和23％（Log—Rank;x^2=3．931,P=0．047）。COX多因素分析示PML表达是SCLC预后的独立影响因素。结论PML表达可能与SCLC患者生存期延长相关。     

拓扑异构酶Ⅰ抑制剂对小鼠Lewis肺癌细胞杀伤和诱导凋亡作用的研究

目的观察拓扑异构酶Ⅰ抑制剂（拓扑替康，TPT）对小鼠Lewis肺癌细胞杀伤和诱导凋亡作用。方法采用MTT法、AnnexinV染色、梯状DNA电泳与细胞形态学观察等方法分析TPT对小鼠Lewis肺癌细胞的杀伤作用、凋亡作用，分析靶细胞杀伤、凋亡作用与Caspase的关系。结果TPT对靶细胞株具有较强的杀伤作用，而且具有明显的时间依赖性，同时，靶细胞出现凋亡表现。Caspase酶特异性抑制剂对凋亡具有一定的影响。结论唧对小鼠Lewis肺癌细胞具有较强的杀伤和诱导凋亡作用，其机理可能涉及到Caspase-8、Caspase-3的有序性活化。