人软骨调节素基因的克隆与纯化

目的克隆人软骨调节素I(CHM-I)cDNA,并在原核表达系统中表达和纯化。方法利用RT-PCR技术从人软骨组织中扩增出CHM-I基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET28a中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG进行诱导表达;对在N末端融合了6×His纯化标签的表达产物进行Westernblot分析和用Ni2+2NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度分析。结果获得了人软骨调节素cDNA,并成功构建了高效原核表达质粒pET(CHM-I),能有效表达CHM-I蛋白,且CHM-I蛋白的纯度高于90%。结论原核表达系统可有效克隆较高纯度的CHM-I基因。     

人源性MIF cDNA的克隆及其原核高效表达的研究

目的克隆人MIF cDNA并构建其高效原核表达载体,表达和纯化得到高纯度的可溶性hMIF蛋白.方法经RT-PCR从人乳腺癌细胞株MDA-MB453中扩增到hMIF cDNA,并克隆到原核表达载体pET11b中.测序验证后将其转入大肠杆菌BL21中表达,最后经离子交换和疏水层析法纯化hMIF蛋白.结果克隆到的hMIF cDNA与Genebank已发表的序列完全一致,纯化得到的产物经Western blotting鉴定证实为hMIF蛋白.结论应用基因重组技术成功构建了pET11b/hMIF重组质粒,在大肠杆菌中实现了高效表达;纯化到高纯度的可溶性hMIF蛋白,为治疗性抗hMIF抗体的研究创造了条件.     

重组人SMAC及SMAC-PTD的制备

目的制备重组人SMAC及SMAC-PTD.方法经RT-PCR从人HeLa细胞中扩增人野生型SMAC及SMAC-PTD cDNA,分别构建于原核表达质粒pET28a( ),测序正确后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2 -NTA层析纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白.结果RT-PCR扩增分别得到编码人SMAC及SMAC-PTD cDNA片断,测序结果正确,重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达.结论成功制备了高纯度的人野生型SMAC及SMAC-PTD融合蛋白,为进一步研究奠定了基础.     

人HMGB1的制备及功能鉴定

目的在克隆人HMGB1(high mobility group box-1)全长cDNA的基础上,用大肠杆菌进行表达并鉴定其生物学活性.方法用RT-PCR方法扩增人HMGB1 cDNA,克隆至载体pUC19行序列测定后,再构建于原核表达载体pQE-80L并转化大肠杆菌DH5α,以IPTG诱导HMGB1蛋白表达,Ni2 -NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化后,用培养的人单核细胞系THP1检测重组蛋白活性.结果构建了人HMGB1蛋白的重组表达质粒pQE-80L/HMGB1,获得了纯度约96%的纯化蛋白产物,该蛋白能刺激THP1细胞产生TNF-α.结论成功制备了具有生物学活性的人HMGB1蛋白纯品,为进一步的功能研究奠定了基础.     

人源胸腺素α原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达

目的克隆人胸腺素α原/白介素2融合基因,构建其原核表达载体并在大肠杆菌系统中有效表达。方法采用RT-PCR方法,从人白血病细胞和人T淋巴细胞中分别扩增得到胸腺素α原/白介素2基因,利用基因重组技术将融合基因片段重组于pET42a原核表达载体上,构建成pET42a-PI。经酶切、测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导蛋白表达。表达产物经离子交换和分子筛纯化后进行Western blot分析,通过人外周血单核细胞玫瑰花结实验对融合蛋白进行了初步的活性测定。结果凝胶电泳显示PCR产物的长度约750 bp,测序结果表明,扩增片段与预期序列一致。重组菌在IPTG诱导下表达相对分子质量为28 kDa的蛋白,纯化后的融合蛋白能提高人外周血单核细胞玫瑰花结形成率,表明具有一定活性。结论成功克隆和构建了人胸腺素α原/白介素2融合基因的原核表达载体,并在原核表达系统中得到有效表达。     

结核分枝杆菌furB基因的克隆、表达和纯化

目的: 从H37Rv基因组中扩增furB并高效表达和纯化. 方法: 用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增furB序列,将其与pGEM-T-Easy载体连接转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/furB,测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coli DH5α,IPTG诱导目的蛋白表达. 经Western blot鉴定目的基因与(His)6融合表达,将已表达的蛋白质通过Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果: PCR得到结核分枝杆菌furB,测序结果与Genbank中报道的完全一致. SDS-PAGE显示,在Mr为15.0×103处有相应的蛋白质表达条带,Western blot鉴定为(His)6融合表达蛋白. 经Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白. 结论: 成功克隆了铁调节蛋白基因furB序列,并在E.coli DH5α高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白.     

重组大鼠溶菌酶C端多肽的原核表达与纯化

目的 应用基因重组技术,构建pET30a(+)与LY70的原核表达重组质粒.方法 采用PCR方法扩增LY70基因,经Nde I和Not I双酶切后插入相同酶切pET30a(+)载体,转化DH5α感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌Ecoli Rosetta (DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性,表达产物经Ni+-NTA琼脂糖柱层析纯化.结果 成功构建了重组表达载体pET30a(+)与LY70,并优化表达,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在.结论 原核细胞可以高效表达溶菌酶的C端多肽而不影响原核表达系统,不失为一种制备溶菌酶功能性多肽的有效手段.     

人CD96基因胞外区的原核表达及抗血清制备

摘要：目的原核表达并纯化人CD96胞外区蛋白,免疫家兔制备抗体。方法构建pET32-CD96重组质粒,转化大肠埃希
菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂纯化蛋白并免疫家兔,以间接ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗
体特异性。结果质粒pET32-CD96经测序鉴定,通过SDS电泳显示能在BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约37 000;
Western blot实验结果显示制备的多克隆抗体可与HL-60细胞提取蛋白及原核表达的人CD96蛋白胞外区特异性结合。
结论成功构建并表达人CD96胞外区蛋白,免疫家兔获得高滴度抗血清,为后续研究奠定了基础。     

鼻咽癌人源抗独特型基因工程抗体的原核表达及鉴定

目的构建鼻咽癌人源抗独特型单链抗体原核表达载体，对其产物做初步鉴定，为鼻咽癌疫苗制备奠定基础。方法采用分子克隆技术，PCR扩增G22ScFv基因，并将其克隆到原核表达载体pET25b（＋）上，将重组子转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达后，表达的蛋白经His—tag纯化试剂盒纯化后复性。SDS—PAGE及Western blot分析融合蛋白。结果构建的原核表达载体pET25b（＋）－G22经测序检测，序列正确。在大肠杆菌中G22ScFv以包涵体形式获高效表达，SDS－PAGE及Western blot鉴定表达的目的蛋白Mr为25kD，同时证实载体构建及表达均正确。目的蛋白经试剂盒纯化后电泳分析纯度达95％以上。结论利用基因重组技术，在原核细胞中表达出重组G22ScFv并得到纯化，为研究鼻咽癌疫苗打下了基础。     

新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备

目的:PCR扩增得到新基因ZNFD(Znf domain containing protein),构建pET32a-ZNFD原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:通过PCR的方法克隆新基因ZNFD,选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列,克隆到原核表达载体pET32a上,利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Western blot鉴定其效价和特异性。结果:经测序鉴定已成功克隆ZNFD基因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约为45 kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论:得到纯化的ZNFD蛋白,制备的多克隆抗体达到了一定的效价,且具有高特异性,为进一步研究ZNFD的功能奠定了实验基础。     

核受体PPARγ-LBD在原核系统的最适表达及纯化

目的　探索诱导PPARγ LBD的最适表达条件 ,提高可溶性PPARγ LBD蛋白在大肠杆菌中的表达量 ,然后用Ni2 + NTA离子交换树脂对表达蛋白进行分离纯化。方法　PPARγ LBD在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中进行诱导表达时 ,以不同IPTG浓度、不同温度 ( 3 7℃ ,3 0℃ ,2 0℃ ) ,确定可溶性PPARγ LBD蛋白表达的最适条件 ;然后用Ni2 + NTA离子交换树脂进行分离纯化 ,其产物进行SDS PAGE纯度分析和Westernblotting鉴定。结果　建立了重组蛋白PPARγ LBD的最适诱导条件 ,即 0 .5mmol LIPTG浓度 ,2 0℃诱导 14h其可溶性表达蛋白的量最高 ;纯化产物经SDS PAGE纯度分析大于 90 %以上 ;Westernblotting检测 ,纯化产物为PPARγ LBD目的蛋白 ,其分子质量约 3 4× 10 3。结论　重组蛋白PPARγ LBD在E .coli中进行了成功表达和纯化 ,并且降低温度可提高可溶性蛋白PPARγ LBD表达量达 5 0 %以上     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达纯化与鉴定

目的:表达和纯化RpfA融合蛋白.方法:将含有RpfA基因片段的质粒用NdeI与BamHⅠ双酶切,然后将目的基因片段克隆入pcDNA3.1 载体构建重组载体pcDNA3.1 -RpfA,测序正确后再将目的基因片段亚克隆入pET19b原核表达载体并转化E.coli DE3,IPTG诱导表达融合蛋白,Western blot鉴定融合蛋白.在变性条件下Ni2 -NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白.结果:目的基因片段测序与Genbank报道一致(切去了5'端99 bp).SDS-PAGE显示,在Mr约为80 ku处有表达条带,Western blot鉴定为(His)6融合蛋白,并与小鼠抗Rv1884和抗Rv2389免疫血清有交叉反应.可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在.经Ni2 -NTA亲和色谱柱纯化得到了融合有6个组氨酸残基的RpfA融合蛋白.结论:成功构建了pET19b-RpfA表达载体,并在E.coli DE3中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白.     

PCR产物靶向克隆法构建pET15b-CAT及His-tag-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT,并表达和纯化出His-tag-CAT融合蛋白。方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。以pZeoSV2(+)-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增。将纯化的人CAT cDNAPCR产物与经XhoⅠ和BamH Ⅰ酶切的线性化载体pET15b以6∶1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT。重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定。pET15b-CAT转化BL21(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达出His-tag-CAT融合蛋白,采用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析。结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT。SDS-PAGE和Western blot结果表明,转化了pET15b-CAT的宿主菌表达出了His-tag-CAT融和蛋白,经Ni2+-NTA树脂亲和层析得到了纯化的His-tag-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶的活性,活性值为80.23U/g。结论:采用PCR产物靶向克隆法成功地构建了pET15b-CAT,并表达和纯化出了His-tag-CAT融和蛋白,为采用外源性CAT防治与氧化应激损伤相关性疾病奠定了基础。     

丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白.方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His tag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IVTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Western blot检测具有6×His tag蛋白的免疫学活性.结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础.     

大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达和纯化大鼠腺苷酸转运体（ANT1）蛋白并制备其多克隆抗体.方法：通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E. coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,Ni2＋-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果：成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10^3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr32×10^3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论：利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.     

pET15b-YARA-EGFP原核表达质粒的构建及融合蛋白YARA-EGFP的表达与纯化

目的:构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,并进行YARA-EGFP融合蛋白的表达和纯化。方法:用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果:经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-YARA-EGFP,YARA-EG-FP融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为1.098mg/mL。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-EGFP。结论:已成功制备出YARA-EGFP融合蛋白。     

GST-PPARγC1原核表达载体的构建、表达及抗GST-PPARγC1多克隆抗体的制备

目的 在大肠杆菌中表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(PPARγC1)与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白，并制备抗PPARγC1的多克隆抗体。方法 从肝癌细胞系HepG2提取总RNA，用RT-PCR扩增出PPARγC1 cDNA的编码序列，克隆入表达载体pGEX-4T-1中，重组载体在酶切鉴定后，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-PPARγC1蛋白，SDS-PAGE分析表达产物，通过亲和层吸法纯化表达的GST-PPARγC1融合蛋白，并以此为抗原制备多克隆抗体。Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果 经测序、酶切鉴定证明，PPARγC1基因已正确插入到pGEX-4T-1中，经IPTG诱导后，表达出相对分子量为44000的融合蛋白。Western blotting鉴定所制备的多克隆抗体可以与PPARγC1特异性结合。结论 PPARγC1片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体，为检测PPARγC1及其在其他组织中的表达提供了一种检测途径。     

GST-PPARγC1原核表达载体的构建、表达及抗GST-PPARγC1多克隆抗体的制备

目的 在大肠杆菌中表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(PPARγC1)与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗PPAR γC1的多克隆抗体.方法 从肝癌细胞系Hep G2提取总RNA,用RT-PCR扩增出PPAR γ C1 cDNA的编码序列,克隆人表达载体pGEX-T-1中,重组载体在酶切鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-PPARγC1蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.通过亲和层吸法纯化表达的GST-肿ARγC1融合蛋白,并以此为抗原制备多克隆抗体.Westernblotting检测重组抗原的免疫活性.结果 经测序、酶切鉴定证明,PPARγC1基因已正确插入到pGEX-T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为000的融合蛋白.Western blotting鉴定所制备的多克隆抗体可以与PPARγC1特异性结合.结论 PPARγC1片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体,为检测PPARγC1及其在其他组织中的表达提供了一种检测途径.     

肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2（FhSAP-2）的原核表达及分离纯化

目的 建立肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2（FhSAP-2）原核表达系统.方法用生物信息学软件OptimumTM Codon优化密码子适应指数（CAI）、最优密码子频率（FOP）及GC含量以获得适合大肠杆菌BL-21表达的FhSAP-2基因序列,并克隆到原核表达载体pET22b和pET28a中,经IPTG诱导其表达并经亲和层析及离子交换色谱纯化后获得目的 蛋白.结果 OptimumTM Codon获得优化后的FhSAP-2序列,经测序及酶切鉴定结果表明重组质粒pET22b-FhSAP-2、pET28a-FhSAP-2构建成功,进一步实验结果表明FhSAP-2在pET28a中包涵体部位表达,可溶部位不表达;在pET22b中可溶部位表达量低,包涵体部位无表达.继而经Ni-NTA柱亲和纯化及离子交换色谱纯化获得电泳纯的FhSAP-2蛋白.结论成功建立FhSAP-2的原核表达系统.     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.