子宫内膜癌中microRNA-125b对HER2基因3' 非翻译区的调控作用

目的:明确miR-125b在子宫内膜癌中对HER2基因3'UTR的靶向调控作用.方法:分别构建野生型和突变型HER2基因 3'UTR荧光素酶载体;软件预测HER2基因 3'UTR靶向miRNAs;共转染miR-125b和荧光素酶载体于HEC-1B细胞中,双荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性.结果:通过软件预测在HER2 3'UTR第37bp位置有一个miR-125b结合位点;与转染对照miR组和突变型载体组相比,miR-125b前体能明显降低野生型载体的荧光素酶活性.结论:miR-125b能够靶向负性调控HER2基因 3'UTR活性.     

微小RNA-373靶向调控LATS2的表达及其对肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-373（miR-373）靶向调控大肿瘤抑制因子2（LATS2）的表达及其对肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测HepG2细胞及正常肝细胞LO2中miR-373的表达水平,采用Lipofectamine脂质体法将miR-373抑制剂及阴性对照转染至HepG2细胞并分为抑制剂组和对照组,采用QPCR法检测两组的miR-373水平以评价转染效果,MTT法和流式细胞术分别检测各组细胞的增殖及凋亡情况,Western blotting检测各组凋亡相关基因（Bax和caspase-3）及LATS2的表达情况,采用双荧光素酶报告实验验证miR-373与LATS2间的靶标关系。结果 与LO2细胞相比,HepG2细胞中miR-373的表达水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;转染后抑制剂组的miR-373水平低于对照组（P＜0.05）,提示抑制HepG2细胞miR 373表达成功;与对照组比较,抑制组的细胞增殖率降低,凋亡率及Bax、caspase-3和LATS2蛋白水平均升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;双荧光素酶报告基因实验表明miR-373可显著抑制野生型LATS2-3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性,而对突变型LATS2-3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响。结论 miR-373可靶向调控LATS2的表达,且抑制miR-373表达可抑制HepG2细胞增殖并诱导凋亡,为肝癌的靶向治疗提供一定参考。     

miR-216b通过靶向调控蛋白激酶Cα基因的表达抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭

目的 明确miR-216b是否通过靶向调控蛋白激酶Cα(PKCα)基因的表达来抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭.方法 构建PKCα 3'非编码区(UTR)-荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告系统检测miR-216b对PKCα 3'UTR-荧光素酶活性的影响.将miR-216b模拟物转染鼻咽癌细胞CNE2,采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测PKCα mRNA和蛋白的表达水平.将PKCαsiRNA转染CNE2细胞,通过MTS细胞增殖实验和Transwell侵袭实验观察PKCα基因表达下调对CNE2细胞增殖和侵袭的影响.将PKCα重组质粒与miR-216b模拟物共转染CNE2细胞,通过MTS细胞增殖实验检测CNE2细胞的增殖能力.结果 双荧光素酶报告检测结果显示,miR-216b能特异性地与PKCα mRNA的3'UTR结合,下调荧光素酶活性,其活性约为转染对照模拟物细胞的62.4％.过表达miR-216b的CNE2细胞中PKCα mRNA和蛋白的表达水平均降低,与对照细胞比较,分别降低49.1％和55.7％.siRNA干扰PKCα表达能抑制CNE2细胞的增殖和侵袭能力,能部分模拟miR-216b的抑瘤功能.过表达PKCα能部分逆转miR-216b对CNE2细胞的增殖抑制作用.结论 miR-216b通过靶向调控PKCα基因的表达来抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭.     

miR-26a/b调控p53/MDM2通路对胃癌细胞凋亡的影响

目的 探讨miR-26a/b调控p53/MDM2通路对胃癌细胞凋亡的影响。方法 实时荧光定量PCR检测胃癌细胞系MGC803、MKN-45和MKN-28中miR-26a/b的表达水平,荧光素酶报告系统分析miR-26a/b与MDM2 3’非翻译区（3’UTR）的结合情况;将化学合成miR-26a/b前体分子mimics和无关序列转染胃癌细胞MKN-45,化学合成miR-26a/b inhibitor转染胃上皮细胞GES-1后,Western blotting检测MDM2、p53及其下游分子p21和Bcl-2的表达,MTT法检测转染24、48、72 和96 h的细胞增殖情况;通过Annexin Ⅴ/PI双染检测miR-26a/b对MKN-45细胞凋亡情况。结果 与永生化胃上皮细胞GES-1相比,miR-26a/b在肿瘤细胞系MGC803、MKN-45和MKN-28中的表达均下调,在MKN-45中表达水平最低;荧光素酶活性检测显示,miR-26a/b过表达抑制MDM2 3’UTR报告载体（Wild）的荧光素酶活性,而对3’UTR突变型报告载体（Mutation）荧光素酶活性无明显影响。miR-26a/b抑制MKN-45细胞中MDM2表达并增强p53及下游分子表达,而在GES-1细胞中抑制miR-26a/b可以增强MDM2表达,降低p53及下游分子表达。MTT结果显示,miR-26a/b抑制MKN-45细胞的增殖,miR-26a/b inhibitor则明显促进GES-1细胞的增殖。通过AnnexinⅤ/PI检测细胞凋亡发现,miR-26a/b过表达的MKN-45细胞的凋亡率高于对照细胞（P＜0.01）。结论 miR-26a/b 能与MDM2 3’UTR 特异结合,调控p53/MDM2通路影响胃癌细胞的增殖及凋亡。     

微小RNA-181a在人食管癌EC9706细胞中对靶基因PRDM1调控作用的研究

目的:构建微小RNA(microRNA,miR)-181a的真核表达载体和靶基因PRDM1(encoding PR domain containing1,with ZNF domain)的3’非翻译区(3’-untranslated region,3’UTR)荧光素酶报告载体,在人食管癌EC9706细胞中验证miR-181a对靶基因PRDM1的调控作用。方法:根据miR-181a成熟序列在基因组中的位置及其上下游200个碱基序列,以人食管癌KYSE150细胞基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增包含miR-181a前体的序列,克隆到线性化的pMD18-T Simple载体中,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后亚克隆到质粒pCDNA3.1(+)上,对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。通过实时定量PCR法检测人食管癌EC9706细胞转染重组表达载体pCDNA3.1-miR-181a后成熟miR-181a的表达水平。应用生物信息学预测软件对miR-181a的靶基因进行预测,将候选靶基因PRDM1的3’UTR融合到pMIR荧光素酶基因下游,通过双荧光素酶报告基因检测miR-181a对靶基因PRDM13’UTR的调控作用。将pCDNA3.1-miR-181a表达质粒转染到人食管癌EC9706细胞中,蛋白质印迹法检测其对PRDM1蛋白表达的影响。结果:成功构建miR-181a真核表达载体,实时定量PCR验证表明pCDNA3.1-miR-181a在EC9706细胞中能够过表达成熟miR-181a。生物信息学预测PRDM1可能是miR-181a的靶基因之一,于是构建了PRDM1的3’UTR荧光素酶报告载体pMIR-PRDM1,在此基础上对PRDM1的3’UTR"种子区"进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明,miR-181a能够作用于PRDM1基因的3’UTR。蛋白质印迹法进一步证实,miR-181a能够抑制性调控内源性PRDM1蛋白的表达。结论:MiR-181a作用于PRDM1基因的3’UTR,在转录后水平上调PRDM1蛋白的表达,提示PRDM1是miR-181a直接调控的靶基因。     

miR-1269a调控HOXD10基因抑制胆管癌细胞侵袭的作用及其机制

目的 探讨miR-1269a对HOXD10基因的调控作用及对胆管癌细胞侵袭能力的影响。方法 预测并筛选出调控HOXD10基因的miR-1269a作为研究对象;转染miR-1269a模拟物（mimic）及抑制剂（inhibitor）至胆管癌细胞系后检测 HOXD10mRNA及蛋白的表达变化,并观察miR-1269a对胆管癌细胞侵袭能力的影响。双荧光素酶报告基因实验验证miR-1269a与HOXD10之间的靶向作用关系。结果 miR-1269a在胆管癌组织中表达显著高于癌旁组织（P=0.0023）;miR-1269a模拟物可显著降低胆管癌细胞中HOXD10 mRNA（Mz-CHA-1: P=0.0025; RBE: P=0.0038）及蛋白表达水平,且细胞的侵袭能力较对照组显著增强（Mz-CHA-1: P=0.004; RBE: P=0.004）。miR-1269a抑制剂转染则出现相反的结果（QBC939: P=0.16; HCCC9810: P=0.13）。miR-1269a明显抑制野生型HOXD10-3’UTR 的荧光素酶活性,而对突变型质粒转染细胞的荧光素酶活性无影响。结论 miR-1269a靶向负性调控HOXD10基因,在胆管癌细胞侵袭过程中发挥重要作用。     

微小RNA-199b-3p靶向调控SOX6的表达及其对结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-199b-3p（miR-199b-3p）靶向调控SOX6的表达及其对结肠癌细胞SW620增殖及凋亡的影响。方法 采用Lipofectamine脂质体法将miR-199b-3p抑制剂及阴性对照（NC）转染至SW620细胞并分为抑制剂组和NC组,同时以未转染的SW620细胞作对照。采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测3组miR-199b-3p的表达以评价转染效果,MTT法和Annexin Ⅴ-FITC／PI流式细胞术检测转染后的增殖活性及凋亡率,QPCR和Western blotting检测各组凋亡相关基因（Bax和caspase-3）及SOX6的mRNA和蛋白水平,构建含有野生型及突变型SOX6-3’UTR的荧光报告基因质粒并采用双荧光素酶报告实验验证miR-199b-3p对SOX6的靶向调控作用。结果 QPCR检测显示,转染48 h后抑制剂组的miR-199b-3p的表达水平为0.526±0.034,低于未转染组的1.009±0.064和NC组的0.960±0.057,差异有统计学意义（P＜0.05）;与其余两组相比,抑制剂组转染24、48、72 h后的SW620细胞的增殖活性均降低（P＜0.05）;抑制剂组的凋亡率为（37.533±1.459）％,高于未转染组的（6.101±0.663）％和NC组的（8.753±1.061）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）;抑制剂组SW620细胞的SOX6、Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均高于未转染组和NC组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验表明 miR-199b-3p可显著抑制野生型 SOX6-3’UTR的荧光荧光素酶活性,而对突变型质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响。结论miR-199b-3p可靶向调控SOX6的表达,且下调miR-199b-3p表达可抑制SW620细胞的增殖并诱导凋亡,为结肠癌的治疗提供潜在的分子治疗靶点。     

miR-125b抑制胶质瘤细胞增殖作用机制研究

目的 探讨 miR-125b抑制胶质瘤细胞增殖的分子作用机制。方法 选取2016年12月至2017年12月宁夏医科大学总医院收治的胶质瘤患者32例（男18例、女14例）,选择同期行脑内血肿清除术的脑出血或因颅脑损伤行颅内减压术的但脑组织正常患者31例为对照组（男15 例、女 16 例）。利用qPCR法检测miR-125b在胶质瘤组织和人胶质瘤细胞系 LN229的表达,通过转染miR-125b 模拟物,检测miR-125b对胶质瘤细胞LN229增殖的抑制作用,采用Targetscan、miRanda等预测软件对miR-125b的作用靶点进行预测,以双荧光素酶报告基因系统分析miR-125b与STAT3的相互作用,运用Western blot法检测miR-125b对胶质瘤细胞LN229中STAT3表达的影响。结果 与正常癌旁脑组织相比较,胶质瘤组织中miR-125b的表达水平明显降低,胶质瘤细胞系LN229中miR-125b的表达与正常星形胶质细胞明显降低,相比于NC 模拟物,转染miR-125b 模拟物之后LN229细胞的增殖显著抑制,双荧光素酶报告基因系统检测显示,miR-125b 可直接调控STAT3 转录活性,而且miR-125b显著抑制LN229细胞STAT3表达。结论 miR-125b可靶向STAT3的表达从而调控胶质瘤细胞的增殖。     

miR-147靶向MDM2调控卵巢癌细胞Skov3增殖与凋亡的机制研究

目的 探讨微小RNA-147（miR-147）靶向调控鼠双微粒体2蛋白（MDM2）的表达及其对卵巢癌细胞株Skov3增殖与凋亡的影响。方法 采用Lipo2000脂质体法将miR-147 模拟物（mimics）及阴性对照（NC）转染至Skov3细胞并分为miR-147 mimics组和NC组,采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测转染48 h后Skov3细胞的miR-147水平以评价转染效果,分别采用MTT法及流式细胞术检测两组转染后的增殖及细胞凋亡情况,Western blotting检测两组MDM2、p53和caspase-3表达水平,采用双荧光素酶报告实验验证miR-147与靶标MDM2之间的靶向关系及结合位点。结果 QPCR检测显示,miR-147 mimics组miR-147的表达水平高于NC组,差异有统计学意义（P<0.05）,提示在Skov3细胞中过表达miR-147成功。与NC组相比,miR-147 mimics组的增殖率和MDM2水平均降低,但凋亡率及p53和caspase-3水平均升高,差异有统计学意义（P<0.05）;双荧光素酶报告实验检测发现miR-147可显著抑制野生型MDM2-3’端非翻译区（UTR）质粒转染细胞的荧光素酶活性,而对突变型MDM2-3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响。结论 miR-147可靶向MDM2的表达,且过表达miR-147表达可抑制Skov3细胞的增殖并诱导凋亡,在卵巢癌防治上有一定参考价值。     

miR-152对HLA-G的作用靶点预测与验证

目的：预测miR-152分子对HLA-G的作用靶点并进行实验验证.方法：采用PITA软件分析miR-152与HLA-G的相互作用位点,构建含有该作用位点的HLA-G 3UTR真核表达质粒pMIR-UTR.转染实验分为3组：pMIR-UTR与pre-miR-152共转染JEG-3滋养细胞（实验组）,仅转染pMIR-UTR质粒（空白对照）,共转染pMIR-UTR与pre-miR-control分子（阴性对照）,所有细胞均转染pMIR-β-gal质粒以标准化实验背景,转染48h后进行荧光素酶检测.结果：JEG-3细胞中HLA-G的3＇UTR存在与miR-152的种子序列完全互补的结构.荧光素酶报告系统结果显示：与空白对照组和阴性对照组相比,转染pre-miR-152的实验组其荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）.结论：miR-152可以通过作用于HLA-G的3 ＇UTR区从而抑制HLA-G的表达.     

miR-92b 通过调控EZH2 基因的表达抑制食管癌细胞Eca109 的增殖和侵袭

目的：探讨食管癌（esophageal carcinoma,EC）细胞中miR-92b 对组蛋白甲基转移酶zeste 同源物增强子2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因表达的调控作用,以及对EC细胞增殖和侵袭能力的影响。方法：选取河北医科大学第四医院科研中心保存的2016 年1 月至2017 年1 月15 例EC患者手术癌组织标本,通过生物信息学软件预测分析对EZH2 可能调控的miRNAs,将预测的miRNAs mimic 分别转染人EC细胞Eca109 后,采用实时荧光定量PCR、Western blotting 和双荧光素酶报告基因实验验证miRNAs对EZH2 基因的靶向调控作用。同时将EZH2 过表达质粒共转染至Eca109,然后采用CCK-8 法、流式细胞术和Transwell 细胞侵袭及迁移实验分别检测miRNAs 和EZH2 表达变化对EC 细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。结果：转染miR-92b 的Eca109 细胞中EZH2 mRNA与mimic-NC相比明显降低(P<0.01),转染miR-92b 的Eca109 细胞中EZH2 蛋白表达水平明显低于转染mimic-NC组(0.525±0.052 vs 0.689±0.026,P<0.01）。生物信息学软件分析显示,miR-92b、let-7a 及miR-25 可与EZH2 基因3’端非翻译区的结合位点相结合,但仅有miR-92b 可以调控EZH2 基因的表达,且miR-92b 表达与EZH2 mRNA表达成负相关(P<0.01)。miR-92b mimic 转染后EZH2 mRNA、蛋白及荧光素酶报告基因活性均明显下调（均P<0.01）,对Eca109 细胞凋亡无明显影响(P>0.05);miR-92b mimic 转染能抑制ECa109 细胞的增殖和侵袭及迁移能力(P<0.01)。而EC细胞转染EZH2 过表达质粒后,miR-92b mimic 对ECa109 细胞增殖和侵袭及迁移能力的抑制作用明显减弱(P<0.01)。结论：miR-92b 可抑制ECa109细胞的增殖和侵袭及迁移能力,其作用机制可能与靶向调控抑癌基因EZH2 的表达有关。     

MiR-125b靶向A20/NF-κB信号通路促进胰腺癌细胞增殖机制的研究

[目的]研究miR-125b在胰腺癌组织及细胞系中的表达,探讨其对胰腺癌细胞增殖的影响及作用机制。[方法]QRT-PCR检测miR-125b在60例胰腺癌患者癌组织和癌旁组织中,及3株胰腺癌细胞系和1株正常胰腺导管上皮细胞中的表达;miR-125b敲减慢病毒质粒及阴性对照空载体质粒vector感染SUIT-2细胞,经1.0μg/ml嘌呤霉素筛选稳定敲减miR-125b或vector的SUIT-2细胞,注射到BALB/c裸鼠中,观察抑制miR-125b对胰腺癌细胞体内增殖能力的影响;利用Targetscan 7.2软件及荧光素酶报告基因试验,分析miR-125b对A20基因的靶向作用;SUIT-2细胞转染miR-125b inhibit和scramble后,体外实验检测miR-125b对细胞增殖、肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(tumor necrosis factorα-induced protein 3,TNFAIP3,又称A20)和NF-κB信号通路关键蛋白IKKα/β、IκBα、p65的表达影响。[结果]MiR-125b在胰腺癌的组织中的表达显著高于癌旁组织(0.99±0.21 vs 0.68±0.17,P<0.05);miR-125b在SW1990、SUIT-2、BxPC3胰腺癌细胞系中的表达显著高于在正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7中的表达(4.81±0.13,8.63±0.27,5.64±0.21 vs1.00±0.05,P均<0.05);SUIT-2_(mi R-125b)的裸鼠成瘤体积显著低于SUIT-2_vector细胞(P<0.05)。TargetScan软件预测和荧光素酶报告基因实验验证A20为miR-125b的靶基因;转染miR-125b inhibit后,A20基因表达显著增加(6.98±0.18 vs 1.00±0.06,P<0.05),细胞增殖能力、NF-κB信号通路关键蛋白IK-Kα/β、IκBα、p65的表达显著下降(P均<0.05)。[结论]MiR-125b可通过靶向调控A20/NF-κB信号通路促进胰腺癌细胞的增殖。     

miR-138-5p通过靶向TCF3实现对胃癌细胞SGC-7901侵袭和迁移的调控

目的:探讨miR-138-5p 与T细胞因子3 基因（T cell factor 3, TCF3）的靶向关系及其对人胃癌细胞SGC-7901 侵袭和迁移能力的影响。方法：miR-138-5p 模拟物转染SGC-7901 细胞后,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-138-5p 和TCF3 mRNA的相对表达;生物信息学方法预测miR-138-5p 与TCF3 基因的靶向匹配关系,采用荧光素酶报告基因系统鉴定该关系。miR-138-5p 转染正常胃癌细胞和TCF3 高表达胃癌细胞后,Western blotting 检测TCF3、神经钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、锌指转录因子（Slug）和上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达,Transwell 小室检测胃癌细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力。结果：miR-138-5p 过表达抑制TCF3 mRNA的表达;生物信息学软件预测显示miR-138-5p 与TCF3 mRNA有靶向结合区域,miR-138-5p mimic 降低TCF3 野生型质粒的荧光素酶活性,不影响TCF3 突变型质粒的荧光素酶活性。miR-138-5p 抑制TCF3 蛋白表达,miR-138-5p 减弱TCF3 过表达对SGC-7901 细胞侵袭和迁移能力的促进作用,同时其下调N-cadherin、Vimentin 和Slug 蛋白表达、上调E-cadherin 蛋白表达。结论：miR-138-5p 抑制胃癌细胞SGC-7901 的侵袭和迁移,与直接靶向调控TCF3 的表达有关。     

miR-138靶向调控PDK1基因抑制人结肠癌SW620细胞侵袭

目的 探讨人结肠癌SW620细胞中miR-138和PDK1基因的表达,阐明miR-138对PDK1基因的靶向调控作用以及对SW620细胞侵袭性的影响。方法 培养SW620细胞并应用免疫荧光检测PDK1基因在细胞中的表达。采用生物信息学方法对miR-138和PDK1基因的靶向匹配关系进行预测并应用双荧光素酶报告基因系统鉴定。脂质体2000转染miR-138模拟物后,qRT-PCR检测miR-138和PDK1基因的表达,Western blot检测PDK1蛋白的表达,Transwell小室检测SW620细胞体外的侵袭性。结果 倒置相差显微镜下可见人结肠癌SW620细胞均匀分布,形态规则均一;细胞免疫荧光显示细胞内有PDK1蛋白的表达,显示红色荧光。靶基因预测软件miRanda和TargetScan显示miR-138和PDK1基因匹配良好,双荧光素酶报告基因系统鉴定发现miR-138能够结合PDK1 mRNA 3’UTR并有效抑制其表达。qRTPCR和Western blot检测结果表明过表达miR-138能够导致PDK1基因表达的下降。Transwell实验表明miR-138的过表达能够抑制SW620细胞的侵袭。结论 miR-138通过靶向作用于PDK1 mRNA 3’UTR能够负性调控PDK1基因的表达,并能够抑制人结肠癌SW620细胞的侵袭。     

miR-141-3p靶向TGF- β2 对人前列腺癌C4-2B 细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨miR-141-3p 与转化生长因子-β2(transforming growth factor β2, TGF-β2)基因的靶向关系及其对人前列腺癌细胞株C4-2B 恶性生物学行为的影响。方法：转染miR-141-3p mimic 后,qRT-PCR 检测C4-2B 细胞miR-141-3p 和TGF-β2mRNA的表达水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-141-3p 与TGF-β2 的靶向关系。miR-141-3p mimic 与TGF-β2 过表达载体单独或共转染C4-2B细胞后, Western blotting 检测转染C4-2B细胞中TGF-β2 蛋白的表达水平,Hoechst33258 染色检测细胞凋亡情况,Transwell 实验检测各组细胞的侵袭能力。结果：miR-141-3p mimic转染后,C4-2B细胞miR-141-3p 的相对表达水平明显提高、TGF-β2 mRNA的相对表达水平明显降低（均P<0.01）。miR-141-3p mimic 与野生型报告载体共转后,荧光素酶的活性显著降低（P<0.01）;miR-141-3p mimic 与突变型报告载体共转后,荧光素酶的活性没有明显变化（P>0.05）;miR-141-3p mimic 添加到pc-TGF-β2 转染的C4-2B细胞后,细胞增殖倍数明显降低、凋亡细胞数目显著增加、细胞侵袭能力显著降低（均P<0.01）。结论：miR-141-3p 与TGF-β2 存在靶向关系,且两者协同影响人前列腺癌C4-2B细胞增殖、侵袭能力并诱导其凋亡。     

miR-132在食管癌细胞系KYSE150 中对靶基因FOXA1的调控作用

 目的构建miR-132真核表达载体和融合靶基因FOXA1表达载体,在食管癌细胞KYSE150中验证miR-132对靶基因 FOXA1的调控作用。方法根据miR-132序列在基因组中的位置及其上下游序列,以EC9706细胞基因组DNA为模板,扩 增包含miR-132前体序列,克隆到pMD18-T Simple中,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后亚克隆到质粒pcDNA3.1(+)上;通过 Real-time PCR检测转染重组表达载体pcDNA3.1-miR-132的KYSE150成熟miR-132的表达水平。用生物信息学软件对 miR-132的靶基因进行预测,将候选靶基因FOXA1的3′UTR区融合到pMIR荧光素酶基因下游,通过双荧光素酶报告基 因检测分析miR-132对靶基因FOXA1的调控作用。将pCDNA3.1-miR-132表达质粒转染人食管癌细胞KYSE150,通过 Western blot检测miR-132对FOXA1蛋白表达的影响。结果成功构建了miR-132真核表达载体,Real-time PCR验证表 明pCDNA3.1-miR-132在KYSE150细胞中能够显著地过表达成熟miR-132。生物信息学预测FOXA1可能是miR-132的靶基 因。双荧光素酶报告基因分析表明miR-132能够作用于FOXA1的3′UTR。Western blot进一步证实miR-132能够抑制 内源性FOXA1蛋白的表达。结论FOXA1是miR-132直接调控的靶基因。     

miRNA-24下调S100A8蛋白表达能够抑制人喉鳞癌Hep2细胞侵袭

目的：探讨microRNA-24（miRNA-24）对喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous carcinoma,LSCC）Hep2细胞侵袭影响的分子机制。方法：应用miRanda和RNA22靶基因预测软件预测miR-24的靶基因及其结合位点,根据预测结果通过转染miR-24前体上调其在Hep2细胞中的表达,应用荧光定量PCR和Western blot分别检测miR-24过表达对S100钙结合蛋白A8（S100 calcium binding protein A8,S100A8）mRNA和蛋白表达变化的影响。S100A8抗体阻断方法,检测转染miR-24前体后Hep2细胞侵袭能力的变化。结果：S100A83＇非翻译区（3＇-untranslation region,3＇UTR）含有一个miR-24结合位点,而且该位点与大鼠的同源性高达95%;miR-24基因转染的Hep2细胞中miR-24的表达显著升高,S100 A8蛋白的表达显著降低,（P均〈0.05）,而S100A8 mRNA表达变化未见显著性差异,（P〉0.05）。与未阻断组相比,miR-24前体转染能明显降低阻断S100A8组的Hep2细胞侵袭能力,（P〈0.05）。结论：LSCC Hep2细胞中,miR-24可结合到S100A8基因的3＇UTR,在转录后水平上负性调控S100A8基因的表达,从而抑制Hep2细胞侵袭。     

miR-139通过下调CXCR4/CXCL12生物轴抑制乳腺癌定向转移的分子机制研究

摘 要：［目的］ 检测miR-139在乳腺癌细胞系及组织中的表达,验证CXCR4是否为miR-139直接调控的靶基因,并探究miR-139是否可通过靶向抑制CXCR4/CXCL12生物轴从而抑制乳腺癌细胞的定向转移。［方法］ 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）用于检测miR-139在34对转移性乳腺癌患者的原发灶、转移灶及癌旁组织中,在5株乳腺癌细胞系及1株正常乳腺上皮细胞中的表达。将包含miR-139的重组慢病毒质粒及其阴性对照空载体质粒vector分别以病毒/细胞数量=20的比例感染MDA-MB-231细胞,经2.0μg/ml嘌呤霉素筛选,成功构建稳定表达miR-139或vector的MDA-MB-231细胞,将MDA-MB-231vector和MDA-MB-231miR-139细胞分别经尾静脉注射到BALB/c裸鼠中,构建乳腺癌裸鼠转移模型,观察过表达miR-139对裸鼠体内转移能力的影响。TargetScan软件用于预测miR-139的靶基因,根据预测结果,将野生型或突变型CXCR4的3’-UTR区域克隆到荧光素酶报告基因的下游（CXCR4-wt或CXCR4-mut）并分别与miR-139 mimics或scramble共转染后检测荧光素酶的活性。qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-139 mimics和scramble后CXCR4、CXCL12的mRNA和蛋白表达。［结果］ miR-139在转移性乳腺癌原发灶和转移灶中的表达均低于癌旁组织,且转移灶中表达最低,miR-139在乳腺癌细胞系中的表达水平显著低于正常乳腺上皮细胞MCF-10A,且MDA-MB-231细胞中最低。尾静脉注射MDA-MB-231miR-139的裸鼠肺转移灶的个数均显著低于MDA-MB-231vector细胞。TargetScan软件预测CXCR4为miR-139直接调控的靶基因,CXCR4-wt+miR-139共转染组比CXCR4-wt+scramble共转染组的荧光素酶活性强度显著降低,CXCR4-mut+miR-139共转染组和CXCR4-wt+scramble共转染组间荧光素酶活性强度无显著性差异。转染miR-139后,CXCR4和CXCL12的mRNA和蛋白表达水平均显著下调,CXCR4/CXCL12生物轴下游的p-AKT和p-ERK蛋白表达水平也显著下调。［结论］ miR-139可通过靶向调控CXCR4/CXCL12生物轴而抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231定向转移。     

miR-106a下调MAP3K2抑制骨肉瘤细胞增殖的实验研究

目的:探讨miR-106a对骨肉瘤细胞增殖的影响及机制。方法:利用Real-time PCR比较了正常成骨细胞（hFOB11.9）及三种骨肉瘤细胞（MG-63、U-2OS和HOS）中miR-106a的表达情况;将NC（negative control)、miR-106a mimics及miR-106a inhibitor分别转染MG-63细胞;转染后通过CCK-8实验、平板克隆形成实验检测miR-106a对细胞增殖的影响;通过生物信息学软件预测miR-106a的靶基因-蛋白激酶2（MAP3K2）;分别构建MAP3K2 3'-UTR结合区野生型和突变型载体,通过荧光素酶报告基因实验检测miR-106a对MAP3K2的调控;在转染了NC以及miR-106a mimics的MG-63细胞中,利用Western blot检测MAP3K2的蛋白水平。结果:与正常成骨细胞相比,骨肉瘤细胞MG-63、U-2OS和HOS中miR-106a的表达明显降低（P＜0.05）;CCK-8生长曲线表明,转染48、72和96小时后,与NC相比,miR-106a mimics能够显著抑制MG-63细胞的生长（P＜0.05）,而miR-106a inhibitor则能促进肿瘤细胞的生长（P＜0.05）;平板克隆形成实验也表明miR-106a mimics能够抑制MG-63的生长,miR-106a inhibitor发挥相反作用;荧光素酶报告基因实验表明转染了克隆MAP3K2 3'-UTR的荧光素酶质粒组中,荧光素酶活性受到miR-106a mimics的明显抑制（P＜0.05）,而在MAP3K2 3'-UTR突变组中,荧光素酶活性与对照相比无显著差异（P=0.877）;与NC组相比,转染miR-106a mimics后,MAP3K2的表达明显降低（P＜0.05）。结论:miR-106a可能通过下调MAP3K2的表达抑制骨肉瘤细胞的生长。     

miR-22通过靶向MTDH抑制胶质瘤细胞的生长

背景与目的：miR-22在胃癌、肺癌、结肠癌以及乳腺癌中表达下调,然而其在胶质瘤中的表达情况尚未明确。本研究旨在探讨miR-22是否通过靶向调控MTDH表达抑制胶质瘤细胞生长,从而进一步揭示miR-22的抑瘤机制。方法：运用实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测75例胶质瘤及17例正常大脑组织中miR-22的表达改变以及与胶质瘤患者预后关系;构建MTDH 3’UTR-荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告检测观察miR-22对MTDH 3’UTR-荧光素酶活性的影响;将miR-22 mimics转染胶质瘤细胞U251,以MTDH siRNA为阳性对照,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测其对MTDH蛋白表达水平的影响;然后采用MTT法检测高表达miR-22对U251细胞生长的影响。结果：qRT-PCR检测结果显示,miR-22在75例胶质瘤组织中表达下调;Kaplan-Meier生存分析发现,miR-22表达越高,患者生存率越高(P<0.05);在双荧光素酶报告检测显示,miR-22能特异性地与MTDH 3’UTR结合,抑制其荧光素酶活性。Western blot检测结果显示,miR-22过表达或干扰MTDH可抑制MTDH蛋白的表达。MTT检测发现,miR-22过表达或干扰MTDH可抑制人U251细胞的生长,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：miR-22通过靶向调控MTDH的表达而抑制胶质瘤细胞的生长。