BDNF过表达的人脐带间充质干细胞源性多巴胺能样神经元的构建和鉴定

目的体外构建脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)过表达的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs)源性多巴胺能样神经元并鉴定。方法将P3代HUC-MSCs诱导分化为多巴胺能样神经元,采用免疫荧光检测其NeuN与β-tubulinⅢ的表达。构建BDNF过表达载体、空载体或BDNF siRNA并分别转染至诱导后的多巴胺能样神经元,细胞分为5组:HUC-MSCs组、多巴胺能样神经元组、多巴胺能样神经元+空载体组、多巴胺能样神经元+BDNF载体组和多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组。应用免疫荧光检测各组细胞中Nurr1和酪氨酸羟化酶(TH)共表达情况。结果 HUC-MSCs诱导分化后,NeuN较诱导前明显增加(P 0. 01),β-tubulinⅢ表达及Nurr1和TH共表达也较诱导前显著增加(P 0. 001)。转染后,多巴胺能样神经元+BDNF载体组的Nurr1和TH共表达高于HUC-MSCs组和多巴胺能样神经元+BDNFsiRNA组(P0.001),同时高于多巴胺能样神经元组及多巴胺能样神经元+空载体组(P 0. 01)。结论 HUC-MSCs在体外可诱导分化为多巴胺能样神经元,BDNF过表达能促进HUC-MSCs源性多巴胺能样神经元的分化和成熟。     

胚胎及成年大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化

目的对来源于胚胎和成体大鼠中脑的神经干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力进行比较研究。方法胚胎和成年大鼠神经干细胞分别培养于含有细胞因子IL-1、IL-11、GDNF、LIF的诱导分化液中,诱导分化6d后经流式细胞仪检测比较其分化的多巴胺能神经元的比率。结果免疫细胞化学染色均显示部分分化细胞呈TH染色阳性,流式细胞仪检测其诱导分化成多巴胺能神经元的比率分别为(17.8±4.2)%、(5.6±2.8)%,两者比较有显著性差异(P<0.01)。结论来源于不同发育阶段脑组织的神经干细胞其分化特性不同,胚胎大鼠神经干细胞较成年大鼠神经干细胞更易于向多巴胺能神经元分化。     

转化生长因子-β信号通路抑制剂对胚胎干细胞定向分化的影响

目的探讨转化生长因子(TGF)-β信号通路抑制剂在胚胎干细胞(ESCs)向神经分化过程中的作用。方法以单层贴壁方法诱导ESCs向神经干细胞(NSCs)分化。实验组加TGF-β抑制剂,对照组不加。9 d后进行免疫荧光染色和qRT-PCR,统计Nestin阳性细胞比例,并检测NSCs标志物Nestin表达量。对实验组和对照组来源的NSCs分别进行神经元诱导分化和多巴胺(DA)能神经元诱导分化。免疫荧光染色后进行细胞计数,统计各类阳性细胞(包括β-tubulinⅢ+和TH+/MAP2+阳性细胞)比例,qRT-PCR检测神经元早期标志物β-tubulinⅢ、成熟神经元标志物MAP2及DA能神经元标志物TH的表达情况。结果实验组ESCs能更多地分化为NSCs,并且分化为未成熟神经元及DA能神经元的比例显著高于对照组(P0.05)。结论 TGF-β信号通路抑制剂能促进ESCs定向分化。     

β-BME与BDNF联合RA体外诱导成人MSCs分化为神经元样细胞对比观察

目的 寻找体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的良好方法.方法 分别采用β-巯基乙醇(BME)、脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸(RA)为诱导剂,体外诱导人MSCs分化为神经元样细胞.用免疫组化SP法对诱导后细胞进行鉴定.结果 两种方法诱导6 h后,MSCs均呈现神经元样细胞改变,伸出突起,类似树突和轴突.该细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)均呈阳性表达,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)均呈阴性表达.其中β BME诱导6 h后神经元样细胞分化率为68.32%±2.58%,BDNF+RA诱导6 h后神经元样细胞分化率仅为42.45%±3.26%,两组比较,P＜0.05.但β BME诱导后分化细胞存活时间较短,而BDNF+RA诱导后分化细胞存活时间较长.结论 两种诱导方法均可在体外定向诱导人MSCs转化为神经元样细胞,神经元分化率及存活时间不同.     

脑源性神经营养因子诱导缺氧神经干细胞分化的作用研究

目的探讨脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)诱导经缺氧培养的大鼠胚胎大脑神经干细胞分化作用。方法将体外培养至第2代的神经干细胞分为3组:对照组(正常培养)、缺氧组(缺氧培养)和BDNF组(缺氧培养同时加入BDNF),分别培养36h后,改变培养条件令细胞分化24、48、72h,RT-PCR测定各组bcl-2、bax、nse、nne、gfap的mRNA水平,通过Western blot检测培养48h后的各基因表达。结果与缺氧组比较,BDNF组凋亡基因48hbcl-2表达明显增高,48、72hbax表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);分化基因在细胞分化24hnse、nne表达明显升高,gfap表达明显降低,48hnse表达明显升高,gfap明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论缺氧可引起神经干细胞向神经胶质细胞分化的增殖,BDNF具有诱导神经干细胞向神经元分化的功能。     

川芎嗪联合脑源性神经营养因子诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)、川芎嗪定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的潜能。方法分离并培养大鼠股骨的BMSCs,细胞分4组进行药物诱导,对照组、BDNF组、川芎嗪组及BDNF联合川芎嗪组。诱导过程中用倒置显微镜观察细胞的形态变化,并应用实时荧光定量PCR技术和免疫细胞化学方法鉴定诱导后细胞内巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)mRNA和蛋白表达量的变化。结果川芎嗪联合BDNF组诱导BMSCs向神经细胞分化的效率明显高于其他诱导组。结论川芎嗪联合BDNF可以明显提高BMSCs向神经细胞分化的效率和存活率。     

脑源性神经营养因子对谷氨酸损伤神经元保护作用的研究

目的观察低剂量、短时程谷氨酸损伤的致凋亡作用及脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)对此损伤的反应及保护作用。方法体外培养大鼠皮质神经元并建立低剂量短时程谷氨酸损伤模型;以重组腺病毒分别于损伤前、后转导外源性BDNF;用Western blot检测BDNF和Bcl-2的表达情况;用原位末端标记法(TUNEL)检测神经元凋亡的情况。结果损伤后神经元凋亡率由对照组的17.8%上升至59.6%;重组腺病毒于损伤前、后转导BDNF可分别使BDNF的表达量上升至对照组的2.29倍和1.54倍,Bcl-2的表达量上升至对照组的1.72倍和1.32倍,细胞凋亡率降至30.8%和43%。结论腺病毒转导的外源性BDNF可保护谷氨酸损伤神经元免于凋亡;内、外源性BDNF均可诱导Bcl-2表达增高,腺病毒转导的外源性BDNF可保护谷氨酸损伤神经元免于凋亡;内、外源性BDNF均可诱导Bcl-2表达增高。     

稳定表达分泌型脑源性神经营养因子的神经胶质细胞构建

目的制备可以持续表达和分泌脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor,BDNF)的神经胶质细胞,以此作为滋养层细胞培养体系,促进原代神经元接种的存活率。方法采用慢病毒介导的BDNF表达载体感染神经胶质细胞并进行连续传代,通过Western印迹和ELISA方法检测并获得稳定表达和分泌BDNF的滋养细胞层,将体外分离获得的原代神经元细胞接种于该细胞层,通过MAP2细胞免疫染色检测神经元的形态和存活数量。结果 BDNF过表达慢病毒感染神经胶质细胞后可以在培养基中稳定表达和分泌BDNF,以此为支持滋养细胞进行原代神经元的培养可以显著提高神经元的存活率。结论本实验成功构建了稳定表达和分泌BDNF的神经胶质细胞,该滋养细胞显著提高了原代神经元接种后的存活率,能够满足以高纯度和高密度原代神经元为细胞模型的神经药理学实验的需要。     

香丹注射液体外诱导大鼠MSCs分化为多巴胺能神经元效果观察

目的探讨香丹注射液体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）定向分化为多巴胺（DA）能神经元的效果。方法体外分离、扩增和鉴定大鼠骨髓MSCs。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导24h后香丹注射液诱导3h，采用免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白2（MAP2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、酪氨酸羟化酶（TH）、增殖细胞核抗原（PCNA）、Bcl-2表达。结果诱导后MSCs分化为具有典型神经元形态的细胞，NSE、MAP2和TH呈高表达，PCNA表达明显减弱。结论香丹注射液诱导大鼠MSCs分化为DA能神经元效果较好。     

三七总皂甙对神经干细胞诱导分化多巴胺能神经元移植帕金森病大鼠的影响研究

目的 探讨三七总皂甙对神经干细胞体外诱导分化多巴胺能神经元移植帕金森病(PD)大鼠后移植细胞的存活及移植疗效的影响.方法 大鼠胚胎中脑神经干细胞经传代扩增后,在分化液中诱导向多巴胺能神经元分化,应用6-羟基多巴胺制备的PD大鼠模型随机分为多巴胺能神经元组、多巴胺能神经元 三七总皂甙组、三七总皂甙组及手术对照组,每组8只,进行移植手术,移植后检测PD大鼠不对称旋转行为的变化及纹状体移植区酪氨酸羟化酶染色阳性细胞存活的情况.结果 与手术对照组比较,移植后20 d多巴胺能神经元组大鼠不对称旋转圈数开始明显下降(P＜0.01).移植后10～60 d,多巴胺能神经元 三七总皂甙组大鼠的不对称旋转圈数明显低于多巴胺能神经元组(P＜0.01).免疫组织化学染色显示多巴胺能神经元 三七总皂甙组大鼠纹状体移植区酪氨酸羟化酶染色阳性细胞数明显多于多巴胺能神经元组(P＜0.01).结论 三七总皂甙具有提高神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植PD大鼠后移植细胞的存活率及移植疗效的作用.     

天麻针灸结合对帕金森病鼠黑质Caspase-3表达及TH阳性神经元的影响

目的揭示天麻针灸结合防治帕金森病(PD)的作用机制。方法采用6-羟基多巴胺大鼠模型,利用免疫组化技术观察天麻针灸结合对黑质Caspase-3表达及酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的影响。结果与正常组比较,模型组PD大鼠黑质致密部(SNpc)的TH阳性神经元的数目减少了约45%;天麻治疗组其丢失程度较模型组明显减低约18%,针灸组和美多巴组分别减少约30%和13%。天麻针灸组减少34%,天麻组Caspase-3阳性神经元表达较模型组明显减少。各组Caspase-3阳性神经元的表达与TH阳性神经元的表达呈相反趋势。结论细胞凋亡可能是PD大鼠中脑多巴胺神经元丢失的主要方式。天麻针灸可通过调节Caspase-3减少细胞凋亡,其中,天麻针灸组有较好的作用。提示天麻针灸可保护多巴胺神经元。     

脑源性神经营养因子在肠道高敏感中的研究进展

内脏敏感性增高是肠易激综合征(IBS)重要的病理生理学机制之一。近年研究显示,脑源性神经营养因子(BDNF)过表达与IBS内脏高敏感密切相关。BDNF作为神经营养因子参与了神经元的存活、生长、发育、分化、再生过程。肠道组织中大量表达BDNF及其受体,对肠神经系统(ENS)的形成和功能具有调节作用,提示BDNF可能在肠道高敏感的发生机制中发挥重要作用。本文就BDNF在肠道高敏感中的研究进展作一综述。     

胰十二指肠同源框因子-1联合细胞因子诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β样细胞的研究

目的 探讨人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外诱导分化为胰岛β样细胞的方法.方法 用含胰十二指肠同源框因子-1基因(pancreatic and duodenal homeobox factor 1,PDX1)重组腺病毒(Adxsi-CMV-PDX1)感染人脐带MSCs,再联合多种细胞因子进行诱导分化.应用RT-PCR、免疫荧光染色法检测诱导后细胞的PDX1、胰岛素(insulin)、神经元素3(ngn3)、葡萄糖转运体2(glut2)、NK转录因子6.1(NKX6.1)mRNA的表达;化学发光法检测诱导后细胞培养上清中胰岛素和C肽的分泌量;流式细胞仪检测胰岛素阳性细胞率.结果 Adxsi-CMV-PDX1感染脐带MSCs并联合细胞因子诱导后,细胞从短梭形变成长梭形,并聚集形成胰岛样细胞团,经双硫腙染成亮红色.诱导17 d后的细胞表达PDX1、ngn3、NKX6.1、insulin、glut-2的mRNA;细胞胞质内有胰岛素和C肽;细胞培养上清中胰岛素和C肽含量分别为(473.1±51.5)mU/L和(1.61±0.41)ng/ml,用25 mmol/L高糖刺激1 h后,胰岛素和C肽分泌量高达(964.4±68.1)mU/L和(3.72±1.52)ng/ml;胰岛素阳性细胞率达(11.6±4.8)%.结论 PDX1转入脐带MSCs后,联合细胞因子在体外能够诱导其分化为胰岛β样细胞,胰岛素和C肽分泌水平较高,且对高糖刺激有反应,但还不是完全成熟的β细胞.     

脑源性神经营养因子对缺氧神经干细胞的保护作用

目的探讨脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)对缺氧培养条件下神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的增殖和分化的影响。方法利用MTT实验确定NSCs缺氧时间,时间范围为6、12、24、36和48 h;实验分为4组:对照组、损伤组、BDNF保护组、BDNF预保护组。对照组正常培养,其他组缺氧培养,测定各组MTT值(n=8)和乳酸脱氢酶含量(n=4);各组继续分化72 h后进行神经微管相关蛋白单抗、胶质纤维酸性蛋白多抗免疫荧光染色(n=4),计算分化率。结果由MTT法确定NSCs缺氧时间为36 h;BDNF保护组和BDNF预保护组MTT值和乳酸脱氢酶含量与损伤组比较,差异有显著性意义(P<0．01);BDNF的加入可提高NSCs分化为神经元的比率。结论BDNF对缺氧NSCs有保护作用。     

体外培养和诱导人脐带源间充质干细胞定向分化为心肌细胞的实验研究

目的探讨体外培养并应用5-氮胞苷（5-aza）诱导人脐带源间充质干细胞（hUC MSCs）是否能分化为心肌细胞。方法足月顺产或剖宫产患者的脐带在无菌条件下剪碎后采用贴壁培养法分离、纯化hUC MSCs,采用5-aza对P3代hUC MSCs进行诱导24 h后继续培养4周,采用倒置显微镜观察细胞形态学的变化,同时采用免疫组织化学方法测定肌钙蛋白I（cTnI）的表达。结果采用贴壁培养法可从脐带组织获得大量hUC MSCs。5-aza诱导4周后免疫组织化学鉴定cTnI表达阳性。结论人脐带贴壁培养可获得大量的hUC MSCs,hUC MSCs体外经5-aza诱导可定向分化为心肌细胞。     

盐酸美金刚干预对血管性痴呆大鼠海马脑源性神经营养因子的表达及氧化应激水平的影响

目的观察盐酸美金刚干预对血管性痴呆(VD)大鼠海马区脑源性神经营养因子(BDNF)表达以及氧化应激水平的影响。方法选取60只健康雄性Wistar大鼠为研究对象,随机分为模型组,对照组,观察组,每组各20只。模型组、观察组均采用持久双侧颈总动脉结扎方法制作血管性痴呆大鼠模型,对照组不做结扎处理,术后8 w模型组给予羟甲基纤维素钠干预,观察组给予盐酸美金刚干预,连续4 w后对各组大鼠进行水迷宫试验,然后处死,检测并比较3组大鼠脑海马区BDNF表达及氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平的差异,分析盐酸美金刚的干预效果。结果对照组水迷宫测试时间为(92.8±37.6)s,模型组为(154.6±38.7)s,观察组为(117.4±34.2)s,3组间差异具有统计学意义(P<0.05)。对照组大鼠海马区神经元细胞正常,模型组海马区神经元细胞数量降低,观察组海马区形态学变化介于对照组与模型组之间。经病理图像分析软件分析以及SOD、MDA的光密度(OD)值测定,3组大鼠海马区BDNF平均灰度值以及MDA、SOD表达水平有显著差异(P<0.05)。结论盐酸美金刚可清除海马区氧自由基,减轻组织损伤,并上调海马区BDNF的表达保护神经元细胞。     

葡萄籽原花青素对骨髓间充质干细胞诱导分化后神经元样细胞凋亡的影响

目的探讨葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSP)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导分化后神经元样细胞是否具有抗凋亡作用及作用的最适剂量。方法BMSCs由成年健康雄性WISTAR大鼠股骨全骨髓法取得,经贴壁培养法分离纯化,取第五代BMSCs用低中高剂量(20mg/L、40mg/L、80mg/L)GSP干预24h,设立空白对照组。以含有20%胎牛血清的1mmol/L B-巯基乙醇(BME)预诱导24h后,继而用含有40ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基作为诱导液诱导24h。采用免疫细胞化学法鉴定神经细胞特异性抗原标记神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)和微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein2,MAP-2)的表达。MTT法检测不同剂量的GSP干预24h后对神经元样细胞活力的影响,流式细胞仪检测以Fluo-3AM为荧光探针标记的细胞内游离钙浓度,以Annexin V凋亡试剂盒检测组间细胞凋亡率。结果成功分离培养WISTAR大鼠BMSCs,经诱导分化后大部BMSCs变成神经元样细胞并表达NSE和MAP-2。GSP干预组细胞生长状态,活力及存活细胞比例较好。结论GSP能使BMSCs诱导分化后神经元样细胞保持较好的活力,对抗自由基产生,减少细胞凋亡。     

美金刚对过氧化氢诱导多巴胺能神经元氧化应激损伤的保护作用

目的探讨美金刚对过氧化氢(H2O2)诱导的多巴胺能神经元氧化应激损伤的保护作用。方法用400μmol/L H2O2诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y损伤建立多巴胺能神经元氧化应激损伤模型,随机分为美金刚10、20、30μmol/L组和空白对照组,分别加入相应试剂(空白对照组加入等体积PBS);倒置显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞活性,比色法测定LDH释放率。结果 10、20、30μmol/L美金刚干预24 h后,SH-SY5Y细胞的吸光度值(A570)分别为0.936 5±0.033 2、0.974 9±0.030 0和0.948 7±0.033 6,空白对照组为0.924 7±0.039 8;组间比较无统计学差异(P=0.160)。经10、20、30μmol/L美金刚预处理2 h后,SH-SY5Y细胞的存活率分别为(59.92±3.64)%、(65.40±5.07)%和(62.63±5.01)%,与H2O2处理组比较有统计学差异(P<0.05或<0.01)。此外,10、20、30μmol/L美金刚预处理组SH-SY5Y细胞的LDH释放率分别为(38.70±7.88)%、(34.10±6.75)%、(35.58±8.68)%,与H2O2处理组比较均有统计学差异(P<0.05或<0.01)。结论美金刚对H2O2诱导的多巴胺能神经元氧化应激损伤具有保护作用。     

多效生长因子在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中的表达变化

目的探讨多效生长因子(PTN)在体外诱导成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化中过程不同时间的表达变化,了解多效生长因子是否参与BMSCs向神经元样细胞分化的机制。方法以密度梯度离心加贴壁培养法分离成人BMSCs,进行原代和传代培养,以流式细胞仪鉴定纯度。对照组和实验组对传代第6代的BMSCs进行诱导分化,诱导后30min至3d,观察细胞形态并计数。将分化后细胞采用免疫细胞化学法测定神经细胞特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。对诱导前和诱导后3h、6h、12h、24h、3d细胞以RT-PCR法测定PTN mRNA表达。结果 BMSCs在接种1d后黏附贴壁,呈椭圆形或圆形,3d~5d后呈梭状细胞成簇生长,7d~12d融合。传代至第5代~6代可见较为均一的成纤维细胞样形态。流式细胞仪检测结果显示:细胞表达CD44、CD105,不表达造血干细胞的特异标记CD45,证实其纯度。诱导后细胞胞体开始向细胞胞核收缩,出现双极或多极细胞。12h变形细胞增多,细长突起相互连接。24h后细胞变化不明显。诱导后细胞经免疫化学染色显示:多数表达NSE(64.79±0.06)%、MAP-2(60.05±0.09)%,而未检测到GFAP。实验组诱导后细胞不同时间点PTN mRNA的表达不同(P0.01)。诱导后12h~24hPTN mRNA表达最高。结论建立成人BMSCs培养增殖体系基础上诱导BMSCs向神经元样细胞分化,诱导过程细胞有外观形态变化,同时表达神经细胞特异性标志物NSE和MAP-2。诱导后BMSCs与形态改变相似,向神经元样细胞分化的不同时间点,有PTN mRNA表达变化,提示PTN可能参与BMSCs向神经元样细胞的分化。     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(hMSC)体外定向诱导可否分化为神经元样细胞。方法 Percoll分离液离心分离hMSC，体外扩增，采用两种方法：①含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24小时，甲氧酚(BHA)和二甲亚枫(DMSO)联合诱导6小时；②2-巯基乙醇(2-ME)预诱导24小时，BHA和DMSO诱导6小时。免疫组化检测神经元样细胞表达神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果 hMSC在体外扩增传至5代后，流式细胞仪显示hMSC表面抗原CD29、CD44、CD90表达阳性率分别为99．5％，97．8％，98．8％。采用两种方法诱导hMSC后，胞体收缩，突起伸出，较密的部分神经元拉成网状；免疫组化显示诱导的神经元样细胞能特异性表达NSE、NF，不表达GFAP。结论 成人骨髓hMSC在体外可以分化为神经元样细胞。