生长分化因子15对骨髓间充质干细胞增殖及基因表达的影响

目的探讨生长分化因子15(GDF15),对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的调控作用及其机制。方法分离、培养大鼠BMSCs,流式细胞术和免疫荧光染色鉴定BMSCs;CCK8检测不同浓度rh-GDF15对BMSCs增殖的影响,流式细胞周期检测不同浓度rh-GDF15对BMSCs细胞周期的影响;Realtime PCR检测不同浓度rh-GDF15对BMSCs中ALP、RunX2、COL-1、VEGF、b FGF和HIF-1α基因表达的影响。结果常氧条件下,GDF15可以在48 h内促进BMSCs的增殖,并上调VEGF的基因表达,且具有浓度相关性,50μg/L的rh-GDF15可以显著降低BMSCs的G1期,上调S期和G2期细胞比例,促增殖作用最显著。结论 GDF15可以在短时间内促进BMSCs的增殖和VEGF基因表达,其机制还需进一步探索。     

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目的探讨与胎鼠颅骨细胞共培养时,无机三氧化物聚合物(MTA)对其细胞周期及增殖的影响。方法研究于2012年1月至2013年1月在湖北省十堰市人民医院临床研究所进行。用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶混合多次消化获得原代胎鼠颅骨细胞,将细胞与MTA共培养(MTA组)4、7、14及21 d,细胞培养加入聚氯乙烯作为对照组。采用流式细胞仪(PI染色)及细胞增殖-毒性试剂盒法(CCK-8法)检测细胞周期中G0/G1、S和G2/M期的细胞数变化及细胞增殖情况。结果 G0/G1期第21天时MTA组细胞明显多于对照组(P<0.05);S期细胞数量在第4、14、21天时MTA组明显少于对照组(P<0.05);G2/M期细胞数量在第4、14天时MTA组明显多于对照组(P<0.05),在第7、21天时MTA组明显低于对照组(P<0.05)。细胞增殖指数(PI):MTA组在第4、7天时均略高于对照组,在第14天时开始降低,第21天时明显低于对照组(P<0.05)。CCK-8检测结果显示实验各组细胞均随培养时间延长而增殖,第14天达到峰值,后开始略有减弱。与对照组比较,MTA组在第4、7天细胞吸光度值略高,随着培养时间继续增加,MTA组吸光度值略低于对照组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论胎鼠颅骨细胞可以在MTA表面很好地增殖,并且MTA可能通过调节细胞周期来决定细胞的增殖能力,并在7 d后降低细胞增殖速度,这可能对细胞的成骨分化存在一定推动作用。     

小干扰RNA沉默Dicer酶对人舌鳞癌细胞Tca-8113的增殖和细胞周期的影响

目的研究沉默Dicer酶的表达对人舌鳞癌细胞Tea-8113的增殖和细胞周期的影响。方法实验组转染靶向Dicer酶的siRNA序列；时照组转染尤义序列siRNA；空白组细胞未做转染？采用RNA于扰技术沉默Tea-8113中Dicer酶的表达，通过荧光定量聚合酶链反应、蛋白质印迹法及免疫组织化学技术，检测Tea-8113转染小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）后Dicer酶的mRNA和蛋白质水平的表达情况；应用噻唑蓝比色法及流式细胞术榆测细胞增殖及细胞周期的变化。结果Tea-8113细胞转染siRNA24h后，实验组Dicer酶mRNA表达量是空白组的0．39倍．表达水平下降，实验组与空白组或对照组比较，表达水平都有所下降，差异有统计学意义（P〈0．05）、转染48h后实验组蛋白质表达较空白组下调53．67％。Dicer酶表达下凋后，Tca-8113细胞增殖加速，G1期细胞百分率减少，S期和G2期细胞百分率增多。结论沉默Dicer酶的表达可加快细胞周期从G1期向S期和G2期进展．促进Tea-8113细胞的生长。     

丁酸钠对人口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖及p27Kip1蛋白表达的影响

目的 通过观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对人口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞的增殖影响及p27Kip1蛋白表达改变,探讨丁酸钠调控人口腔癌细胞增殖的分子机制.方法 人口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞经不同浓度丁酸钠[0 mmol/L(空白对照组),2、4、6、8 mmol/L(4个实验组)]作用后,甲基噻唑基四唑(MTT)法观察细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期分布,免疫组化检测p27Kip1蛋白的表达.结果 丁酸钠能够呈时间剂量依赖性抑制Tca8113细胞的增殖,丁酸钠处理后的Tca8113细胞出现了凋亡形态变化;细胞周期阻滞于G0～G1期,丁酸钠2 mmol/L组G0～G1期达(63.2±2.4)%,4 mmol/L组G0～G1期达(77.2±3.8)%,空白对照组G0～G1期达(48.1±2.4)%,P＜0.05;p27Kip1蛋白表达水平明显上调.结论 丁酸钠能够抑制人口腔癌细胞的增殖,该作用可能与p27KiP1蛋白表达上调及G0～G1期细胞周期阻滞有关.     

无机三氧化物聚合物对胎鼠颅骨细胞细胞周期及增殖影响研究

目的    探讨与胎鼠颅骨细胞共培养时,无机三氧化物聚合物（MTA）对其细胞周期及增殖的影响。方法          研究于2012年1月至2013年1月在湖北省十堰市人民医院临床研究所进行。用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶混合多次消化获得原代胎鼠颅骨细胞,将细胞与MTA共培养（MTA组）4、7、14及21 d,细胞培养加入聚氯乙烯作为对照组。采用流式细胞仪（PI染色）及细胞增殖-毒性试剂盒法（CCK-8法）检测细胞周期中G0/G1、S和G2/M期的细胞数变化及细胞增殖情况。结果    G0/G1期第21天时MTA组细胞明显多于对照组（P＜0.05）;S期细胞数量在第4、14、21天时MTA组明显少于对照组（P＜0.05）;G2/M期细胞数量在第4、14天时MTA组明显多于对照组（P＜0.05）,在第7、21天时MTA组明显低于对照组（P＜0.05）。细胞增殖指数（PI）：MTA组在第4、7天时均略高于对照组,在第14天时开始降低,第21天时明显低于对照组（P＜0.05）。CCK-8检测结果显示实验各组细胞均随培养时间延长而增殖,第14天达到峰值,后开始略有减弱。与对照组比较,MTA组在第4、7天细胞吸光度值略高,随着培养时间继续增加,MTA组吸光度值略低于对照组,但差异均无统计学意义（P ＞0.05）。结论    胎鼠颅骨细胞可以在MTA表面很好地增殖,并且MTA可能通过调节细胞周期来决定细胞的增殖能力,并在7 d后降低细胞增殖速度,这可能对细胞的成骨分化存在一定推动作用。     

Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞增殖能力的影响

目的: 初步研究Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖能力的影响。方法: 采用体外贴壁式培养法培养人牙髓干细胞,应用Rho激酶抑制剂Y-27632,根据培养条件,分为普通培养液培养组(Con)及普通培养液+抑制剂Y-27632培养组(Con+Y),采用MTT法检测两种培养条件下人牙髓干细胞培养24、48、72、96 h细胞活性;采用DAPI染色法及流式细胞定量检测技术(FCM)比较两组在培养48 h的细胞数量及细胞周期分布情况。结果: MTT结果显示,实验组hDPSCs细胞增殖曲线较对照组明显上移,且增殖高峰期提前;培养48 h,DAPI染色结果显示,实验组细胞总数量明显多于对照组;FCM结果显示,对照组G₀/G₁期细胞比例为(66.8±6.84)%,S期细胞比例为(25.17±0.62)%,实验组G0/G1期细胞比例为(58.59±1.76)%,S期细胞比例为(31.34±1.16)%,实验组S期细胞比例明显高于对照组(P<0.05)。 结论: Rho激酶抑制剂Y-27632促进人牙髓干细胞DNA合成、细胞分裂及增殖。     

Ⅰ型跨膜蛋白α亚型缺失突变体对人牙周膜成纤维细胞周期的影响

目的 研究内质网信号通路Ⅰ型跨膜蛋白α亚型（IRE1α）缺失突变体对人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）细胞周期的影响。方法 在成功构建人IRE1α基因全长重组质粒的基础上,采用重叠聚合酶链反应构建其两个主要功能域Kinase和Rnase的缺失突变体（pD-Kinase、pD-Rnase）;然后分别染入hPDLFs细胞,Western blot检测重组基因表达情况,流式细胞仪（FCM）检测转染后hPDLFs细胞的细胞周期变化。结果 酶切及测序结果证实构建的IRE1α缺失突变体重组质粒构建成功;Western blot分析结果显示,3种重组基因均能正确表达;FCM结果分析显示：与衣霉素（TM）组相比,IRE1α实验组hPDLFs细胞S期比例增加而G1期减少（P<0.05）;D-Rnase突变体组hPDLFs细胞S期比例减少而G1期增加（P<0.05）;D-Kinase突变体组对hPDLFS细胞的增殖和各周期分布影响则无显著差异（P>0.05）。结论 在内质网应激状态下,IRE1α可促进hPDLFs细胞从G1期进入S期,D-Rnase突变体导致hPDLFs细胞生长阻滞于G1期,而D-Kinase则对hPDLFS细胞周期分布无明显影响。     

白色念珠菌对口腔上皮细胞细胞周期的影响

目的:研究白色念珠菌对口腔上皮细胞增殖及细胞周期的影响。从另一种角度证明白色念珠菌感染与癌发展的关系。方法:在培养的口腔上皮细胞(KB细胞)中,加入菌丝相、孢子相的白色念珠菌,共同培养48h,采用流式细胞仪观察白色念珠菌对KB细胞增殖及细胞周期的影响。结果:与对照组相比,菌丝组G0/G1期细胞所占比例降低,S期、G2/M期所占百分比显著升高,反映细胞增殖活力的增殖指数PI增高,差异有显著性(P<0.05)。而孢子组的KB细胞PI值与对照组相比无明显变化,P>0.05。结论:白色念珠菌可引起KB细胞细胞周期的改变;白色念珠菌对KB细胞周期的改变有赖于该菌的毒性及对细胞的感染。     

沉默N-cadherin对人牙髓干细胞增殖和迁移能力的影响

目的探讨沉默N-cadherin对人牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）增殖和迁移能力的影响,为基于DPSCs的牙髓再生提供实验依据。方法采用N-cadherin sh RNA慢病毒转染DPSCs,q RT-PCR、Western blot检测N-cadherin的表达水平,验证沉默效率。实验分为阴性对照组（sh RNA-NC）和N-cadherin sh RNA沉默组。采用CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况,Transwell法检测细胞迁移能力。结果N-cadherin sh RNA可显著降低DPSCs的N-cadherin m RNA和蛋白的表达水平（P<0.001）。N-cadherin sh RNA组细胞增殖活性分别在细胞接种的第3、4天高于sh RNA-NC组,第6～8天低于sh RNA-NC组,差异均具有统计学意义（P<0.05）;在第3天时,N-cadherin sh RNA组处于S期和G2期的细胞比例大于sh RNA-NC组（P<0.05）;在第6天时,N-cadherin sh RNA...     

铸造钴铬合金含银抗菌涂层表面性能及体外细胞毒性研究

目的 检测钴铬合金含银抗菌涂层的表面性能及细胞毒性,为其临床应用提供依据.方法 于钴铬合金表面应用等离子喷涂技术制备含银抗菌涂层(涂层组),通过扫描电镜、能谱分析及X射线衍射分析表面性能.以常规铸造的钴铬合金试件为合金对照组,利用甲基噻唑基四唑法测试涂层组合金浸提液(分为25％、50％、75％和100％亚组)和合金对照组浸提液以及阴性对照组(新鲜培养液)对小鼠成纤维细胞L929增殖的影响(培养1、2、3d);用流式细胞术测试阴性对照组、涂层组和合金对照组培养48 h后L929细胞周期的差异.结果 涂层表面均匀致密,与基底材料未见明显间隙,表层主要物相为Ag、Cr和少量的Ag2O、Cr2O3.细胞培养1、2、3d后,阴性对照组、各涂层亚组和合金对照组A值差异无统计学意义(P＞0.05);阴性对照组各时间点毒性评级均为0级,各涂层亚组和合金对照组各时间点毒性评级均为1级.涂层组G2期细胞周期比例为(8.23±0.39)％,合金对照组G2期细胞周期比例为(8.70±0.46)％,两组间差异无统计学意义(P＞0.05),显著低于阴性对照组[(24.15±0.71)％].结论 钴铬合金含银涂层结构稳定,与临床常用钴铬合金相比,对L929细胞的增殖及细胞周期影响无明显差异,细胞相容性良好.     

牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响

目的：研究牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响,并初步探讨其机制。方法：从人牙髓中提取,培养牙髓干细胞,与皮肤成纤维细胞分组共培养,分为3组：对照组（单纯皮肤成纤维细胞培养）、条件培养基组（利用牙髓干细胞条件培养基培养成纤维细胞）、直接共培养组（采用Transwell共培养小室）。共培养后,进行 β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色,检测成纤维细胞的衰老情况;利用 CCK-8 法检测各组成纤维细胞的活性;流式细胞仪分析成纤维细胞的细胞周期变化;采用RT-PCR和 Western免疫印迹检测各组成纤维细胞衰老相关蛋白 p21、p53以及pRb 的mRNA和蛋白表达水平。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果：与空白组相比,后2组的皮肤成纤维细胞表达β半乳糖苷酶降低、增殖能力增强、G1期细胞减少而S期和G2期增多, p53、p21 mRNA和蛋白表达水平降低而PRb表达升高。结论：牙髓干细胞及其条件培养基具有抗皮肤成纤维细胞衰老的作用,为牙髓干细胞在抗皮肤衰老方面的临床应用提供了依据。     

干扰细胞信号转导抑制因子1表达对人口腔癌细胞生物学功能的影响

目的：研究细胞信号转导抑制因子1（SOCS1）基因对人口腔癌细胞增殖、周期及体外侵袭生物学功能的影响。方法：Western blotting及实时定量PCR验证人口腔癌细胞系KB中基因SOCS1的干扰效果;MTT法检测细胞增殖;应用Transwell侵袭小室模型观察口腔癌细胞的侵袭能力;流式细胞术分析细胞周期的分布情况。结果：SOCS1干扰片段显著降低口腔癌KB细胞SOCS1基因的mRNA及蛋白表达水平。抑制SOCS1表达后,细胞体外侵袭能力明显下降（P<0.05）,且转染72 h后KB细胞数量较对照组显著减少（P<0.05）;干扰KB细胞SOCS1基因表达,使G0/G1期细胞数目明显多于对照组（P<0.05）,而S、G2/M期细胞数目显著少于对照组（均P<0.05）。结论：干扰人口腔癌细胞株KB中的SOCS1基因表达后,KB细胞增殖、体外侵袭能力减弱,细胞分裂受到抑制。     

富血小板血浆对人成骨样细胞MG63增殖能力的影响

目的研究富血小板血浆（PRP）对人成骨样细胞MG63增殖能力的影响,探讨PRP的生物学功能。方法采集健康志愿者的静脉血,两次离心法制备PRP,氯化钙加人凝血酶激活后离心提取PRP萃取液。碱性磷酸酶（ALP）染色检测不同体积分数PRP（0、1%、2%、3%）对MG63分化活性的影响,碘化丙啶（PI）荧光染色观察PRP作用下MG63细胞形态的变化,免疫细胞化学检测PRP对MG63表达转化生长因子-β（TGF-β）的影响,扫描电子显微镜（SEM）观察PRP对MG63在人工骨材料表面生长情况的影响,CCK-8法检测PRP对MG63增殖活性的影响,流式细胞术（FCM）检测经PRP培养后不同时间MG63的细胞周期,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测PRP作用下MG63中Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）mRNA的表达量。结果ALP检测见3%PRP组ALP阳性细胞染色最深,并随体积分数的增加染色强度增加,且PRP组细胞均出现不同程度的脱片现象。PI荧光染色见PRP组细胞核荧光染色较对照组增强。免疫细胞化学检测见3%PRP组TGF-β表达量最高（P＜0.05）。SEM观察：PRP组材料表面MG63密集,生长状态良好。CCK-8法测定细胞增殖活性,显示4.8%PRP组吸光度A450 nm值高于对照组（P＜0.05）。FCM检测表明：PRP组第2天S期细胞百分比高于对照组（P＜0.05）;第10天PRP组G0/G1期细胞百分比高于对照组（P＜0.05）;除第6天外,PRP组G2/M期细胞百分比均高于对照组。RT-PCR结果表明：PRP组MG63的Col-ⅠmRNA表达量较对照组明显上调。结论适宜体积分数的PRP对MG63的增殖、迁移和相关蛋白、基因的表达有促进作用,PRP具有统一、协调细胞生物学行为的作用。     

ClC chloride channels in tooth germ and odontoblast-like MDPC-23 cells

OBJECTIVE: To detect expression of ClC chloride channel mRNA in tooth germ and odontoblasts, and explore the affect of chloride channel function on cell proliferation and cell cycle. DESIGN: We extracted total RNA of tooth germ from newborn C57BL mice and mouse odontoblast-like cells (MDPC-23), then detected mRNA expression of chloride channel genes Clcn1-7 with RT-PCR. We used chloride channel blocker 5-nitro-2-(3- phenylpropylamino)benzoic acid (NPPB) to interfere with chloride channel function of MDPC-23 cells. Cell proliferation rate and cell cycle were detected with MTT assay and flow cytometry, respectively. Student's t-test was used to determine statistical significance between control and treatment groups. RESULTS: The mRNA of Clcn1-7 chloride channel genes was expressed in tooth germ of newborn mice. Clcn3, Clcn5 and Clcn7 mRNAs were expressed in MDPC-23 cells. NPPB slowed down the proliferation rate of MDPC-23 cells from day 2 to day 4 (P<0.01), and also changed the proportion of cell cycle phase. Comparing to the control, the proportion of G2/M phase cells reduced from 3.93+/-2.62% to 0.54+/-0.25% (P<0.05). The ratio of G1/G2 increased from 1.86+/-0.01 to 1.95+/-0.02 (P<0.05). CONCLUSIONS: There is abundant chloride channel gene expression in tooth germ. Some of these chloride channels may regulate tooth development through effects on cell proliferation and cell cycle signal pathway.     

bFGF重组慢病毒对羊骨髓间充质干细胞成骨功能影响的研究

目的:探讨碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)基因转染对体外培养的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells, BMSCs)的增殖和骨向分化的影响,为构建组织工程骨的种子细胞做理论依据。方法:构建携带人bFGF基因的慢病毒载体,转染诱导后羊的BMSCs,得到bFGF转染组,选择未转染的BMSCs为对照组。两组细胞采用实时定量PCR技术和蛋白质印迹法技术检测Collagen-Ⅰ、OC、OPN等成骨相关基因的mRNA水平及蛋白水平相对表达量的变化情况。结果:bFGF组OPN和Collagen-Ⅰ基因mRNA水平表达量较对照组增高,差异有统计学意义(P<0.05),两组细胞在OC基因mRNA水平表达量上差异无统计学意义;bFGF组细胞在OPN、OC和Collagen-Ⅰ基因蛋白水平上表达量均高于对照组,且差异有统计学意义。结论:bFGF基因转染能增强羊BMSCs增殖和骨向分化的能力,可作为组织工程骨的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞对关节盘细胞的作用研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）对颞下颌关节盘软骨细胞的作用。方法大鼠骨髓来源的间充质干细胞三向分化鉴定其干性,大鼠关节盘软骨细胞Ⅱ型胶原免疫荧光染色,收取BMSC培养24h上清液制作条件培养基。CCK-8检测条件培养基对关节盘软骨细胞细胞增殖影响,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析条件培养基培养7、14d关节盘软骨Ⅰ、Ⅱ、X型胶原基因表达。两组比较采用独立样本t检验,进行统计学分析。结果获取的大鼠BMSC具备三向分化能力．大鼠关节盘软骨细胞Ⅱ型胶原免疫荧光表达。CCK-8结果显示,培养48h后条件培养基组细胞增殖速度明显加快,差异具有统计学意义（t=10．75,P〈0．05）;RT-PCR结果显示：条件培养基组7d时抑制X型胶原表达（t=2．586,P〈0．05）,14d时促进Ⅱ型胶原表达（t=6．501,P〈0．05）。结论大鼠BMSC分泌物促进关节盘软骨细胞增殖,抑制关节盘软骨细胞肥大发挥保护作用。     

人舌鳞癌细胞SOCS1基因沉默对细胞增殖和化疗药物敏感性的影响

目的:在人舌鳞癌细胞中观察细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)沉默对细胞增殖及化疗药物敏感性的影响,探讨SOCS1作为舌鳞癌治疗靶点的研究。方法:western blot、PCR及定量PCR验证SOCS1干扰序列沉默人舌鳞癌细胞系CAL27中SOCS1的表达; MTT法检测舌鳞癌细胞对化疗药物敏感性的变化;细胞计数的方法观察细胞的增殖速度;采用流式细胞术的方法检测细胞周期的变化。结果:将SOCS1干扰序列转染CAL27细胞后,SOCS1 mRNA及蛋白表达水平均明显下降。沉默SOCS1表达后,化疗药物卡铂和紫杉醇对CAL27细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)均显著降低(P<0.01);转染72 h后CAL27细胞数量较对照组显著减少(P<0.05);SOCS1表达抑制后CAL27细胞G0/G1期细胞比例明显升高,而S期和G2/M期细胞比例明显减小,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:SOCS1表达抑制后,人舌鳞癌细胞株CAL27的增殖能力下降,并且对化疗药物的敏感性增强。     

高糖对人骨髓间充质干细胞成骨能力影响的体外研究

目的:体外模拟糖尿病病人高血糖状态,观察高糖对人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)成骨能力的影响。方法 :将使用不同含糖量培养液体外培养的hMSCs分为5.5mmol/L生理糖浓度组、25mmol/L高糖组、44 mmol/L高糖组。CCK-8试剂盒检测各组hMSCs的增殖速度;骨诱导7、14、21 d时分别观察高糖对hMSCs骨向分化相关基因骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、Runx相关因子2(Runx-2)的表达,碱性磷酸酶(ALP)活性,钙沉积量的影响。结果:两个高糖组相对生理糖组,有抑制hMSCs的增殖能力(P<0.05),且抑制ALP活性及细胞外钙基质沉积,下调了骨向分化相关基因OCN、OPN、Runx-2表达水平(P<0.01),该抑制作用随糖的浓度升高而加强。结论:高糖显著抑制了hMSCs生物矿化过程,并以浓度依赖的方式降低hMSCs的增殖及成骨能力。