2-甲氧基雌二醇诱导骨髓瘤细胞分化的分子机制研究

目的研究2-甲氧基雌二醇（2ME2）诱导骨髓瘤细胞系分化的分子机制方法应用细胞形态学方法、流式细胞术分析、ELISA法和RT-PCR疗法，观察2ME2对于骨髓瘤细胞系LP-1、CZ-1、NCI-H929细胞分化的影响，同时检测细胞分化时X盒结合蛋白1（XBP-1）mRNA的改变情况。继而采用XBP-1、Blimp-1、pax-5硫代反义寡核苷酸（ASODN）作为干预手段，观察其对于2ME2诱导骨髓瘤细胞系分化作用的影响及mRNA水平的变化。结果2ME2可诱导骨髓瘤细胞系LP-1、CZ-1、NCI-H929细胞向成熟阶段分化，伴随着细胞分化的过程XBP-1 mRNA的表达水平上调。XBP-1 ASODN和Blimp-1 ASODN可以部分抑制2ME2促骨髓瘤细胞系分化作用，而pax-5 ASODN可以加强2ME2促骨髓瘤细胞系分化作用。经pax-5 ASODN作用72h，经形态学观察，细胞向成熟阶段分化，表现为细胞胞核缩小，胞浆丰富，核浆比例下降，核仁减少或消失，核染色质变粗、变密；细胞表面标志CD49e表达率增高；同时细胞分泌轻链蛋白升高经Blimp-1 ASODN作用72h后，pax-5 mRNA水平显著升高；而XBP-1 mRNA水平下降。结论2ME2可诱导骨髓瘤细胞系LP-1、CZ-1、NCI-H929细胞向成熟阶段分化，伴随着细胞的分化XBP-1 mRNA的表达水平上调，Blimp-1可通过抑制pax-5 mRNA的表达上调XBP-1 mRNA的表达水平，促进骨髓瘤细胞分化。     

多发性骨髓瘤黏蛋白-1基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

本研究旨在构建多发性骨髓瘤黏蛋白1（两串联）基因（rnuc1-2vntr）的真核表达载体及该重组体在COS-7细胞中的表达,为研制多发性骨髓瘤基因疫苗奠定基础。以MUC1—2VNTR蛋白的编码基因作为目的基因,在其前端加上KOZAK序列后,两端分别加上HindⅢ和XbaⅠ酶的酶切位点,将人工合成的全基因定向插入pcDNA3．1／myc—his B载体中,转化E-coli感受态细胞获得重组菌株,经酶切及测序鉴定为pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒后,采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS-7细胞,用荧光显微镜对荧光表达进行观察,然后用Western blot检测重纽体在细胞内外的表达。结果表明：合成的MUC1-2VNTR基因全长约140bp,所构建的pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒经双酶切及测序鉴定后,与预期片段大小相符,并含有完整的阅读框架和目的基因。将其转入COS-7细胞后48小时,荧光显微镜和Western blot检测均可证实黏蛋白1表达。结论：成功的构建了多发性骨髓瘤真核表达载体pcDNA3．1—2vntr／myc—hisB,并在COS-7细胞中成功地表达黏蛋白1,这为黏蛋白1的功能研究和多发性骨髓瘤基因疫苗的研制提供了实验基础。     

骨髓瘤细胞分化过程中转录因子Blimp-1对c-myc基因表达的调控

目的探讨2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）诱导骨髓瘤细胞分化过程中转录因子Blimp—1对c—myc基因表达的调控作用。方法用0．5μmol／L 2ME2处理骨髓瘤细胞系CZ-1和LP-1细胞72h，以诱导转录因子Blimp—1表达上调，用RT—PCR和Westernblot检测c—myc基因mRNA及蛋白的表达情况；另用0．5μmol／L2ME2＋Blimp—1反义寡核苷酸（ASODN）处理CZ—1和LP-1细胞72h，采用细胞形态学、流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD49e的表达，ELISA法检测细胞分泌免疫球蛋白的水平，观察Blimp-1 ASODN对细胞分化作用的影响，同时采用RT—PCR和Western blot检测c—myc基因mRNA及蛋白的表达情况。结果当两种骨髓瘤细胞系采用2ME2处理72h后Blimp—1的表达均上调，c—myc基因mRNA及其蛋白的表达下调；而当Blimp—1表达受到ASODN封闭未出现上调时，细胞分化过程受到抑制，骨髓瘤细胞未出现成熟浆细胞的形态，细胞表面分化抗原CD49e的表达以及细胞分泌的免疫球蛋白水平与对照组相比，差异无统计学意义，此时c—myc基因mRNA及其蛋白的表达水平也未出现下调。结论2ME2诱导骨髓瘤细胞分化的信号转导通路中，转录因子Blimp—1抑制c—myc基因mRNA及其蛋白的表达。     

多发性骨髓瘤患者胸腔积液检出骨髓瘤细胞1例

患者,男,57岁.因近1个月感头晕、乏力、气短不能平卧,伴右侧胸背部疼痛明显,于2001年10月22日入院.实验室检查:血Hb 42 g/L,RBC 1.2×1012/L,WBC 4.3×109/L.     

多发性骨髓瘤细胞粘附分子的表达及意义

多发性骨髓瘤(MM)的恶性浆细胞表达一系列细胞粘附分子,使恶性浆细胞或浆细胞的前体细胞选择性地粘附并归巢于骨髓基质,并产生一系列细胞因子。这些骨髓基质细胞及细胞因子,促进恶性浆细胞增殖,并使恶性浆细胞具有不朽性,在MM的发生及发展中起重要作用。     

巨噬细胞炎症蛋白1α对多发性骨髓瘤细胞增殖与迁移能力的影响

我们通过检测多发性骨髓瘤（MM）患骨髓及KM3细胞培养上清液中巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP-1α）水平，体外运用细胞培养技术分析瘤细胞在MIP-1α作用下的增殖、迁移作用，从而探讨MIP-1α对瘤细胞增殖与迁移能力的影响。     

非典型多发性骨髓瘤实验室诊断1例

病例介绍 　　患者女,52岁,主因“发热、头晕、头痛4天“入院.入院体查:T 38.6℃,BP110/70mmHg,P88次/分,神志清,精神差,重度贫血貌,双肺呼吸音粗,自觉因感冒受凉后出现发冷发热,自发性咳嗽,气短,时有剑下疼痛,体温最高达39.8℃.……     

多发性骨髓瘤脑膜浸润1例报道

多发性骨髓瘤髓外浸润多见于肝、脾、淋巴结及其他网状内皮组织,亦见于肾、肺、心、甲状腺、睾丸、卵巢、消化道、子宫、肾上腺及皮下组织,临床上脑膜浸润罕见,而经脑脊液细胞学检查诊断多发性骨髓瘤未见报道。我们通过脑脊液细胞学检查发现骨髓瘤细胞,以此诊断了脑膜浸润型多发性骨髓瘤,现将有关临床特征及实验室检查情况报道如下。     

多发性骨髓瘤细胞粘附分子的表达及意义

多发性骨髓瘤（ＭＭ）的恶性浆细胞表达一系列细胞粘附分子,使恶性浆细胞或浆细胞的前体细胞选择性粘附并归巢于骨髓基质,并产生一系列细胞因子,这些骨髓基质细胞及细胞因子,促进恶性浆细胞增殖,并使恶性浆细胞具有不朽性,在ＭＭ的发生及发展中起重要作用。     

不同化疗方案对多发性骨髓瘤患者血清sICAM-1、sVCAM-1、Treg及预后的影响

目的分析PCD(硼替佐米+环磷酰胺+地塞米松)、VAD(长春新碱+多柔比星+地塞米松)化疗方案对多发性骨髓瘤(multople myeloma, MM)患者血清可溶性内皮细胞间黏附因子1(sICAM-1)、血管细胞黏附因子1(sVCAM-1)、调节性T细胞(Treg)及预后的影响。方法将我院2012年1月—2014年12月收治的90例MM患者按化疗方案的不同分为PCD组(n=41)和VAD组(n=49),均给予4周期化疗。化疗结束后比较两组临床疗效,治疗前后sICAM-1、sVCAM-1及Treg变化情况,治疗期间不良反应发生率,以及两组预后情况。结果治疗后PCD组临床疗效优于VAD组,差异有统计学意义(P0.05);治疗后,两组血清sICAM-1、sVCAM-1、Treg比例均下降,且PCD组上述指标下降更显著,差异均有统计学意义(P0.05或P0.01);两组治疗期间不良反应发生率比较差异无统计学意义(P0.05);PCD组总生存率、疾病无进展生存率均显著高于VAD组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论较VAD方案,PCD方案对MM患者血清sICAM-1、sVCAM-1、Treg的抑制作用更显著,并可进一步提升患者完全缓解率,延长生存期。     

2-甲氧基雌二醇对原代骨髓瘤细胞分化的作用

本研究观察2-甲氧基雌二醇对多发性骨髓瘤患者原代细胞诱导的分化作用。采用CD138+磁珠分离纯化7例骨髓瘤患者原代骨髓瘤细胞,通过形态观察、细胞表面标志分析和细胞分泌轻链蛋白的情况,观察2-甲氧基雌二醇对多发性骨髓瘤原代骨髓瘤细胞分化的影响。结果表明:患者原代骨髓瘤细胞经0.5μmol/L2-甲氧基雌二醇分别作用36及72小时后,细胞形态向成熟阶段发展,表现为细胞胞核缩小,胞浆丰富,核浆比例下降,核仁减少或消失,核染色质变粗、变密。CD49e阳性细胞率由(11.02±1.75)%(DMSO对照组)增加到(23.80±1.62)%(36小时组)及(35.68±1.85)%(72小时组),差异具有统计学意义(P<0.05);细胞分泌轻链蛋白由(225.7±30.4)ng/ml(DMSO对照组)升高到(296.7±18.8)ng/ml(36小时组)及(378.9±15.8)ng/ml(72小时组),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:较低浓度2-甲氧基雌二醇可诱导骨髓瘤患者原代骨髓瘤细胞向成熟阶段分化。     

沉默DNMT1基因对骨髓瘤细胞SOCS-1基因甲基化的影响

目的:探讨DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase,DNMT1)基因沉默对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞内细胞因子信号转导抑制分子1(suppressor of cytokine signaling,SOCS-1)甲基化的影响。方法:应用靶向沉默DNMT1基因的短发卡RNA(RNA-Short hairpin RNA,shRNA)通过脂质体(lipofectamineTM2000)介导转染骨髓瘤细胞RPMI8226,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测转染前后DNMT1基因和蛋白表达,应用甲基化特异性PCR检测转染前后骨髓瘤细胞SOCS-1基因甲基化水平的变化。结果:转染后骨髓瘤细胞DNMT1 mRNA表达水平(0.176±0.004)和蛋白表达水平(0.065±0.014)均明显低于阴性对照组(0.956±0.033,0.415±0.027),其差异具有统计学意义(P0.01)。转染后SOCS-1基因甲基化水平较转染前明显降低。结论:利用shRNA能靶向沉默DNMT1基因的表达,并可以有效逆转SOCS-1基因高甲基化状态。     

2-甲氧基雌二醇对骨髓瘤细胞系CZ-1细胞诱导分化作用初探

本研究观察2-甲氧基雌二醇(2ME2)对骨髓瘤细胞是否具有直接的诱导分化作用.以自行建立的、能分泌λ轻链蛋白的骨髓瘤细胞系CZ-1细胞为研究对象,通过瑞氏染色观察其形态变化,用流式细胞术分析2ME2作用后细胞表面标志CD49e的表达率,采用免疫比浊法测定培养上清液中λ轻链蛋白浓度.结果表明CZ-1细胞经0.1-0.5μmol/L 2ME2作用72小时后细胞形态向成熟发展,见核浆比例降低,核仁减少或消失,染色质变得更粗糙更致密;细胞表面标志CD49e表达率明显上调,并呈浓度依赖性,与对照组比较统计学意义明显;0.1和0.5μmol/L 2ME2处理72小时后,CZ-1细胞分泌λ轻链蛋白分别由29.3±2.77 μg/ml增至35.97±2.6μg/ml(P＜0.05)和增至79.67±1.88μg/m1(P＜0.01),显示浓度效应依赖关系.结论较低浓度2ME2能促使CZ-1细胞向成熟阶段分化,2ME2这一作用的发现能为骨髓瘤的治疗提供新的有效的方法.     

Xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导骨髓瘤细胞株NCI-H929(H929)凋亡的影响。通过小发夹RNA(shRNA)干扰xbp-1基因表达,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测靶细胞凋亡率,采用Wes-ternblot检测XBP-1蛋白水平。结果表明:通过慢病毒载体PLL3.7介导的xbp-1 shRNA表达,能有效抑制H929细胞XBP-1蛋白表达,xbp-1 shRNA表达细胞的凋亡率显著高于对照组[(10.13±0.61)%vs(2.5±0.2)%,p0.05];经硼替佐米处理后,xbp-1基因功能缺陷的H929细胞的凋亡率显著高于空载体组[(45.07±1)%vs(2.73±0.25)%,p0.05]。结论:xbp-1基因沉默能够显著增强硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡活性。     

接种IL—6基因转导的白血病细胞后局部病理形态学实验研究

将人白细胞介素6(IL-6)基因转导的高分泌IL-6的FBL-3红白血病细胞克隆株体外扩增后,接种至C57BL/6小鼠皮下,观察肿瘤生长情况,并于不同时间取接种处组织作常规病理、免疫组化及电镜检查。结果表明接受IL-6基因转导的FBL-3细胞接种后的小鼠成瘤晚、生长速度慢,且肿瘤接种局部可见大量粒细胞和部分浆细胞、淋巴细胞的浸润,接种处组织免疫组化显示增殖细胞核抗原阳性率显著降低,提示IL-6基因转导的白血病细胞在体内致瘤性降低与其接种局部某些杀伤细胞浸润而诱导机体抗肿瘤免疫功能增强有关。     

CXCR4基因修饰骨髓间充质干细胞对照射损伤小鼠造血重建的影响

本研究旨在探讨过表达CXCR4基因的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）移植对照射损伤小鼠造血重建的影响.采用293FT细胞包装共表达EGFP和Cxcr4慢病毒载体,转导MSC建立稳定共表达EGFP和CXCR4基因MSC（CXCR4-MSC）,同时建立稳定表达EGFP的MSC（EGFP-MSC）作为对照,经尾静脉输注接受亚致死剂量（总剂量3.5Gy）照射的BALB/c小鼠.MSC的输注量5×105,设立单纯照射组为单纯对照组.观察小鼠的一般生存状态,统计小鼠生存率.分别于第3、7、14、21、28 d外周血计数白细胞（WBC）和红细胞（RBC）,流式细胞术（FCM）检测网织红细胞与网织血小板比例及血小板（Plt）数量.病理观察移植后各组骨髓、脾脏恢复情况.PCR检测MSC在受鼠体内植入情况.结果表明,各组小鼠移植后血象呈先下降、继而上升的一般趋势,其中WBC在1周后开始恢复,且CXCR4-MSC组恢复速度明显快于其他两组,差异具有统计学意义（P＜0.05）.病理结果显示,CXCR4-MSC组造血器官照射损伤后修复较快.PCR检测发现,移植后7、14、21、28 d均可在受亚致死剂量照射的受鼠体内检测到供体MSC.结论：输注过表达CXCR4基因的MSC可增加MSC植入,并促进照射损伤小鼠造血功能的恢复.     

二甲双胍对急性单核细胞白血病细胞株THP-1增殖、分化和凋亡的影响

目的:探讨二甲双胍(metformin)对体外培养的急性单核细胞白血病细胞株THP-1细胞增殖、分化和凋亡的影响,并分析其可能的作用机制。方法:用不同浓度的二甲双胍分别对THP-1细胞进行体外干预,24 h、48 h后用CCK-8法检测细胞的增殖情况;20 mmol/L二甲双胍干预24 h后用Annexin V/7-AAD双标记法分析细胞凋亡情况;流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b、CD14的变化;实时定量PCR检测BCL-XL、BAX、BIM、Caspase-3mRNA表达的变化。结果:CCK-8法检测显示二甲双胍对THP-1细胞增殖具有显著的抑制作用,且作用呈时间和剂量依赖性;20 mmol/L二甲双胍干预THP-1细胞24 h后,流式细胞术检测结果显示CD11b、CD14阳性细胞率无明显变化(P0.05);Annexin V/7-AAD标记的流式细胞术检测显示,实验组和对照组早期凋亡细胞比例分别为(2.02±0.85)%和(4.46±1.33)%,晚期凋亡细胞比例分别为(1.43±0.83)%和(3.31±0.59)%,在实验组明显高于对照组(P0.05);20 mmol/L二甲双胍诱导THP-1细胞过程中BCL-XL、BIM表达无明显变化,BAX、Caspase-3表达显著增加(P0.01)。结论:二甲双胍能有效抑制THP-1细胞增殖并促进细胞凋亡,但对THP-1细胞分化无明显影响,其促进凋亡机制可能与上调BAX及Caspase-3基因有关。     

不同类型星形胶质细胞对神经干细胞定向分化的影响

目的观察不同类型星形胶质细胞作为饲养层细胞对神经干细胞定向分化为神经元的影响。方法通过无血清培养的方法,将原代培养所获得的神经干细胞克隆;经纯化和标记后,分别接种在以原浆型和纤维型星形胶质细胞作为饲养细胞的培养皿中并加入NeuralBasal培养基,10d后行NF-200免疫荧光染色,在显微镜下随机选取20个视野,记数神经元和标记神经干细胞的比例,并对分化的神经元细胞进行胆碱酯酶染色和Fura-3探针标记。结果在原浆型和纤维型星形胶质细胞培养条件下,神经干细胞分化为神经元的比例分别为72%与43%,分化细胞胆碱酯酶染色阳性。分化神经元在药物刺激下,细胞内可发生钙离子活动的变化。结论原浆型星形胶质细胞具有较好地促进神经干细胞向神经元,特别是向有生物学活性的运动神经元分化,可作为神经组织工程中研究中一种新的种子细胞。     

骨髓微环境对多发性骨髓瘤瘤细胞AP-1家族成员基因表达的调节作用

本研究旨在探讨骨髓微环境对多发性骨髓瘤(MM)细胞AP-1家族成员基因的调节作用。采用免疫磁珠方法分选8例多发性骨髓瘤患者CD138+的瘤细胞并与破骨细胞共培养,用实时定量PCR方法检测与破骨细胞共培养的瘤细胞和与破骨细胞共培养的瘤细胞AP-1家族成员c-jun、junD、fos和fosB的表达量。结果显示,多发性骨髓瘤患者的外周血单个核细胞经破骨细胞培养液培养后10-14天形成破骨细胞,瘤细胞与破骨细胞共培养后与未与破骨细胞共培养相比较,细胞活力明显增高,c-jun、junD、fos和fosB表达量均降低。结论:骨髓微环境可抑制AP-1家族成员的表达,促进MM瘤细胞存活,抑制瘤细胞凋亡。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对多发性骨髓瘤细胞MM1R的抑制作用

本研究探讨新一代组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589单药或者联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米,对多发性骨髓瘤(MM)细胞的抗瘤效应。采用MTT法检测LBH589(10、20、50 nmol/L)及50 nmol/L分别联合硼替佐米(10、20 nmol/L)作用于人多发性骨髓瘤MM1R细胞24,48 h后的细胞增殖抑制作用;采用流式细胞术检测LBH589对MM1R细胞周期和细胞凋亡的影响;采用Western blot分析LBH589(10、20、50 nmol/L)作用MM1R细胞24 h后组蛋白H4乙酰化的程度。结果表明,LBH589单药及与硼替佐米联合均能够抑制MM1R细胞增殖,并与药物浓度和作用时间呈正相关。MM1R细胞经药物作用48 h后,G0/G1期细胞逐渐增多,G2/M期及S期细胞逐渐减少,细胞阻滞在G0/G1期,同时可见MM1R细胞的凋亡率增加,作用呈浓度依赖性,且LBH589与硼替佐米联合作用均较单药作用更加明显(均P<0.001);Western blot分析显示,不同浓度LBH589作用MM1R细胞24 h后组蛋白H4乙酰化的程度上调,呈浓度依赖性。结论:LBH589能够抑制MM1R细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,且与硼替佐米联合对骨髓瘤细胞有协同作用。