Real—TimePCR检测棘阿米巴方法建立及应用

目的采用TaqMan探针法建立检测棘阿米巴18srDNA的实时荧光定量PCR（Real—timePCR）方法,为早期诊断棘阿米巴病提供基因诊断标准方法。方法提取实验室培养的4株土壤中分离的和1株水中分离的不同基因型棘阿米巴DNA,测序后在物种保守区域设计Real—time引物和TaqMan探针,用建立的方法检测动物模型兔眼分泌物、大肠杆菌、人巨细胞病毒、卡式肺孢子虫、疑似棘阿米巴角膜炎160例病人眼分泌物。结果与传统实验室培养病原相比,所建立的qPCR检测棘阿米巴角膜炎方法测定大肠杆菌、人巨细胞病毒和卡式肺孢子虫与该研究的实验室分离棘阿米巴物种没有交叉反应,检测结果均为阴性。而160例疑似病人,用培养法检测出感染棘阿米巴患者为5例,用qPCR方法检测出6例,其中5例为培养法测出患者,qPCR方法检测阳性率（3．75％）略高于普通培养法（3．13％）,但无统计学意义（P〉O．05）。qPCR方法在95％置信区间中灵敏度100％（47．95％～100％）高于普通培养法83．33％（36．10％～97．24％）。结论所建立测定棘阿米巴18srDNA的Real-timePCR基因检测方法具有无创伤性、高效、特异、经济等特点,适用于疑似棘阿米巴角膜炎病人门诊筛选的有效方法。     

两种不同方法检测咽拭子标本中肺炎支原体临床诊断价值的比较

应用聚合酶链反应 （PCR）与实时TaqMan荧光定量PCR（Real-time PCR）检测咽拭子标本中的肺炎支原体DNA（Mp-DNA）,比较两种方法检测结果的临床诊断价值。 方法 随机选取临床儿科门诊患儿566例,包括临床治诊Mp感染患儿106例和临床疑似Mp感染患儿460例,分别采用PCR法和实时TaqMan Real-time PCR法检测,以临床治诊Mp作为参照标准,采用 检验评定两种检测方法诊断的灵敏度和特异度,比较两种检测方法对Mp的诊断价值。 结果 566份受检患儿的咽拭子标本中,PCR法检测阳性45例（7.95%） （临床治诊Mp感染患儿5例,临床疑似Mp感染患儿40例）,实时TaqMan Real-time PCR法检测阳性175例（30.92%） （临床治诊Mp感染患儿95例,临床疑似Mp感染患儿80例）。实时TaqMan Real-time PCR法检测咽拭子Mp-DNA诊断Mp感染的敏感度显著高于PCR法（敏感度Real-time PCR 89.62 %,PCR 4.72 %, =146.322, P=0.000, P<0.05）,特异度与PCR法的差异无统计学意义（特异度Real-time PCR 87.61%, PCR 91.30 %, =3.331, P=0.068, P>0.05）。 结论 应用实时TaqMan Real-time PCR法检测咽拭子中的Mp-DNA对儿童Mp感染的诊断价值优于应用PCR法检测咽拭子中的Mp-DNA, 其中应用实时TaqMan Real-time PCR检测对Mp感染患儿的早期诊断有更大的临床价值。     

基于TaqMan探针的猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立一种能检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）的TaqMan探针荧光定量PCR方法。方法 根据PRRSV的ORF7基因保守区的核苷酸序列设计引物和TaqMan探针,通过探针浓度的优化,建立检测PRRSV的TaqMan探针荧光定量PCR方法。用该方法对30份临床疑似病料进行检测, 并与常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行比较。结果 TaqMan荧光PCR检测PRRSV的最佳探针浓度为0.4μmol,检测灵敏度可达3.51拷贝/μl。检测的30份样品与病毒分离结果的符合率为100%,与普通PCR的检测结果（25/30）比较,本方法对临床样品的检出率（28/30）更高。结论 建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样品的检测。     

中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的检测。方法根据中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及一条特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-time PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-time PCR方法检测中东呼吸综合征冠状病毒所绘制标准曲线的相关系数0.99,灵敏度为1.00×101拷贝,高于常规PCR方法(1.00×102拷贝);用该方法检测中东呼吸综合征冠状病毒基因为阳性,其他6种对照呼吸道病原体及冠状病毒基因检测均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均1%。结论建立的中东呼吸综合征冠状病毒Real-time PCR检测方法灵敏、特异、重复性好,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的快速诊断和流行病学调查。     

致人体呼吸道感染的似棘阿米巴形态学和分子生物学鉴定

目的鉴定某反复咳嗽患者痰液样本中形态学似棘阿米巴的寄生虫种属。方法分离患者痰液中原虫进行体外培养,显微镜观察原虫滋养体和包囊形态,并提取原虫DNA,采用阿米巴科18S rRNA通用引物Ami6F1和Ami9R、棘阿米巴属18S rRNA通用引物JDP1和JDP2、葛氏棘阿米巴(Acanthamoeba griffini)S-7ATCC 18S rRNA全长序列引物AacGF和AacGR进行PCR扩增鉴定。以样本的18S rRNA基因为分子标志,与GenBank中各棘阿米巴序列进行同源性分析,筛选相关物种序列,采用最大似然法构建系统进化树,分析亲缘关系。结果镜下可见,患者痰样中的滋养体具有棘阿米巴特征性的棘状伪足凸起,并呈无规则的变形虫状;包囊为两层膜结构,内膜具有棘阿米巴特征性的星状突起。PCR检测结果显示,采用3组引物分别扩增出830、479和1 954 bp的条带,与预期片段大小一致。经BLAST比对后,3个扩增产物序列与棘阿米巴S-7 ATCC相似度分别达99%、99%、100%。系统进化树结果显示,样本棘阿米巴与引起角膜炎的卡氏棘阿米巴(A.castellanii)、多噬棘阿米巴(A.polyphaga)、柯氏棘阿米巴(A.cullbertsoni)和条脊棘阿米巴(A.rhysodes)同源性较高,分别为91.4%、99.6%、94.5%和91.8%。结论该呼吸道感染患者痰液样本中的寄生虫鉴定为葛氏棘阿米巴。     

家兔棘阿米巴角膜炎动物模型的建立

目的:建立棘阿米巴角膜炎的动物模型。方法:在6 只新西兰家兔角膜基质层内注射地塞米松3 d 后,再注入棘阿米巴原虫悬液。结果:6 只家兔均发生角膜炎。经家兔角膜刮片用10% 氢氧化钾封片镜检、角膜组织原虫培养和病理切片染色检查证实,成功地建立了家兔棘阿米巴角膜炎动物模型。结论:通过角膜基质内注射建立的家兔棘阿米巴角膜炎动物模型,方法简便又易于操作     

猪链球菌2型的Real-time PCR定量检测研究

目的 建立了基于TaqMan探针的Real-time PCR方法，实时、定量检测猪链球菌2型。针对GenBank公布的猪链球菌2型的csp2J基因序列设计一对引物和TaqMan探针，建立了Real-time PCR检测方法，制作标准曲线，定量检测猪链球菌2型。通过对6种细菌（9株菌株）的DNA进行扩增。结果所有4株猪链球菌2型均可产生扩增曲线，其他5株非猪链球菌2型均不产生扩增曲线。细菌纯培养物的检测敏感度为6～8CFU／PCR反应体系，相关系数均为0．99（r^2=0．99），整个试验可在1．5h内完成。建立的方法可用于猪链球菌2型的快速、定量检测。     

猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测的建立

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。方法 根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine Cytomegalovirus,PCMV)DNA序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立了猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法(fluorescent quantitative real-time PCR, FQ-PCR),进行了FQ-PCR检测方法的敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PCMV 感染临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了比对;对FQ-PCR检测结果为PCMV 阳性猪的不同内脏器官进行病毒含量比较检测。结果 成功建立了PCMV 的FQ-PCR方法,标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;检测灵敏度可达1 拷贝/μL,是常规PCR的100倍;特异性高,对pGEM-T/PCMV重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对6个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒分别重复扩增6次,重复结果良好;对15份临床疑似PCMV感染的组织病料进行应用检测表明,其中有9份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。猪的内脏器管中PCMV含量最高为扁桃体,最低的为小肠。结论 成功建立了PCMV FQ-PCR方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊和隐性感染猪的早期检测,对PCMV的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义。     

棘阿米巴性角膜炎6例检测与临床诊疗分析

目的 分析6例确诊为棘阿米巴性角膜炎的实验室检查与临床诊疗。方法 回顾性分析2011-2013年我院6例棘阿米巴性角膜炎的显微镜检查、病理检查及角膜共聚焦检查和临床诊疗经过。结果 6例检及棘阿米巴包囊或滋养体而确诊,经过0.02%氯已定加抗真菌药物治疗后,4例治愈。无效者分别再行角膜移植和眼内容物摘除。结论 结合多种实验室检查方法查找病原体是诊断棘阿米巴性角膜炎的有效手段。早期诊断对预后及有效治疗有重要意义。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。     

Identification and quantification of the Acanthamoeba species and genotypes from reservoirs in Taiwan by molecular techniques

The occurrence of Acanthamoeba was investigated from 21 main reservoirs of Taiwan with 12 (57.1%) testing positive. Analysis of the 18S rRNA gene PCR product was performed in order to identify the Acanthamoeba isolates. Acanthamoeba spp. concentrations were determined according to TaqMan real-time qPCR. Acanthamoeba genotypes of all isolates were identified T4. The species were categorized to Acanthamoeba culbertsoni, Acanthamoeba polyphaga, Acanthamoeba castellanii and Acanthamoeba hatchetti. The concentration of Acanthamoeba spp. in detected positive reservoir water samples was in the range of 3.0–1.8 × 10³ cells/L. These results highlight the importance of Acanthamoeba in reservoirs of potential pathogens and its possible role in the spread of bacterial genera with interest in public and environmental health.     

一株马鼻疽诺卡菌临床分离株的鉴定

目的应用基因测序分析进行诺卡菌（Nocardia farcinica）鉴定。方法将临床分离菌株BJ7菌株与诺卡菌标准参照菌株AY756551和结核分枝杆菌H37Rv接种L-J、PNB/TCH鉴别培养基。用生长良好的培养物提取全基因组DNA。设计引物,对rpoB、16S rDNA基因片段进行PCR扩增,对其PCR产物进行测序和网上同源性比对。结果 PNB/TCH鉴别培养基鉴定BJ7为非结核分枝杆菌,进化树中BJ7 16S rDNA序列亲缘关系与诺卡菌标准参照菌株AY756551比较相近,且16S rDNA和rpoBDNA序列与马鼻疽诺卡菌同源性极高,分别达到100%和99%。结论从结核病患者分离的菌株BJ7为马鼻疽诺卡菌。DNA测序分析能够快速、简便、准确地鉴定诺卡菌。     

自延吉市自来水分离的棘阿米巴18S rDNA基因型鉴定

目的对吉林延吉市自来水中分离的棘阿米巴分离株Acanthamoeba sp.CJY/W1 18S rDNA基因型鉴定。方法从本地区自来水分离的Acanthamoeba sp.CJY/W1虫株中提取基因组18S rDNA,应用棘阿米巴属特意性引物PCR扩增。将扩增产物测序后用Clustal X和Genedoc软件进行序列分析,与基因库中已有T1至T12型序列进行比较并构建进化树。结果分离的棘阿米巴分离株CJY/W1的18S rDNA全基因为2 252bp,18S rDNA基因分型最接近于T1型,但与T1型之间的基因差异为8%。结论分离的CJY/W1株是不属于T1-T12的新的18S rDNA基因型,接近于T13(Acanthamoeba sp.UWC9,AF132134)。     

荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体

目的运用荧光定量PCR法检测异尖线虫类病原体。方法于鱼类内脏中检获6种异尖线虫类幼虫:抹香鲸异尖线虫、简单异尖线虫、内弯对盲囊线虫、带鱼针蛔线虫、灰海鳗对盲囊线虫和台湾海峡鱼类中一优势种对盲囊线虫。提取各虫体DNA,PCR扩增ITS-2序列,测序并进行数据库比对。依据测序结果设计特异引物,常规PCR检验引物特异性。将ITS-2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数均在0.998以上。重复性实验中,6种虫体对应的变异系数(cv)最小值为0.18%,最大值为2.80%,试验间平均cv最小值为0.55%,最大值为1.94%,无非特异性扩增,溶解曲线的特异性和重复性良好。灵敏度实验中,可检出的最低模板浓度为1×102拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍。结论初步建立了SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体的方法 。     

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x＋40.988（HTN）,y=-3.5307x＋39.356（SEO）,扩增效率分别为92.2%（HTN）和92.6%（SEO）,相关系数R2分别为0.9968（HTN）和0.9997（SEO）,呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。     

棘阿米巴原虫全长cDNA文库的构建

目的快速构建棘阿米巴滋养体全长cDNA文库,为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定基础。方法以棘阿米巴滋养体分离株总RNA为模板,以经修饰的SMART寡聚核苷酸引物逆转录合成单链cDNA,采用长距PCR(long-Distance PCR,LD PCR)方法扩增得到双链cDNA,经蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切后通过色谱柱CHROMA SPON-400按分子质量进行分离,进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收纯化0.4~2.5kb分离产物。取1μl PCR产物与λ噬菌体连接,以XL1-BLUE为受体菌扩增得到cDNA文库,分别用梯度法和随机测序法检测文库滴度与重组率。结果成功构建棘阿米巴cDNA文库,文库滴度为3.85×107pfu/ml,插入片段大小在0.4~2.5kb之间,重组率为100%(20/20)。结论棘阿米巴滋养cDNA文库构建成功,为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定了基础。