刚地弓形虫菱形体蛋白的研究进展

菱形体蛋白（rhomboid）为一类跨膜丝氨酸蛋白酶，在胞膜的脂质双分子层内发挥酶解作用。刚地弓形虫的菱形体蛋白可识别微线体蛋白的跨膜区，并对其进行蛋白水解，使微线体蛋白的N端片段释放人介质中。微线体蛋白的蛋白水解过程对于刚地弓形虫入侵宿主细胞非常重要。深入研究刚地弓形虫菱形体蛋白，将有助于理解生物体菱形体蛋白的功能及研制新的药物以防治弓形虫感染。     

欧洲的刚地弓形虫研究

西方介绍了欧洲刚地弓形虫的研究计划，流行病学、免疫学、分子生物学研究的现状。     

弓形虫蛋白激酶C受体1蛋白的表达与抗原性分析

目的构建弓形虫蛋白激酶C受体1基因的pET-30a（＋）-RACK1重组质粒,表达、纯化RACK1蛋白。方法PCR扩增RACK1基因的cDNA序列,用SacI、NcoI限制性内切酶对RACK1基因的PCR产物及pET-30a（＋）质粒进行双酶切,连接,转化大肠杆菌BL21,构建重组质粒。IPTG诱导表达,亲和层析柱纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析鉴定。结果PCR扩增出 966 bp的RACK1完整基因序列,成功构建RACK1基因的pET-30a（＋）-RACK1重组质粒,表达出约36kDa的RACK1蛋白,蛋白具有抗原性。结论成功构建弓形虫RACK1基因的pET-30a（＋）-RACK1重组质粒,纯化出RACK1蛋白,为进一步进行RACK1蛋白在弓形虫入侵分子机制中的作用研究奠定基础。     

刚地弓形虫热激蛋白70对宿主抗弓形虫感染的作用

感染弓形虫的小鼠在死前可检出弓形虫的热激蛋白70（TgHSP70）的表达迅速增加，表明该分子可作为弓形虫急性致死性感染的危险信号。对经口感染10个Fukaya株包囊的小鼠在感染的0、1、2、3d分别腹腔注射100、300、600和1000μg重组TgHSP70，对照组注射载体蛋白。弓形虫感染3d的小鼠腹腔注射1000μg重组TgHSP70后，在9d内全部死亡。而感染0、1、2d腹腔注射相同剂量重组TgHSP70的小鼠存活超过6个月（P〈0、01）。TgHSP70是表达在速殖子上的毒力分子，按照该毒力分子的不同，把速殖子分成2类：表达低水平TgHSP70的破坏型速殖子和表达高水平TgHSP70的毒力型速殖子。     

刚地弓形虫RNA结合蛋白DDX39生物信息学分析

目的 采用生物信息学技术对刚地弓形虫RNA结合蛋白DDX39(TgDDX39)进行分析,评估该蛋白的免疫原性,从而为研发弓形虫病疫苗提供参考依据。方法 在ToxoDB数据库中检索TgDDX39氨基酸序列后,利用ProtParam、TMHMM 2.0、SignalP 5.0、NetPhos 3.1、COILS、SOPMA、Phyre2、ProtScale、ABCpred、SYFPEITHI、DNASTAR等生物信息学软件预测TgDDX39蛋白的理化性质、蛋白跨膜结构域、信号肽位点、翻译后修饰位点、卷曲螺旋、二级和三级结构、亲疏水性及抗原表位。结果 Tg DDX39蛋白是一种不稳定亲水性蛋白,分子式C₂₁₇₃H₃₄₅₈N₅₉₈O₆₆₁S₁₈,含有434个氨基酸,预测分子量为49.1 kDa,理论等电点为5.55。预测该蛋白存在信号肽的可能性极低,无跨膜区,并含有27个磷酸化位点;TgDDX39蛋白二级结构中β转角和无规则卷曲占39.63%,有1个部位有形成卷曲螺旋的倾向,且TgDD...     

刚地弓形虫peroxiredoxin基因的克隆表达与免疫原性分析

目的对刚地弓形虫peroxiredoxin(TgPrx)基因进行克隆、表达和免疫原性分析。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA;设计合成引物并引入EcoRI和XhoI酶切位点,RT-PCR扩增编码TgPrx的基因片段克隆到原核质粒pET30a(+)中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE进行鉴定,重组蛋白用Western blotting分析其免疫原性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出591bp的TgPrx基因片段,并成功构建重组质粒pET30a(+)/TgPrx;SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中高效表达。重组蛋白的相对分子量约32kDa,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结论RH株刚地弓形虫peroxiredoxin可在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。     

刚地弓形虫蛋白质组研究进展

随着基因组学的发展和完善,在基因组学的基础上,蛋白质组学作为一门新兴的前沿科学已经显示出了其巨大的发展前景.将蛋白质组学技术应用于弓形虫研究,在蛋白质水平上全面认识弓形虫的生理、病理等过程是目前弓形虫研究领域的热点之一.该文就弓形虫蛋白质组的研究进展进行综述,以期从蛋白质组学研究的角度为弓形虫研究提供新的思路.     

刚地弓形虫致BALB/c小鼠受精卵发育毒性的研究

目的观察刚地弓形虫感染是否影响小鼠受精卵的发育及卵裂，探讨刚地弓形虫对胚胎发育的毒性作用。方法将BALB／C小鼠随机分为未染虫对照A组和染虫B—E组，A组每只腹腔注射PBS0．2ml；B—E组每只依次腹腔注射刚地弓形虫速殖子25、50、100、200个，注射体积均为0．2ml。染虫3d，使小鼠超排、合笼，查阴栓，将查获阴栓的各组小鼠再随机分为A1-A3、B1-B3、C1-C3、D1-D3和E1-E3组，观察各组小鼠受精卵于受精24、48和72h后的卯裂情况。结果染虫B组与对照A组各项指标均无差异。染虫C～E组小鼠受精24、48h回收的胚胎总数、受精卵百分率均小于A组（P〈0．05），而在受精72h后，C组与A组无差异，D、E组小于A组（P〈0．05）；在受精24h后，1-C胚率比对照A组高（P〈0．05），2-C胚率则比A组低（P〈0．05）；在受精48h后，桑椹胚率低于A组（P〈0．05）；72h后囊胚率低于A组（P〈0．05），而发育延迟胚率和退化胚率在受精48、72h后则都高于A组（P〈0．05）。结论刚地弓形虫对小鼠受精卯的发育具有-定的毒性作用。     

弓形虫主要抗原基因（SAG1）在昆虫细胞中表达的研究

用PCR技术从弓形虫DNA扩增出一段长约902bp编码弓形央主要膜蛋白抗原（SAG1）的基因，将SAG1基因插入带有转座子供体的pFastBacl质粒，得到重组质粒pFT9，pFT9转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞，通过转座重组作用使SAG1基因整合到杆状病毒载体上，将两株转座重组子BaC101和Bac304DNA分别转染Sf9昆虫细胞，用弓形虫免疫血清所作的免疫印迹试验证实这两株重组杆状病毒的昆虫细胞株均表达了SAG1蛋白。本文首次报告弓形虫SAG1蛋白在昆虫细胞中的表达。     

弓形虫ROP2-SAG1重组复合蛋白及其重组质粒的免疫效应

目的研究弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(SAG1)重组复合抗原(ROP2-SAG1)的核酸和蛋白两种疫苗的免疫效应。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机均分为4组(每组15只),即rROP2-SAG1蛋白组、无菌生理盐水组、pcROP2-SAG1质粒组和pcDNA3.1质粒组,rROP2-SAG1组以2.5μgrROP2-SAG1重组蛋白与等体积佐剂乳化后,背部皮下多点免疫小鼠;无菌生理盐水组以等体积无菌生理盐水替代重组蛋白,首次免疫使用福氏完全佐剂,其余使用福氏不完全佐剂。pcROP2-SAG1组和pcDNA3.1组分别以pcROP2-SAG1和空质粒pcDNA3.1腿部肌肉注射免疫,剂量为100μg/次;以上各组小鼠共免疫3次,每次间隔2周。采用间接ELISA方法检测免疫后25、45和70d小鼠血清中特异性IgG抗体,及末次免疫后2周小鼠血清特异性IgG1和IgG2a抗体。用CCK-8细胞增殖法检测小鼠脾细胞增殖,间接ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清液中γ干扰素(IFN-γ)和白介素2(IL-2)表达水平。结果 rROP2-SAG1组小鼠血清特异性IgG抗体水平随着免疫时间的延长持续升高,pcROP2-SAG1质粒组抗体则随着免疫时间的延长相对稳定。末次免疫后2周,rROP2-SAG1组小鼠血清IgG1抗体水平(1.538±0.183)显著高于IgG2a(0.618±0.122)(P0.05),而pcROP2-SAG1组IgG1抗体水平(1.107±0.137)与IgG2a(0.830±0.185)间的差异无统计学意义(P0.05)。以特异性抗原rROP2-SAG1为刺激物时,rROP2-SAG1组小鼠脾细胞受特异性抗原刺激的增殖效果(A450值=0.348±0.042)显著高于pcROP2-SAG1组(0.123±0.018)(P0.05)。rROP2-SAG1组小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ含量[(149.37±30.51)pg/ml]、IL-2含量[38.58±9.10)pg/ml],分别与pcROP2-SAG1组IFN-γ[(138.58l±29.92)pg/ml]、IL-2[37.47l±9.26)pg/ml]比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论 ROP2-SAG1重组复合蛋白诱导的抗体水平、脾细胞增值效应显著高于重组质粒pcROP2-SAG1。     

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1重组复性后体外免疫反应性研究

目的分析基因工程生产的弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)的体外免疫反应性,并对表达产物进行复性处理以获得表达产物的天然构象,为体内免疫学活性的研究作准备。方法重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株,经IPTG诱导的表达产物超声破壁后,SDS-PAGE分析表达产物的表达形式,对产生的重组蛋白ROP2-P30过Sephadex G-25交联葡聚糖柱,经尿素梯度洗脱进行目的蛋白的复性,通过免疫共沉淀反应及免疫印迹实验检测其复性后的重组蛋白的免疫反应性。结果重组质粒pET28b/ROP2-P30在大肠杆菌中以融合形式表达,融合表达的产物主要以包涵体形式存在,该重组蛋白复性后具有明显的免疫反应性。结论利用SephadexG-25交联葡聚糖柱尿素梯度可以复性重组的弓形虫复合蛋白ROP2-P30,该蛋白复性后体外具有免疫反应性,可用于进一步开展弓形虫病复合型疫苗的研制工作。     

转染弓形虫致密颗粒蛋白-1编码基因的小鼠巨噬细胞生物学特性

目的　探讨转染弓形虫致密颗粒蛋白1编码基因(P24)前后巨噬细胞生物学性状的改变。　方法　将构建的重组质粒用脂质体介导,转染到小鼠巨噬细胞RAW264.7,抗生素G418筛选出阳性克隆,逆转录 聚合酶链反应方法鉴定并比较不同细胞株P24的表达。光学显微镜观察形态学改变并绘制生长曲线。　结果　CytoP24 RAW264.7、NucP24 RAW264.7及MitoP24 RAW264.7三株细胞的P24mRNA表达水平无显著差异,ERP24RAW264.7明显高于前三者。而转染空载体的4株细胞未见P24mRNA的表达。ERP24 RAW264.7较未转染的细胞贴壁速度快、生长能力强。　结论　P24的表达产物导致了巨噬细胞转染生长增殖能力的增强     

弓形虫棒状体蛋白ROP2基因的克隆与表达

目的从弓形虫RH株总DNA中克隆棒状体蛋白ROP2基因片段，克隆至表达载体pET22b中，导入大肠杆菌中表达。方法采用半巢式PCR扩增法从基因组DNA中扩增编码ROP2基因片段，克隆至质粒pUC119中，经PCR和酶切鉴定后，进行DNA序列测定，并以SacⅠ／HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET22b上，重组质粒pET22b—ROP2转化大肠杆菌BL21，CodonPlus（DE3）-RIL菌株中，经IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株总DNA中扩增到1．0kb的ROP2基因片段．构建成功重组质粒pUC119，ROP2，经DNA序列分析与已报道序列基本一致，重组质粒pET22b，ROP2在大肠杆菌中表达，产生一分子量约为45kDa的预期重组蛋白。结论克隆到的弓形虫棒状体蛋白ROP2在大肠杆菌中得到表达，构建成功的重组盾粒pUC119-ROP2可用千下一步多基因融合的市隆操作。     

重组刚地弓形虫Peroxiredoxin蛋白的纯化及抗血清制备

目的对原核系统表达的重组刚地弓形虫Peroxiredoxin(rTgPrx)蛋白进行镍亲和层析纯化,免疫大鼠,制备抗血清。方法优化rTgPrx表达条件,获得大量的可溶性蛋白,经镍亲和层析法纯化后皮下注射免疫Wistar大鼠,间接ELISA法测定血清抗体效价。结果在表达菌液A600为0.5,IPTG浓度为0.2 mmol/L,37℃诱导10 h时,可溶性rTgPrx表达量较高;用镍亲和层析纯化获得纯的目的蛋白,免疫大鼠后诱导产生高滴度抗体血清,效价达1∶12 800以上。结论镍亲和层析法纯化的rTgPrx具有免疫原性,用该蛋白免疫大鼠可获得高效价的抗rTgPrx血清。     

基于cDNA末端快速扩增的刚地弓形虫核仁G蛋白-1的克隆

目的　克隆弓形虫核仁G蛋白- 1(NOG1)基因的全长cDNA序列。方法　根据NCBIGeneBank中登录的弓形虫NOG1基因的唯一EST序列设计引物,利用cDNA 5’-末端快速扩增法(5’-RACE)和cDNA 3’-末端快速扩增法(3’-RACE)分别对已知序列进行延伸,将扩增获得的3’-端和5’-端未知序列与位于中间位置的已知序列进行拼接,然后经Blast检验全长序列的正确性。结果　5’-RACE扩增获得3个不同长度的片断,最长片断全长12 87bp ,去除引物和夹杂的已知序列后,通过5’-RACE在5’端扩增获得未知序列为1196bp。3’-RACE扩增后得到一条特异性条带,位于大约1.7kb左右,测序全长为16 34bp ,去除引物和已知序列,经3’-RACE扩增获得的3’-端未知序列为12 0 4bp。Blast全长为316 7bp的3段拼接序列,发现其覆盖NOG1基因cDNA的完整ORF或者CDS序列(6 5 0bp 2 80 9bp)。推导翻译出的蛋白质一级结构包含719个氨基酸(aa) ,在所有已发现物种的NOG1中,弓形虫NOG1基因的cDNA和相应的aa序列都是最长的。该序列已登录NCBIGeneBank ,核酸序列登录号AY6 86 734,对应蛋白质的aa序列登录号为AAT94 2 90。结论　本研究首次克隆获得了弓形虫NOG1基因的全长cDNA序列,并对相应的aa序列进行了推导翻译和简单分析。     

弓形虫MIC 6羧基端蛋白片段的表达及其多克隆抗体的制备

目的克隆表达刚地弓形虫微线体蛋白6羧基端蛋白片段(Tg MIC6C),制备多克隆抗体。方法PCR扩增目的基因片段,克隆到pGEX-4T-1载体上,构建MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC6C融合蛋白,亲和层析融合蛋白;用纯化的融合蛋白混合免疫佐剂免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,纯化并分析抗体的特异性。结果构建了MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统并获得纯化的GST-MIC6C融合蛋白;获得了抗目的蛋白的多克隆抗体,抗体能特异地识别目的蛋白,抗体效价为1∶8 000。结论在体外获得了纯化的GST-MIC6C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续GSTpull-down筛选与MIC6相互作用的蛋白奠定了基础。