刚地弓形虫MIC2与醛缩酶作用位点的鉴定

目的 确定刚地弓形虫微线体蛋白2(MIC2)与醛缩酶的作用位点。方法 利用定点突变技术,将MIC2羧基端(MIC2C)的767位色氨酸(W⁷⁶⁷)突变为丙氨酸(A)。PCR扩增MIC2C W/A突变体基因片段;构建MIC2C W/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-MIC2C W/A突变体蛋白。分别以该蛋白和GST-MIC2C蛋白(对照蛋白)作为探针蛋白与弓形虫速殖子裂解液进行GST pull-down实验,SDS-PAGE及Western blot分析。结果 获得了MIC2C W/A突变体基因片段,制备了GST-MIC2C W/A突变体蛋白; GST-MIC2C蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带,而且可以被醛缩酶抗体识别,而GST-MIC2C W/A蛋白的pull-down产物中未见蛋白条带。结论 将MIC2的W⁷⁶⁷突变为A后,MIC2失去与醛缩酶的作用,即MIC2与醛缩酶的作用位点为色氨酸(W)。     

弓形虫MIC6羧基端相互作用蛋白的筛选

目的筛选与弓形虫微线体蛋白6羧基端（MIC6C）相互作用的蛋白。方法以GST-MIC6C蛋白作为探针蛋白,利用GST pull-down技术,从弓形虫裂解液中筛选与其相互作用的蛋白,SDS-PAGE分析实验产物;将目标蛋白条带转印至PVDF膜,测蛋白序列,BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白。制备目标蛋白的抗体,Western blot分析GST pull-down实验产物。结果 GST pull-down实验筛选到的目标蛋白的序列与弓形虫醛缩酶的序列一致;制备了醛缩酶的多克隆抗体,目标蛋白条带能被该抗体特异地识别。结论采用GST pull-down技术,初步筛选出与弓形虫MIC6C相互作用的蛋白为醛缩酶。     

重组刚地弓形虫MIC8 CTD蛋白及其多克隆抗体的制备

目的制备弓形虫微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8 CTD)重组蛋白及其多克隆抗体。方法以弓形虫基因组为模板,PCR扩增MIC8 CTD基因片段,构建MIC8 CTD/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC8CTD融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的特异性及效价。结果构建了MIC8 CTD原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC8 CTD融合蛋白;获得了抗该蛋白的兔源性抗血清,纯化后的多克隆抗体能特异识别MIC8 CTD,ELISA测定抗体效价为1∶8 000。结论制备的GST-MIC8 CTD融合蛋白具有免疫原性,用该抗原免疫动物可获得高效价的多克隆抗体。     

弓形虫MIC6羧基端与醛缩酶相互作用的鉴定

目的 鉴定弓形虫MIC6羧基端和醛缩酶的相互作用及两种蛋白在虫体内的定位。方法 分别用GST-MIC6C多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀实验,实验产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。弓形虫速殖子涂片,免疫荧光定位法确定两种蛋白在虫体内的定位。结果 与对照相比,GST-MIC6C多克隆抗体的免疫共沉淀产物中有蛋白条带可分别被相应的抗体识别。荧光显微镜下显示,MIC6(红色荧光)和醛缩酶(绿色荧光)两种蛋白皆定位于弓形虫的顶端。结论 弓形虫MIC6羧基端与醛缩酶存在相互作用并在虫体内存在共定位关系。     

刚地弓形虫菱形体蛋白的研究进展

菱形体蛋白（rhomboid）为一类跨膜丝氨酸蛋白酶，在胞膜的脂质双分子层内发挥酶解作用。刚地弓形虫的菱形体蛋白可识别微线体蛋白的跨膜区，并对其进行蛋白水解，使微线体蛋白的N端片段释放人介质中。微线体蛋白的蛋白水解过程对于刚地弓形虫入侵宿主细胞非常重要。深入研究刚地弓形虫菱形体蛋白，将有助于理解生物体菱形体蛋白的功能及研制新的药物以防治弓形虫感染。     

刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的克隆与表达

目的　克隆编码刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,构建原核表达载体pET MMIC3,并在大肠杆菌BL2 1株中表达。方法　采用PCR技术从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,并克隆到T载体上,经测序鉴定后,将目的基因亚克隆到表达载体pET30a(+)上,构建质粒pET MMIC3。表达产物用Westernblot进行进一步确认。结果　经初步菌液PCR鉴定,提取质粒双酶切鉴定并测序,确认插入T载体的序列为所需的目的序列;亚克隆构建pET -MMIC3,转化到宿主菌大肠杆菌BL2 1,得到分子量为37.2kDa的重组表达蛋白,Westernblot的结果与预测相符。结论　成功的克隆并融合表达了刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽,为进一步研究其在弓形虫粘附和入侵中的作用奠定了基础。     

弓形虫MIC 6羧基端蛋白片段的表达及其多克隆抗体的制备

目的克隆表达刚地弓形虫微线体蛋白6羧基端蛋白片段(Tg MIC6C),制备多克隆抗体。方法PCR扩增目的基因片段,克隆到pGEX-4T-1载体上,构建MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC6C融合蛋白,亲和层析融合蛋白;用纯化的融合蛋白混合免疫佐剂免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,纯化并分析抗体的特异性。结果构建了MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统并获得纯化的GST-MIC6C融合蛋白;获得了抗目的蛋白的多克隆抗体,抗体能特异地识别目的蛋白,抗体效价为1∶8 000。结论在体外获得了纯化的GST-MIC6C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续GSTpull-down筛选与MIC6相互作用的蛋白奠定了基础。     

刚地弓形虫热激蛋白70对宿主抗弓形虫感染的作用

感染弓形虫的小鼠在死前可检出弓形虫的热激蛋白70（TgHSP70）的表达迅速增加，表明该分子可作为弓形虫急性致死性感染的危险信号。对经口感染10个Fukaya株包囊的小鼠在感染的0、1、2、3d分别腹腔注射100、300、600和1000μg重组TgHSP70，对照组注射载体蛋白。弓形虫感染3d的小鼠腹腔注射1000μg重组TgHSP70后，在9d内全部死亡。而感染0、1、2d腹腔注射相同剂量重组TgHSP70的小鼠存活超过6个月（P〈0、01）。TgHSP70是表达在速殖子上的毒力分子，按照该毒力分子的不同，把速殖子分成2类：表达低水平TgHSP70的破坏型速殖子和表达高水平TgHSP70的毒力型速殖子。     

刚地弓形虫蛋白磷酸酶的全蛋白质组鉴定及生物信息学分析

从相关数据库分别下载刚地弓形虫GT1、 ME49、 VEG虫株,疟原虫以及44个其他真核生物物种的全蛋白质组氨基酸序列,应用HMMER3软件搜索弓形虫不同虫株及其他物种氨基酸序列,鉴定出弓形虫及其他物种磷酸酶家族蛋白。对所有鉴定出的磷酸酶家族蛋白进行聚类分析,提取相对保守的磷酸酶家族蛋白氨基酸序列,分别用邻接法和最大似然法构建系统进化树。应用Pfam在线工具对鉴定出的弓形虫磷酸酶蛋白的结构域进行注释,并进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,利用基因芯片数据分析并比较蛋白磷酸酶在不同虫株及ME49虫株不同发育时期的转录水平。共鉴定出64个弓形虫磷酸酶蛋白,分属5个磷酸酶亚家族,其中,磷蛋白磷酸酶家族蛋白11个,酪氨酸磷酸酶样蛋白A家族蛋白1个,天冬氨酸依赖的酪氨酸磷酸酶家族蛋白8个,双特异性磷酸酶家族蛋白9个,Mg²⁺或Mn²⁺依赖的磷酸酶家族蛋白35个。系统进化树分析结果显示,蛋白磷酸酶在不同弓形虫虫株间高度保守,仅有2个蛋白磷酸酶无直系同源蛋白,为VEG虫株所特有。GO富集分析结果显示,弓形虫蛋白磷酸酶主要具有磷酸酶、水解酶及催化活性的分子功能,参与调节去磷酸化的生物学过程。芯片分析结果显示,蛋白磷酸酶在弓形虫不同虫株速殖子时期的表达谱相似,虫株间表达水平差异最大的为TG312200,其在ME49虫株中的表达水平约为GT1和VEG虫株的4倍;部分蛋白磷酸酶的转录水平在ME49虫株不同发育阶段差异显著,如TG318660在未孢子化的卵囊中低表达,TG304955在速殖子和缓殖子期高表达,这些在不同发育时期差异表达的蛋白磷酸酶可能在虫体发育过程中发挥重要作用。     

弓形虫棒状体蛋白ROP38的原核表达与鉴定

目的原核表达弓形虫棒状体蛋白ROP38,并对重组蛋白rROP38的反应原性进行鉴定。方法根据已发表 的ROP38基因序列设计引物,通过RT?PCR方法扩增弓形虫RH株的ROP38基因。将ROP38部分基因克隆到原核表达 载体pET?28a（＋）后,重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达并优化表达条件,SDS?PAGE分析表 达情况,并通过Western blot鉴定其反应原性。结果SDS?PAGE显示在上清和包涵体均有rROP38表达,分子量约为43 kD。Western blot结果显示,rROP38蛋白能被His标签抗体和感染弓形虫的人阳性血清识别,说明ROP38具有良好的反 应原性,可以作为潜在的血清学诊断抗原。结论本研究成功获得了具有良好反应原性的弓形虫重组蛋白rROP38。     

弓形虫棒状体蛋白及其核酸疫苗研究现状

弓形虫病目前尚无理想的特效治疗药物和防治措施,研制安全便捷、保护力强的核酸疫苗是弓形虫病防治的有效策略。棒状体蛋白（Rhoptry protein, ROPs）是弓形虫在入侵宿主细胞过程中所分泌的一类蛋白,其在弓形虫入侵宿主细胞、纳虫空泡（Parsitophorous vacuole, PV）形成及胞内弓形虫的增殖调控等方面发挥着重要作用,是最具潜力的疫苗候选抗原分子之一。本文就ROPs家族重要成员特性、表达载体选择及其核酸疫苗在动物实验中的免疫原性,以及免疫保护作用等方面进行了概述。     

SAG1-MIC8复合DNA基因疫苗免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性研究(英文)

目的观察弓形虫SAG1-MIC8复合DNA基因疫苗对C57BL/6J小鼠的免疫保护作用。方法构建重组质粒pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-MIC8和pcDNA3.1-SAG1-MIC8,并分别转染Hela细胞体外表达蛋白,蛋白质印迹(Westernblotting)分析鉴定。将70只小鼠随机均分为5组,分别为PBS组、空质粒组、pcDNA3.1-SAG1组、pcDNA3.1-MIC8组和pcDNA3.1-SAG1-MIC8组,每2周肌注免疫(100μg/只)1次,共3次,于免疫前和初次免疫后13、27、41和55d采血分离血清。初次免疫后56d,每组小鼠中7只剖杀后分离脾细胞,另7只经腹膜感染弓形虫RH株速殖子(1×104/只),观察各组生存时间。ELISA法分别检测各组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2b和IgG2c水平,以及干扰素γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)水平。放射法检测T淋巴细胞增殖情况。结果Westernblotting分析结果显示,重组质粒pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-MIC8和pcDNA3.1-SAG1-MIC8均能在Hela细胞表达,蛋白相对分子质量(Mr)分别为34000、74000和109000。pcDNA3.1-SAG1-MIC8组初次免疫后41d和55d血清中IgG,末次血清中IgG2b、IgG2c和IFN-γ,以及T淋巴细胞增殖能力均显著高于其他各组(均P0.05)。各组的末次血清中IgG1和IL-4水平差异均无统计学意义(均P0.05)。5组小鼠感染弓形虫速殖子后生存时间中位数分别为3、4、7、7和10d,各组间差异有统计学意义(P0.01)。结论弓形虫SAG1-MIC8复合DNA抗原较SAG1和MIC8单基因抗原有更好的免疫保护性。     

刚地弓形虫类枯草杆菌蛋白酶的研究进展

刚地弓形虫的类枯草杆菌蛋白酶是虫体粘附、入侵宿主细胞过程中的一种重要蛋白酶。研究发现弓形虫的类枯草杆菌蛋白酶的催化区域高度保守;蛋白酶有多个作用底物,并与虫体的运动及毒力相关。本文对已发现的弓形虫类枯草杆菌蛋白酶的结构及性能作一综述。     

弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒。方法设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAC而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况。结果PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达。结论成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8。