弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒，并研究其在体外与体内细胞中的表达情况。方法采用PCR方法及克隆技术，构建pVAC-GRA4重组质粒；利用脂质体介导转染法，将该重组质粒导入HEK-293细胞，用RT—PCR法及Westem-blot法检测其表达情况；利用基因枪导入法将该重组质粒导入BALB／c小鼠体内细胞，测定免疫鼠T淋巴细胞亚群及IFN-γ、IL-4含量，并观察攻毒试验后小鼠存活情况，以评价其免疫保护力。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段，成功构建重组表达质粒pVAC-GRA4；转染GRA4的HEK-293细胞，RT—PCR检测可见一条约987bp的目的条带，表达产物经Western—blot鉴定，其分子量约为41kD，能被特异性免疫血清所识别；经pVAC-GRA4免疫后的小鼠，其CD4^＋T细胞百分率无明显变化（P〉0．05），CD8^＋T细胞百分率明显增加（与pVAC对照组比较P〈0．05，与空白对照组比较P〈0．01）。CD4^＋／CD8^＋比值也较空白对照组明显降低（P〈0．01）；pVAC-GRA4免疫鼠IFN-γ的A值比对照组略高，但差异无显著性（P〉0．05）。IL-4A值各组间无明显变化（P〉0．05）；pVAC-GRA4免疫鼠存活率显著高于两对照组，死亡小鼠的平均存活时间延长（与空白对照组比较P〈0．05）。结论构建的真核表达质粒pVAC-GRA4能在HEK-293细胞中和小鼠体内细胞中轰基．为弓形出癌苗的进一步研究打下基础．     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及其在BHK细胞中的表达

目的 构建弓形虫微线体蛋白( MIC3)的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白的功能奠定基础.方法 PCR法扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3.0,并转入DH5α 宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增法对重组质粒进行鉴定;应用HifectinⅡ真核细胞转染试剂将弓形虫PCDNA-MIC3真核表达质粒转染幼地鼠肾细胞(BHK),表达产物用SDS-PAGE进一步确认,ELISA法检测表达蛋白的免疫原性.结果 重组质粒PCDNA-MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120 bp大小相同的片段,PCDNA-MIC3能在BHK细胞中高效表达,表达产物能被弓形虫特异性血清所识别.结论 成功构建了弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA-MIC3.     

弓形虫GRA8基因真核表达重组质粒的构建、鉴定及测序

目的 构建弓形虫RH株pcDNA3，1( )-GRA8真核表达重组质粒，为进一步DNA免疫做准备。方法 用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码致密颗粒蛋白(GRA8)的基因片段，纯化后重组入pUC-19克隆载体，再经含IPTG，XGal氨苄培养基蓝白筛选，挑选白色克隆酶切，低溶点琼脂糖纯化，回收目的基因亚克隆入pcDNA3．1( )，经氨苄培养基过夜培养挑选6个克隆提纯酶切，PCR鉴定和测序。结果 从RH株基因组DNA中扩增出特异的GRA8基因片段，克隆成功pcDNA3．1( )-GRA8重组质粒。测序表明GRA8这部分基因与GENEBANK相应基因序列完全一致。结论 本结果为研究抗弓形虫核酸疫苗打下基础。     

含弓形虫复合抗原基因的真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的研究弓形虫复合抗原真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B在哺乳动物细胞中的表达情况。方法利用脂质体介导的转染技术,将真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B和空载体pcDNA3.1分别转染He-la细胞,400μg/mlG418加压筛选和200μg/mlG418维持筛选,获得稳定转染的Hela细胞。采用SDS-PAGE和West-ern-blot方法对复合基因P30-P22-CTXA2/B的表达产物进行鉴定。结果SDS-PAGE结果显示,重组质粒转染Hela细胞后的表达产物分子质量单位为64ku,Western-blot显示此蛋白条带能被抗P30抗体识别。结论构建的真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B能在哺乳动物细胞中成功表达插入基因所编码的融合蛋白,为进一步动物实验提供了实验依据。     

弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ(NTPase-Ⅱ)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-NTPase-Ⅱ并在COS-7细胞中进行瞬时表达。方法以pBAD-HisB-NTPase-Ⅱ质粒为模板,PCR扩增NTPase-Ⅱ目的基因,将其克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,双酶切及测序鉴定重组质粒。阳离子脂质体法转染COS-7细胞并经SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白的表达。结果经鉴定,弓形虫pcDNA3.1(+)-NTPase-Ⅱ核酸疫苗质粒构建成功。以脂质体法转染COS-7细胞后,转染细胞可成功地表达弓形虫NTPase-Ⅱ蛋白。结论证实了弓形虫NTPase-Ⅱ蛋白能在真核细胞中表达,为该基因的核酸疫苗研究提供了实验依据。     

弓形虫ROP2-P30重组真核表达质粒的构建及其免疫效应的初步分析

目的构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）融合的重组真核表达质粒,观察融合抗原ROP2-P30以DNA免疫方式在体内的免疫学效应。方法以重组质粒pET28b/ROP2-P30为模板,利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30,经PCR和酶切鉴定正确后,体外转染COS-7细胞,Westernblot检测ROP2-P30表达。重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30以每鼠100μg混合透明质酸酶10U的剂量肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,以弓形虫虫体裂解抗原作包被抗原,ELISA法测定免疫小鼠血清IgG抗体,免疫结束2周后,以约100个弓形虫速殖子攻击感染小鼠,观察小鼠生存状况。结果PCR和酶切鉴定表明重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建正确;Westernblot显示该重组质粒在COS-7细胞中瞬时表达的产物可被重组ROP2-P30免疫兔血清识别;ELISA检测重组质粒免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平升高;重组质粒免疫小鼠感染弓形虫后的存活时间较对照组有所延长。结论重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建成功,用该重组质粒DNA直接免疫小鼠,能够诱导产生特异的体液免疫反应,具有一定的免疫保护性;该重组质粒表达的融合抗原分子ROP2-P30具有免疫原性,可作为疫苗候选抗原深入研究。     

弓形虫表面抗原P30、P22与霍乱毒素A2／B复合基因真核表达质粒的构建

目的选择弓形虫 RH 株主要表面抗原 P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素 A_2/B 亚基共同构建在同一真核表达载体 pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确。方法用PCR 技术分别从弓形虫 RH 株基因组 DNA 和 pUAB024-CTXA_2/B 质粒中扩增编码 P30、P22基因片段和 CTXA_2/B,定向重组入 pUC18克隆载体,然后酶切释放 P30-P22-CTXA_2/B 复合基因片段,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,再经含氨苄青霉素的 LB 培养基筛选、酶切及测序鉴定。结果酶切产物经电泳显示条带清晰,P30、P22和 CTXA_2/B 基因片段的泳动位置分别在786bp、492bp、512bp 的位置,与预计结果一致;测序结果表明插入的基因片段方向及序列均正确。结论成功地构建了真核表达重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B,保证了三个基因连接方向,序列及开放读码框的正确,为下一步融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 在哺乳动物细胞中的表达及动物实验奠定了基础。     

弓形虫pVAX1-SAG2真核表达质粒的构建及其诱导的小鼠免疫应答

目的　构建弓形虫主要速殖子表面抗原 2 (SAG2 )编码基因真核表达质粒pVAX1-SAG2 ,并接种小鼠 ,分析其所诱导的免疫应答。方法　以限制性内切酶EcoRⅠ与KpnⅠ双酶切从重组质粒 pGEM/SAG2中获得SAG2目的基因片段 ,约5 92个bp ,将其插入真核表达载体 pVAX1多克隆位点 ,构建重组质粒 pVAX1-SAG2 ,并转化大肠杆菌JM 10 9,阳性克隆以双酶切与PCR法鉴定。大量提取纯化重组质粒 pVAX1-SAG2 ,5 0 μg肌肉注射小鼠左后腿内侧肌肉 ,3周后加强免疫一次 ;RT-PCR检测SAG2在小鼠肌肉中的转录表达 ,流式细胞仪测定T细胞亚群 ,以速殖子虫体抗原作ELISA测定小鼠血清IgG抗体。结果　真核表达重组质粒 pVAX1-SAG2双酶切鉴定及PCR扩增结果与预期结果相符合。RT -PCR从注射部位肌肉组织总RNA中扩增出SAG2目的基因条带 ;重组质粒 pVAX1-SAG2免疫组CD+ 4 细胞数为 32 .35± 5 .38,显著高于空质粒pVAX1及生理盐水 (NS)二对照组 (P <0 .0 1) ,后二者CD+ 4 细胞数分别为 19.6 5± 4 .2 1与 17.84± 1.5 9;免疫组CD+ 8细胞数为 18.6 7± 2 .37,但与空质粒及NS对照组相比 ,差别不显著 (P >0 .0 5 )。ELISA测定结果显示 pVAX1/SAG2免疫组小鼠血清中出现抗弓形虫特异性IgG抗体。结论　构建成功SAG2真核表达重组质粒 pVAX1-SAG2 ,其能在     

含弓形虫复合抗原基因的真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的 研究弓形虫复合抗原真核表达质粒pcDNA3．1-P30-P22-CTXA2/B在哺乳动物细胞中的表达情况。方法利用脂质体介导的转染技术，将真核表达质粒pcDNA3．1-P30-P22-CTXA2／B和空载体pcDNA3．1分别转染Hela细胞，400μg／ml G418加压筛选和200gg／ml G418维持筛选，获得稳定转染的Hela细胞。采用SDS-PAGE和Western-blot方法对复合基因P30P22-CTXA2／B的表达产物进行鉴定。结果SDS-PAGE结果显示，重组质粒转染Hela细胞后的表达产物分子质量单位为64ku，Western blot显示此蛋白条带能被抗P30抗体识别。结论构建的真核表达质粒pcDNA3，1-P30-P22-CTXA2／B能在哺乳动物细胞中成功表达插入基因所编码的融合蛋白，为进一步动物实验提供了实验依据。     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒     

弓形虫表面抗原SAG1基因自杀性DNA疫苗的构建及免疫原性检测

目的 构建表达弓形虫表面抗原SAG1的自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1并检测其免疫原性。方法 以弓形虫RH株基因组DNA为模板,PCR扩增SAG1基因(GenBank No.HM776940.1),克隆至甲病毒复制子载体pDREP-eGFP中替换原有的eGFP基因,菌液PCR、双酶切及测序鉴定重组质粒。重组的自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1经股四头肌注射并联合瞬时电穿孔免疫BALB/c小鼠,同时以原质粒pDREP-eGFP作为对照组,间隔3周后以相同条件再免疫1次,收集小鼠血清,以弓形虫裂解抗原Western blotting检测其诱导产生的特异性抗体。结果 从弓形虫基因组中PCR扩增得到1 011 bp长度的SAG1基因,成功构建重组质粒pDREP-SAG1。Western blotting结果显示,重组质粒免疫的小鼠血清能特异性地识别虫体抗原中的SAG1抗原。结论 成功构建了弓形虫自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1,能诱导小鼠产生特异性的抗体,具有免疫原性。     

弓形虫微线体蛋白MIC2和M2AP真核表达载体的构建

目的构建弓形虫RH株微线体蛋白M2AP和MIC2的真核表达载pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,为建立同时表达MIC2和M2AP蛋白的重组毕赤酵母表达系统,制备重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP奠定基础。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,用Oligo dT-Adaptor引物逆转录合成cDNA。根据已知的弓形虫mic2和m2ap基因序列,采用引物设计软件Primer premier5.0自行设计并合成引物,以cDNA为模板,PCR扩增mic2和m2ap基因,克隆入pMD-19-simple-T载体,经酶切和测序鉴定后回收目的片段,分别插入至pGAPZαA内,构建重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,转化入E.coli DH5α。提取转化菌质粒,进行酶切和测序鉴定。结果 PCR扩增得到的mic2和m2ap基因分别为2 200bp和1 000bp,与预期大小一致。T-A克隆重组质粒pMD19-T-mic2、pMD19-T-m2ap和重组酵母表达质粒pGAPZαA-mic2、pGAPZαA-m2ap经测序鉴定,与GenBank收录的弓形虫mic2基因和m2ap基因序列同源性为100%,重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap构建成功。结论成功构建弓形虫重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,为进一步研究MIC2和M2AP相互作用机制及其免疫保护效应奠定了基础。     

弓形虫表面抗原SAG1 DNA疫苗的构建

目的　构建真核重组表达质粒 pVAX1-SAG1,并探讨其诱导的体液免疫应答。 方法　采用多聚酶链反应技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断 ,并克隆至载体pMD18-T ,经菌落PCR鉴定和测序分析后 ,亚克隆至真核表达载体 pVAX1,构建重组真核表达质粒pVAX1-SAG1,并予菌落PCR和双酶切鉴定。以此为疫苗候选分子免疫小鼠 ,检测其诱导产生的抗体。结果　PCR扩增出SAG1基因的截短型片段 ,其大小约 780bp ;测序的阳性TA克隆除两处发生同义突变外 ,其余序列与原序列一致 ;TA克隆的插入片段被亚克隆到真核表达载体 pVAX1,构建了重组表达质粒pVAX1-SAG1;该质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。 结论　成功构建了弓形虫表面抗原SAG1的DNA疫苗。     

弓形虫GRA1基因核酸疫苗的实验研究

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA1基因的真核重组表达质粒,研究其在Hela细胞中的表达情况及其对动物弓形虫感染的免疫保护作用。方法以弓形虫总RNA为模板,利用设计合成的一对引物,通过RT-PCR方法体外扩增GRA1基因cDNA片段,构建pVAX1-GRA1重组真核表达质粒,并将其转染Hela细胞,验证其在真核细胞中的表达;用pVAX1-GRA1真核表达质粒注射免疫小鼠,通过检测血清特异IgG水平及血CD4+、CD8+细胞百分率并观察弓形虫感染小鼠的存活时间,评价其免疫保护力。结果 PCR扩增出573bp的GRA1开放阅读框,成功构建重组表达质粒pVAX1-GRA1。用间接免疫荧光方法在重组质粒转染后的Hela细胞中检测到特异蛋白,Western blot证实该蛋白具有反应原性,SDS-PAGE检测该蛋白分子质量单位为24ku。用构建的核酸疫苗免疫小鼠,随着免疫次数的增加血清特异性IgG抗体滴度逐渐增加,CD4+与CD8+T淋巴细胞百分率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。弓形虫RH速殖子攻击感染疫苗免疫组小鼠存活时间为(165±23.1)d,PBS对照组、pVAX1对照组分别为(144±16.3)d和(148±16.3)d,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的真核表达质粒pVAX1-GRA1有一定的免疫保护性,为弓形虫基因疫苗的进一步研究奠定了基础。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物，运用PCR方法扩增其基因片段，经克隆至pMDl8-T载体后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（-）而构建重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞，RT—PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确，构建的重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2经PCR、EcoRⅠ／HindⅢ双酶切和测序鉴定正确；转染GRA2基因的细胞，RT—PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-GRA2，为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。