复式PCR检测间日疟原虫和恶性疟原虫的现场应用

目的探讨复式PCR方法在疟疾诊断中的现场应用价值。方法根据疟原虫18 S rRNA基因序列,合成疟原虫属特异性上游引物和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物,优化PCR反应体系,建立在同一PCR反应体系中同时检测间日疟原虫、恶性疟原虫基因组特异性DNA片段的疟疾诊断方法,并评价其现场应用价值。结果间日疟原虫和恶性疟原虫基因组DNA经过复式PCR后,分别扩增出1 451 bp和833 bp的特异性条带,而伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫及健康人血样均无扩增带出现,用该反应体系可检出原虫血症为1.1×10-6和5.6×10-7的间日疟原虫和恶性疟原虫感染。与镜检法相比,复式PCR检测119份现场样本,112份与镜检结果相同,阳性率为54%,漏诊率为0.8%,误诊率为0,而镜检法依次分别为53%、1.7%和3.4%。结论复式PCR方法检测疟原虫具有简便、快速、特异、敏感等优点,在疑似病例的鉴别诊断和分子流行病学调查中具有良好的应用价值。     

镜检、抗原检测和核酸检测方法在疟疾诊断中的应用比较

目的 比较镜检、抗原检测(RDT)和核酸检测(PCR)三种方法对疟原虫的检测效果,为基层选择合适的 诊断方法提供依据。 方法 收集腾冲市 2015-2018 年发热病人的血样进行疟疾检测,以确诊结果为标准,对比分析镜检、RDT 和 PCR 三种疟疾检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值等指标。 结果 610 份血样中,阴性 295 份,阳性 315 份,其中恶性疟 67 份、间日疟 245 份、混合感染 2 份、三日疟 1 份。 与确诊结果比较,镜检、RDT 和 PCR 的灵敏度分别为 95. 87%、94. 60%和 99. 37%,特异度均为 100%;假阴性率分别为 4. 13%、5. 40%和 0. 63%,阴性预 测值分别为 95. 78%、94. 55%和 99. 33%;假阳性率均为 0,阳性预测值均为 100%;三种方法与确诊结果的总符合率分别 为 97. 87%、97. 70%和 99. 67%,Kappa 检验结果显示均与确诊结果高度一致(P 均<0. 001);对单一虫种恶性疟的检测, 镜检、RDT 和 PCR 的符合率分别为 88. 06%、100%和 97. 01%;对其他三种疟原虫检测的符合率,分别为 97. 97%、 93. 9%和 100%。 结论 三种检测方法均具有较高的敏感性和特异性,但综合考虑当前防治工作实际,抗原检测(RDT) 更适宜在基层推广和使用。     

荧光定量PCR在疟疾实验室诊断中的应用

分别采用镜检、巢式PCR和荧光定量PCR等3种检测方法对收集到的79份疟疾血样进行检测,并对检测结果进行比较分析。结合患者临床症状和3种检测结果, 79份血样最终确诊74份为疟原虫阳性,阳性率为93.7%(74/79),其中镜检阳性检出率为82.3%(65/79),巢式PCR阳性检出率为82.3%(65/79),荧光定量PCR阳性检出率为93.7%(74/79),荧光定量PCR阳性检出率高于其他两种方法(P 0.05)。镜检和巢式PCR的一致率为78.4%(58/74),镜检和荧光定量PCR的一致率为63.5%(47/74),巢式PCR和荧光定量PCR的一致率为83.8%(62/74)。相比镜检和巢式PCR,荧光定量PCR敏感性和检出率更高,且用时更短。     

贵州省县级和省级疟疾诊断实验室检测结果比较分析

贵州省省级疟疾诊断实验室通过PCR法和镜检法对各县级疟疾诊断实验室上报的疟疾网报病例进行复核,以PCR和镜检一致的结果作为判定依据,对县级疟疾诊断实验室镜检结果进行评价。共对89份血样进行复核,PCR检出24份阳性,15份为恶性疟原虫,7份为间日疟原虫,2份为卵形疟原虫,均为输入性病例;省级镜检和PCR结果一致的有21份。县级与省级检测结果的总符合率为79.8%(67/84),县级漏检率为9.5%(2/21),误检率为23.8%(15/63),两级实验室检测的Kappa值为0.6,属于中、高度一致。     

2017-2019年上海市各区疟疾实验室检测能力分析

目的上海市疾病预防控制中心(简称上海市疾控)对各区疾控送检的疟疾病例血样进行复核,并对复核结果进行分析,为进一步提升各区疾控疟疾诊断水平提供依据。方法 2017—2019年上海市疾控通过镜检和疟原虫核酸检测(巢式PCR)分别对各区疾控疟疾实验室送检的血涂片和血样进行复核。以市疾控结果为标准,分析各区疾控疟疾实验室镜检和疟原虫核酸检测的符合率,以及核酸检测敏感性和特异性。并于2019年对各区疾控进行了一次疟原虫核酸检测盲样考核。结果 2017—2019年区疾控共送检疟疾复核病例样品232份,其中完整的样品225份(同时具备血涂片和血样),完整率99.1%(225/227)。225份完整的样品中,金山区占44.0%(99/225),静安区占15.6%(35/225),浦东新区占7.6%(17/225),虹口区占6.7%(15/225),青浦区和崇明区较少,分别为0份和1份,其余各区送样量均占比6.0%以下。225份样品中,区疾控与市疾控的镜检总符合率、阳性符合率和阴性符合率分别为96.0%(216/225)、 98.8%(170/172)和86.8%(46/53),疟原虫核酸检测的符合率为88.8%(103/116)。区疾控疟疾核酸检测采用实时荧光PCR (qPCR)法,敏感性为76.6%(85/111),与市疾控巢式PCR法87.4%(97/111)的敏感性差异有统计学意义(P 0.05);市区两级疾控的两种核酸检测方法的特异性均为100%。上述2种检测方法对225份样品进行综合评价,区疾控的符合率为96.9%(218/225);误判率3.1%(7/225),其中定性错误5份,定种错误2份。2019年,市疾控对区疾控进行的疟疾核酸盲样考核的总正确率为97.5%(78/80),其中恶性疟原虫样品的正确率为94.1%(32/34),与间日疟、卵形疟、三日疟原虫和阴性样品的正确率差异均无统计学意义(P 0.05)。结论 2017—2019年上海市各区疾控疟疾实验室的镜检能力较强,但疟原虫核酸检测的敏感性尚待提高。     

巢式PCR法在疟疾检测及虫种鉴别中的应用

根据疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸(SSU rRNA)基因序列设计疟原虫通用型和种特异性的引物,对60份血样进行巢式PCR检测及虫种鉴定,并与血样的吉氏染色镜检结果进行比较。巢式PCR检出40份疟原虫阳性血样,其中22份为恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)阳性、13份为间日疟原虫(P.vivax)阳性、3份为恶性疟原虫和间日疟原虫混合感染、1份为卵形疟原虫阳性(P.ovale)、1份未能分型。与镜检结果一致的血样为46份,占76.7%(46/60),其中恶性疟原虫阳性18份、间日疟原虫阳性11份和阴性17份。将两种检测结果不一致的血样进行扩增片段序列测定和实时荧光PCR分析,检测结果均与巢式PCR结果一致。卵形疟原虫阳性血样扩增片段的序列分析结果显示,该序列与卵形疟原虫SSU rRNA基因序列(GenBank登录号DQ845247)的对应部分同源性为100%,证实该病例为输入性卵形疟原虫感染病例。     

1例国内罕见的输入性卵形疟的实验室检测

目的对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法制备疑似疟疾患者血样的血涂片,吉姆萨染色后进行疟原虫的镜检观察。利用实验室自行研制的疟原虫属特异性（通用型）和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和实时荧光PCR检测方法,对该血样进行疟疾检测及分型。将PCR扩增片段进行序列测定,并与已知的卵形疟序列进行blast比对分析。结合血样的分子生物学检测结果,重新对镜检结果进行复核。结果血样初次镜检为疟疾阴性。使用疟原虫巢式PCR通用引物对血样的DNA进行PCR检测,扩增出了预期大小约240bp的条带;巢式PCR分型检测表明,血样仅扩增出预期大小约450bp的卵形疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和三日疟扩增条带产生。疟原虫通用型和卵形疟特异性的荧光PCR检测结果均为典型的S形阳性曲线,卵形疟扩增片段的熔解温度为72.5℃。序列分析表明,扩增片段长度为434bp,blast比对发现去除引物后的393个碱基与GenBank DQ845247等卵形疟的SSU rRNA对应部分的基因序列同源性为100%。重新对血涂片进行镜检复核,结果在薄血膜中发现了卵形疟的环状滋养体,被寄生的红细胞为椭圆形,边缘呈伞矢状。结论使用巢式PCR、实时荧光PCR、序列分析和镜检等方法,证实该例输入性的疑似疟疾患者为卵形疟原虫感染。     

捕获和连接探针PCR与巢氏PCR检测疟原虫效果的比较

目的了解捕获与连接探针PCR(CLIP-PCR)对疟原虫的确认诊断效果。方法云南省疟疾诊断参比实验室提供的血涂片镜检阴性和阳性者滤纸血样各70份,分别进行盲法CLIP-PCR和巢氏PCR检测,以巢氏PCR为金标准评价CLIP-PCR的检测效果及检测耗时,血样梯度稀释后测定CLIP-PCR最低检出阈值。结果检测140份血样,2种PCR检出假阳性和假阴性各1例,CLIP-PCR检测疟原虫的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断准确度均为98.57%,kappa值为0.97;CLIP-PCR耗时13.91 h,较巢氏PCR耗时23.47 h缩短40.73%;梯度稀释后重复检测8次,≥3.2个虫/μl血检出率100%,0.32个虫/μl血检出率50%。结论 CLIP-PCR检测疟原虫效果与巢氏PCR相同,重复性良好,更适用于大规模人群筛查。     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的 评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。方法 采集海南省疟疾混合感染流行区304份滤纸干血滴样本，根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列，设计合成3条引物．采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段，检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA；同时与镜检法进行比较。结果 在304份样本中，PCR法阳性15份，其中间日疟7份．恶性疟8份；镜检法阳性11份，其中间日疟6份，恶性疟5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性；镜检阴性而PCR阳性的4份样本，其扩增产物经限制性酶切鉴定，证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。结论 此PCR检测体系灵敏、特异．对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

老挝丰沙里省岳乌县疟疾流行情况调查

目的调查老挝丰沙里省岳乌县疟疾流行情况,为当地消除疟疾措施的制定提供依据。方法选取老挝丰沙里省岳乌县Loum村,采用诱蚊灯采集蚊虫,采用巢氏PCR方法检测疟疾主要媒介按蚊感染疟原虫子孢子;采集岳乌县当地居民滤纸血,采用巢式PCR法检测疟原虫感染情况。结果共捕获按蚊9种1 735只,其中,中华按蚊占捕获按蚊总数的87.67%(1521/1735),属于当地优势按蚊蚊种,密度为31.69只/(灯·夜)。中华按蚊间日疟子孢子阳性率0.52%(7/1340),微小按蚊间日疟子孢子阳性率75%(3/4)。当地健康人群疟原虫带虫率0.23%(1/433)。结论老挝岳乌县疟疾媒介种类丰富,疟疾带虫率较高,健康人群有疟原虫感染,存在疟疾暴发或流行风险,建议当地卫生部门加强对疟疾媒介及病例的监测。     

上海市1例输血性三日疟病例的实验室检测分析与诊断

目的 目的 对1例感染源不明的三日疟病例进行实验室检测分析并确诊。 方法 方法 收集该病例的临床资料, 并进行流行病学调查。对患者及其供血者的血样进行血涂片病原学检查、 疟疾快速诊断检测 （RDT） 和巢式PCR检测, 并对阳性结果进行测序比对。 结果 结果 该患者无疟疾流行区居留史和既往疟疾感染史, 有外科手术时大量输血史。外周血涂片镜检查见三日疟原虫。流行病学调查显示, 该患者接受了3位供血者的血液, 但3位供血者血样经血涂片镜检、 RDT和巢式 PCR检测均未查见疟原虫, 后经改进的巢式?多重PCR检测及结果测序比对后显示, 与其中1名非洲籍留学生供血者的阳性扩增条带具100%同源性。 结论 结论 该病例因输血而感染三日疟。实验室检测疟疾疑难病例需经多方法验证方可确诊, 改进的巢式?多重PCR方法对低密度疟原虫感染有较好的检测效果。     

A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies.

A nested polymerase chain reaction (PCR) assay that uses Plasmodium genus-specific primers for the initial PCR (nest 1) amplification and either genus- or species-specific primers for the nest 2 amplifications was tested on laboratory and field samples. With in vitro cultured Plasmodium falciparum-infected blood samples, it was capable of detecting six parasites/microl of blood using DNA prepared from 25-microl blood spots on filter paper. The assay was evaluated on fingerprick blood samples collected on filter paper from 129 individuals living in a malaria-endemic area in Malaysia. Malaria prevalence by genus-specific nested PCR was 35.6% (46 of 129) compared with 28.7% (37 of 129) by microscopy. The nested PCR detected seven more malaria samples than microscopy in the first round of microscopic examination, malaria in three microscopically negative samples, six double infections identified as single infections by microscopy and one triple infection identified as a double infection by microscopy. The nested PCR assay described is a sensitive technique for collecting accurate malaria epidemiologic data. When coupled with simple blood spot sampling, it is particularly useful for screening communities in remote regions of the world.     

套式PCR扩增特定SSU rRNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrRNA）基因为靶基因,选用1对疟原虫属特异性引物和4对种特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp、102bp和115bp预期大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％。并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.f.和P.m.的混合感染病例。结论本系统特异、灵敏、稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

检测肺孢子菌巢式PCR方法的建立及其敏感性和特异性研究

目的建立检测肺孢子菌基因的特异性mtLSU巢式PCR方法,研究其在实验动物肺孢子菌感染模型的检测效果及其敏感性和特异性,以期为临床提供检测肺孢子菌定植或感染的新方法。方法依据肺孢子菌线粒体大亚基保守序列设计巢式PCR内、外引物,建立并优化检测肺孢子菌基因的巢式PCR体系。以免疫抑制诱导肺孢子菌感染大鼠模型为检测对象,比较mtLSU巢式PCR与六亚甲基四胺银（GMS）染色法检测肺孢子菌的阳性率及符合率。对阳性标本进行DNA纯化,构建分子克隆,采用倍比稀释法检测mtLSU巢式PCR的敏感性;以呼吸道感染常见的8种病原体（光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、白色念珠菌、克柔假丝酵母菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、支原体）为对照,检测方法的特异性。结果肺印片GMS染色镜检实验组大鼠,14只查到肺孢子菌包囊,检出率为70.0%（14/20）,对照组检出率为0（0/20）。用mtLSU巢式PCR均能检测实验组大鼠肺孢子菌基因,阳性率为100%（20/20）,对照组均为阴性。mtLSU巢式PCR法阳性率与GMS染色法比较差异有统计学意义（P〈0.05）。敏感性检验结果表明,mtLSU巢式PCR检测最小量为366fg的肺孢子菌基因。特异性检测显示,其他8种呼吸道常见病原体的mtLSU巢式PCR的扩增结果均为阴性。结论成功建立了检测肺孢子菌基因的mtLSU巢式PCR方法,动物模型检测结果表明该方法的敏感性高、特异性强,有望应用于临床患者标本中肺孢子菌的基因检测。     

2014-2020年四川省疟疾诊断参比实验室病例复核结果分析

目的 对2014-2020年四川省疟疾报告病例检测结果进行复核,评价四川省疟疾诊断参比实验室疟疾诊断能力.方法 对2014-2020年四川省疟疾诊断参比实验室收集的疟疾报告病例血液和血涂片样本采用镜检和巢式PCR法进行复核,对复核结果进行比较分析.结果 2014-2020年四川省疟疾诊断参比实验室累计复核1710例疟疾...     

巢式PCR技术在输入性疟疾监测中的应用

目的评价巢式PCR技术在高疟区回国人员疟疾监测中的应用价值。方法收集2007-2009年自非洲、东南亚等疟疾流行区回国人员中疟疾现症患者及其他无症状高危人群的滤纸血,采用巢式PCR技术检测疟原虫ssRNA基因,并与血片镜检结果进行比对。结果巢式PCR检测53例血检确诊的疟疾现症患者均为阳性,两法的阳性符合率为100%,其中PCR检出恶性疟、间日疟混合感染6例,高于镜检检出的3例。检测疟疾流行区返回的高危人群157人,镜检阳性3例,阳性率1.91%;巢式PCR阳性5例,阳性率为3.18%;其中,镜检阳性、巢式PCR阴性的1例,镜检阴性、巢式PCR阳性的3例,两种方法的阳性符合率为66.7%,阴性符合率为98.1%,两法检测结果一致的血样占检测血样的97.5%。结论巢式PCR技术对输入性疟疾的监测具有实用价值。     

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的　采用套式 PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。　方法　采用已建立的套式 PCR系统扩增 SSU r DNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的 6份血样 ,并设阳性与阴性对照。　结果　间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出 10 4 bp、10 2 bp和 115 bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫 DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。 6份血样中检出 4份 P.v.、P.f.和 P.m.的混合感染 ,1份 P.v.和 P.f .及 1份 P.f .和 P.m.的混合感染。　结论　该系统特异、灵敏、稳定 ,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染 ,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。     

Identification of human malaria parasites and detection of mixed infection in Thai patients by nested PCR

The species-specific nested PCR previously described by Snounou and others, for detecting the four species of human malaria parasites, is evaluated in the current study testing 40 blood samples from malaria patients admitted during July-September, 2003, at the Hospital for Tropical Diseases, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Thailand. Parasite DNA of each blood sample was extracted and purified by QIAamp. DNA mini kit. Nested PCR was performed using genus-specific primers for the first PCR cycle and species-specific primer for the second cycle. Thin and thick smears were also made, stained with Giemsa, and examined by expert microscopists. Only one of 40 samples (2.5%) was identified as Plasmodium malariae infection by both microscopy and nested PCR. Twenty blood samples (50%) were identified as Plasmodium falciparum infections by both methods. However, 19 blood samples (47.5%) were reported as Plasmodium vivax infections by microscopic methods, whereas nested PCR could detect a mixed infection of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum in one sample taken from a young girl with 8 ameboid trophozoites of P. vivax per 200 white blood cells. These results demonstrated that the nested PCR assay surpasses microscopy and also offers a clear advantage in the detection of mixed infections, which is important not only for successful medical treatment, but also for the study of malaria epidemiology.     

山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的鉴定

目的 对山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种进行鉴定分析。方法 收集14例输入性疟疾病例,进行快速疟疾诊断试纸条检测(RDT)、血涂片镜检、NP-1993常规巢式PCR鉴定和卵形疟原虫wallikeri(P. ovale wallikeri)亚种的特异性PCR检测。PCR扩增产物测序后,进行Blast比对分析。结果 14例患者RDT检测结果:泛疟原虫(非恶性疟)阳性12例,阴性2例;镜检结果,13例卵形疟原虫,1例间日疟原虫;NP-1993常规巢式PCR结果,14例样本4种疟原虫引物扩增结果均为阴性。P. ovale wallikeri亚种的特异性PCR检测结果:14例样本均能扩增到P. ovale wallikeri亚种特异性条带780 bp。Blast分析测序结果,检索结果为P. ovale wallikeri亚种。结论 14 例镜检阳性、NP-1993常规巢式PCR检测阴性的输入性疟疾病例均确诊为P. ovale wallikeri亚种感染。     

Informed decision-making before changing to RDT: a comparison of microscopy, rapid diagnostic test and molecular techniques for the diagnosis and identification of malaria parasites in Kassala, eastern Sudan

Objectives Rapid diagnostic tests (RDTs) are promoted for the diagnosis of malaria in many countries. The question arises whether laboratories where the current method of diagnosis is microscopy should also switch to RDT. This problem was studied in Kassala, Sudan where the issue of switching to RDT is under discussion. Methods Two hundred and three blood samples were collected from febrile patients suspected of having malaria. These were subsequently analysed with microscopy, RDT (SD Bioline P.f/P.v) and PCR for the detection and identification of Plasmodium parasites. Results Malaria parasites were detected in 36 blood samples when examined microscopically, 54 (26.6%) samples were found positive for malaria parasites by RDT, and 44 samples were positive by PCR. Further analysis showed that the RDT used in our study resulted in a relatively high number of false positive samples. When microscopy was compared with PCR, an agreement of 96.1% and k = 0.88 (sensitivity 85.7% and specificity 100%) was found. However, when RDT was compared with PCR, an agreement of only 81.2 and k = 0.48 (sensitivity 69% and specificity 84%) was found. Conclusion PCR has proven to be one of the most specific and sensitive diagnostic methods, particularly for malaria cases with low parasitaemia. However, this technique has limitations in its routine use under resource‐limited conditions, such as our study location. At present, based on these results, microscopy remains the best option for routine diagnosis of malaria in Kassala, eastern Sudan.