WCG空肠/结肠弯曲菌无血培养基的研究

本研究的WCG无血培养基与Camp-BAP含血培养基同时进行对已知空肠/结肠弯曲菌的培养计数及599份来自鸡和人类粪便标本中空肠/结肠弯曲菌的分离培养试验,结果表明13株已知空肠/结肠弯曲菌在WCG培养基上生长的菌落数(CFU/ml)、菌落形态、菌体特征和生化特性及5次共599份来自鸡和人类粪便标本分离培养取得与Camp-BAP培养基一致或较优的效果。为此,我们认为WCG无血培养基可代替Camp-BAP含血培养基用作培养分离空肠/结肠弯曲菌。     

应用无血培养基培养分离空肠弯曲菌的效果观察

用无血培养基与Skirrow氏含血培养基同时进行已知空肠弯曲菌的培养及鸡粪便标本中空肠弯曲菌的分离试验。结果,三株已知菌在两种培养基上生长的菌落数、菌落形态、菌体特征和生化特性基本一致;118份鸡粪便标本,用无血培养基分离阳性者为65例,用Skirrow氏含血培养基分离阳性者为63例,两者阳性符合率为85.5％。     

二重荧光定量PCR检测鼠疫菌应用评价

目的建立一种基于Taqman探针的二重荧光定量PCR检测鼠疫菌方法,并进行应用评价。方法对收集的标本进行二重荧光定量PCR和鼠疫细菌学检测,然后进行统计分析。结果在209份样品中,二重荧光定量PCR检出鼠疫菌核酸阳性40份(19.14%),鼠疫菌分离培养检出阳性32份(15.31%),两种方法关联性有统计学意义(χ2=153.53,P0.01),优势差异也有统计学意义(χ2=6.13,P0.05)。结论本实验室所建立的二重荧光定量PCR检测鼠疫菌明显优于鼠疫菌分离培养,且操作简单、实验时间短,可作为鼠疫早期快速诊断方法。     

肉鸡屠宰加工生产链中弯曲菌污染状况及耐药性分析

目的 了解江苏某肉鸡屠宰加工厂不同环节弯曲菌的污染状况及耐药现状。方法 采集屠宰前肉鸡泄殖腔、不同环节鸡酮体以及环境等样品,运用无血弯曲杆菌选择性培养基(modified charcoal-cefoperazone-deoxycholate agar,CCDA)平板法进行分离纯化,PCR鉴定后,采用K-B法测定6大类14种抗生素耐药情况。PCR检测弯曲菌Ⅰ型整合子、四环素耐药基因tet(O)、氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3以及弯曲菌gyrA基因第257位碱基的突变情况。结果 细菌分离结果显示170份样品分离到124株弯曲菌(72.95%)。分离株对链霉素、妥布霉素、卡那霉素、环丙沙星、氧氟沙星、萘啶酸、红霉素和四环素耐药率为100%,多重耐药现象普遍,多重耐药率高达100%,其优势耐药谱主要为CTX-CRO-cDA-K-NOR-S-AZM-CIP-TE-NA-E-LEV-ENR-TOB。分离株经PCR扩增未检测到Ⅰ型整合子,所有菌株在gyrA喹诺酮类耐药决定区发生了C-257-T点突变,tet(O)基因和aadE-sat4-aphA-3检出率分别为100%和90.23%。结论 江苏某肉鸡屠宰加工生产链中弯曲菌污染及耐药情况比较严重,gyrA基因突变、tet(O)基因及aadE-sat4-aphA-3耐药基因簇的携带,与弯曲菌对喹诺酮类、四环素类和氨基糖苷类耐药密切相关。     

北京市顺义区零售生猪肉中小肠结肠炎耶尔森菌的检测与病原特征分析

目的 获得北京市顺义区零售市场生猪肉中小肠结肠炎耶尔森菌的分布及病原特征。方法 采集样本,应用细菌增菌培养并同时对增菌液进行荧光PCR预筛查的方法检测小肠结肠炎耶尔森菌。对于鉴定阳性菌株应用传统PCR及多重荧光PCR方法分析5种毒力基因的分布特征。应用肉汤稀释法获得分离菌株的耐药特征并应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行菌株分子分型。结果 70份样本中19份增菌液foxA基因实时荧光PCR筛查阳性,阳性率为27.14%(19/70)。19份foxA筛查阳性标本培养获得小肠结肠炎耶尔森菌。19株菌对头孢唑啉、氨苄西林、头孢西丁、氨苄西林/舒巴坦耐药率分别为97.74%、84.21%、47.39%和42.11%,其携带毒力基因特征均为ail-/ystA-/ystB+/yadA-/virF-。17株菌完成PFGE检测并被分为15种带型。结论 针对增菌液进行荧光PCR预筛查,可提高食品样本中小肠结肠炎耶尔森菌分离培养的检出率。菌株毒力基因的荧光PCR组合检测可快速获得分离菌株的毒力特征。本次研究中分离自本地区零售生猪肉中的小肠结肠炎耶尔森菌未发现显著遗传聚集性特征。     

一起不明原因群体性肺部感染的病原体分离及鉴定

目的调查了解一起不明原因群体性肺部感染的病原菌。方法通过流行病学分析,运用荧光定量PCR、ELISA、胶体金、VITEK2生化鉴定以及MALDI-TOF-MS飞行时间质谱技术对可疑菌进行鉴定,并将分离到的可疑菌与病例血清进行凝集试验。结果从环境标本中分离到2株浅白隐球菌,并与病例血清发生特异性凝集。结论此次肺部感染可能与浅白色隐球菌感染有关。     

细菌核酸提取方法对荧光定量PCR检测差异分析

目的 观察和分析常见食源性病原菌及粪便中病原菌DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果的影响。方法 以弯曲菌、副溶血弧菌和沙门菌为模型菌株,分别采用水煮法、细胞裂解法、试剂盒法(过滤法和磁珠法)提取病原菌DNA并进行荧光定量PCR检测并对试验结果作差异比较分析;应用细胞裂解法和过滤法分别提取24份随机抽样的粪便标本DNA,针对细菌16SrDNA特异序列进行荧光定量PCR检测,比较2种DNA提取方法对于病原菌检测结果的差异性。结果 在不同菌种、不同浓度的条件下,细胞裂解法提取细菌纯培养物DNA的Ct值均低于其他三种方法(P0.05),水煮法、过滤法、磁珠法的Ct值之间的比较结果呈现多样性。细胞裂解法提取粪便标本的病原DNA为模板进行细菌16S rDNA特异序列的荧光定量PCR检测结果阳性18份,阴性6份,试剂盒过滤法提取24份粪便标本检测结果皆为阳性。结论 在对纯培养的3种食源性病原菌进行荧光定量PCR鉴定时,为节省时间和成本可应用细胞裂解法或水煮法提取模板DNA,与2种商业试剂盒(过滤法和磁珠法)相比效果较好;对粪便标本病原菌进行荧光定量PCR检测时,试剂盒提取粪便标本病原DNA的扩增效果优于细胞裂解法。     

探讨荧光定量PCR在结核菌检测中的应用

目的探讨荧光定量PCR技术在检测临床标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法通过荧光定量PCR技术鉴定350株临床分离株，进行结核分枝杆菌的菌种鉴定和定量分析，同时进行抗酸染色和培养法。结果荧光定量PCR、染色和培养法阳性检出率分别为38．8％（128／330），21．8％（72／330），29．7％（98／330），提高阳性检出率（涂阴）16．97％（56／330），菌种鉴定特异性实验符合率为100％。结论荧光定量PCR技术是一种快速、敏感、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法。     

肉鸡源弯曲菌的分离、多重PCR鉴定及其耐药性分析

目的了解肉鸡屠宰加工过程中弯曲菌的污染及其耐药情况。方法根据GB4789．9-2008,采用增菌培养、选择性平板分离、生化鉴定从肉鸡屠宰过程中分离疑似弯曲菌,并以弯曲菌属的16s球NA、空肠弯曲菌的Hip0和结肠弯曲菌的CeuE为靶基因,采用三重PCR方法对疑似菌株进行鉴定。采用琼脂稀释法对弯曲菌阳性菌株进行8种常用抗生素的药敏试验,参考CLSI标准（2010）判定药敏结果。结果根据形态特征、生化指标及PCR鉴定结果,从651份样品中,鉴定出空肠弯曲菌160株、结肠弯曲菌130株,其他弯曲菌11株,弯曲菌总分离率为46．24％;其中屠宰前、屠宰过程中及屠宰后鸡肉中弯曲菌的污染率分别为56．10％、31．00％、17．00％,可能存在由屠宰前向屠宰后传播趋势。药敏试验表明,弯曲菌对环丙沙星、左氧氟沙星、四环素和林可霉素的耐药率较高,分别为93．02％、87．71％、87．71％、80．07％,对庆大霉素、红霉素、链霉素、氟苯尼考的耐药率分别为67．11％、49．50％、31．89％、13．29％。结论肉鸡屠宰过程中弯曲菌的污染及其耐药情况较为严重,应该加强卫生和抗生素使用监督。     

空肠弯曲菌hipO基因的Real-time PCR检测研究

目的建立基于新型Taqman荧光探针的荧光实时(Real-time)PCR方法用于空肠弯曲菌的筛选检测与快速鉴定。空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是近十几年来在世界范围内广泛重视的人畜共患病原菌,可以导致人类的急性肠炎与食物中毒,并能引发格林-巴利综合征等并发症。为更好地利用分子生物学技术对空肠弯曲菌进行快速、准确的基因检测,本研究从样品增菌液与单菌落中提取细菌DNA,建立了针对空肠弯曲菌特异的hipO(hippuricase,马尿酸酶)基因的Real-time PCR方法,用于空肠弯曲菌的快速筛选检测与可疑菌落快速鉴定。试验结果表明,该方法检测细菌的灵敏度为1~10CFU,人工布菌鸡肉的检测灵敏度为1~10CFU。本研究所建立的空肠弯曲菌荧光实时PCR方法具有准确、可靠、快速的特点。     

Characterization of Salmonella isolated in Okinawa, Japan

Salmonella enterica strains isolated in Okinawa between 1995 and 2005 were analyzed with respect to their serovars and antimicrobial susceptibility, and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was used to examine their digestion patterns. A total of 1,071 isolates, including 610 from humans, 358 from animal rectal swabs and 103 from meat obtained at grocery stores, were examined. The first 3 most frequent serovars in human isolates were Enteritidis, Weltevreden and Bareilly, together accounting for 65% of the isolates. In isolates from the rectal swabs of laying hens, the predominant serovars were Albany, Saintpaul and Aarhus, accounting for 82% of the isolates. In broilers, 123 of 124 isolates belonged to serovar Infantis, which reflected the high ratio of this serovar in the chicken sold at grocery stores. An antibiogram of human isolates was different from that of broilers and chicken. Chromosomal DNAs of S. Infantis isolated from humans and from the rectal swab of broilers and chickens were examined by PFGE using the restriction enzymes XbaI and BlnI. The digestion patterns of human isolates were not coincident with those of the isolates from the rectal swab of broilers and chicken-meat samples.     

贵州省首例空肠弯曲菌菌血症病例病原鉴定和亚种分型

目的 对贵州省1例菌血症患儿血液中分离的疑似空肠弯曲菌进行鉴定。方法 运用传统细菌学方法和分子生物学方法,对从菌血症患者血液分离的可疑空肠弯曲菌进行鉴定和亚种分型。结果 来自菌血症患儿血液的可疑菌株,经传统生化鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种,特异性多重PCR方法鉴定为弯曲菌属空肠弯曲菌,NAP-mPCR方法鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种。结论 分离自贵州省菌血症患儿血液的菌株确认为空肠弯曲菌空肠亚种,NAP-mPCR方法可将空肠弯曲菌鉴定到亚种水平。     

猪源弯曲菌的分离鉴定及耐药性分析

目的 为调查猪肠道内空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的流行和耐药性状况。方法 本试验自北京郊区养猪场和屠宰场采集猪肠道粪便样品,经增菌培养后利用三重PCR进行弯曲菌属、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的检测,进而对PCR检测阳性样品进行弯曲菌的分离鉴定,最后对分离鉴定的弯曲菌分离株进行药敏试验鉴定。结果 本试验共采集猪肠道和肛门棉拭子样品241份,PCR检测结肠弯曲菌阳性样品数为178份,阳性率为73.9%,而空肠弯曲菌阳性样品数5份,阳性率仅为2.1%。经分离鉴定后共获得结肠弯曲菌菌株63株,分离率为35.4%,未分离获得空肠弯曲菌菌株。对26种抗生素的药敏试验结果显示结肠弯曲菌分离株对氯霉素(100%)、丁胺卡那(93.65%)、强力霉素(91.48%)、庆大霉素(82.54%)和阿莫西林(82.54%)等抗生素比较敏感,而对头孢哌酮(100%)、 头孢氨苄(100%)、头孢拉啶(100%)、头孢唑啉(98.41%)、头孢克肟(92.06%)、萘啶酸(92.06%)、链霉素(90.48%)、环丙沙星(90.32%)、诺氟沙星(88.89%)和青霉素(87.30%)具有显著的耐药性;而且分离株多重耐药现象比较普遍,主要集中于14-20耐。结论 本试验结果显示猪肠道内普遍存在结肠弯曲菌,而且菌株对多种抗生素产生了显著的耐药性。     

Detection of Campylobacter in duck using standard culture method and multiplex polymerase chain reaction

In 2005, total of 140 samples of duck meat and intestine from slaughterhouses in Nakhon Pathom Province, Thailand, were analyzed for Campylobacter spp. Twenty-eight samples (20%) were positive for Campylobacter spp using the standard culture method (SCM) with 21 samples of C. jejuni and the other 7 C. coli. Forty-four samples (31%) were positive using multiplex polymerase chain reaction, with 34 samples of C. jejuni and 10 of C. coli. This is the first report of Campylobacter contamination in duck in Thailand.     

多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因

目的为了判定霍乱弧菌是否携带相关毒力因子,研发一种快速、准确、特异检测霍乱弧菌3种毒素基因的多重荧光定量PCR方法。方法针对霍乱弧菌ctxA、ace、zot基因设计引物和探针,建立PCR体系,对70株霍乱弧菌分离株进行鉴定,采用直接测序方法对鉴定结果进行验证。结果建立的多重实时荧光定量PCR方法可同时准确、特异地鉴定霍乱弧菌菌体携带的3种毒素基因,不携带毒素基因的菌株均未出现阳性检测结果。菌体检测的最低检出限度ctxA基因：102 CFU/mL,ace基因和zot基因：10CFU/mL。构建了3种毒素相关基因阳性质粒,ace基因和zot基因的最低检出限度为10copies/μL,ctxA基因的最低检出限度为102 copies/μL,定量检测批间和批内的变异系数均小于5%;对70株霍乱弧菌分离株进行评价,结果显示其中40株（57.2%）携带ctxA毒素基因、31株（44.3%）携带ace毒素基因、46株（65.7%）携带zot毒素基因,通过测序方法验证,符合率达到100%。结论本文建立的多重实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性好、灵敏度高,为霍乱弧菌的现场流行病学调查和疫情监测提供了快速、可靠的鉴定工具。     

两种不同方法检测咽拭子标本中肺炎支原体临床诊断价值的比较

应用聚合酶链反应 （PCR）与实时TaqMan荧光定量PCR（Real-time PCR）检测咽拭子标本中的肺炎支原体DNA（Mp-DNA）,比较两种方法检测结果的临床诊断价值。 方法 随机选取临床儿科门诊患儿566例,包括临床治诊Mp感染患儿106例和临床疑似Mp感染患儿460例,分别采用PCR法和实时TaqMan Real-time PCR法检测,以临床治诊Mp作为参照标准,采用 检验评定两种检测方法诊断的灵敏度和特异度,比较两种检测方法对Mp的诊断价值。 结果 566份受检患儿的咽拭子标本中,PCR法检测阳性45例（7.95%） （临床治诊Mp感染患儿5例,临床疑似Mp感染患儿40例）,实时TaqMan Real-time PCR法检测阳性175例（30.92%） （临床治诊Mp感染患儿95例,临床疑似Mp感染患儿80例）。实时TaqMan Real-time PCR法检测咽拭子Mp-DNA诊断Mp感染的敏感度显著高于PCR法（敏感度Real-time PCR 89.62 %,PCR 4.72 %, =146.322, P=0.000, P<0.05）,特异度与PCR法的差异无统计学意义（特异度Real-time PCR 87.61%, PCR 91.30 %, =3.331, P=0.068, P>0.05）。 结论 应用实时TaqMan Real-time PCR法检测咽拭子中的Mp-DNA对儿童Mp感染的诊断价值优于应用PCR法检测咽拭子中的Mp-DNA, 其中应用实时TaqMan Real-time PCR检测对Mp感染患儿的早期诊断有更大的临床价值。     

一起由空肠弯曲菌所致食源性疾病暴发事件的流行病学及病原学溯源分析

目的 对一起空肠弯曲菌所致的食源性疾病暴发事件进行流行病学及溯源分析。方法 对突发事件进行现场流行病学调查,采集粪便样本、环境涂抹样本、食品样本等进行快速PCR检测和病原菌分离。对分离菌株进行PFGE分子分型和全基因组测序分析,并进行药敏试验。结果 从7份病例样本和2份环境涂抹样本中分离出空肠弯曲菌。PFGE分析和cgMLST聚类结果表明其中3份病例样本和环境涂抹样本(蒸柜容器把手涂抹)分离的菌株克隆聚集成簇,ST型别为ST11105;另2份病例样本和环境涂抹样本(刀具砧板涂抹)分离的菌株属同一克隆株,ST型别为ST2031。还有2份病例样本分离的菌株ST型为ST11106和ST7533。药敏结果表明,分离株对四环素类和喹诺酮类耐药率较高,分别为77.8%、55.6%。基因组测序结果发现最多的耐药基因为bla_OXA-193,gyrA、tet(O),其中gyrA基因86位点发生T-I突变。分离株共获得168个毒力基因,涉及多种致病机理。结论 采用快速PCR法、PFGE分子分型技术、全基因组测序技术等可对突发事件进行快速、准确的溯源分析。     

应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的研究

目的 建立并评估快速鉴定结核分枝杆菌复合群（MTBC）与非结核分枝杆菌（NTM）的多重PCR方法。 方法 应用分别针对MTBC的oxyR-ahpC基因间隔区、MTBC和NTM的rpoB基因可变区的3对分枝杆菌特异性引物进行多重PCR扩增,扩增产物分别为473 bp、235 bp和136 bp。应用该多重PCR方法对6株MTBC标准株、50株NTM标准株、312株MTBC临床分离株和300株NTM临床分离株进行了初步菌种鉴定。 结果 经多重PCR 扩增后进行凝胶电泳,MTBC标准株473 bp和235 bp片段均可见,NTM标准株仅见136 bp片段。312株MTBC临床分离株中,310株扩增出473 bp和235 bp片段,敏感度为99.36%（310/312）,特异度为99.32%（294/296）;300株NTM临床分离株中,294株扩增出136 bp片段,敏感度为98.00%（294/300）,特异度为100.00%（310/310）。 结论 该多重PCR方法可检测并鉴别MTBC及NTM,具有高度的特异度和敏感度,有可能作为鉴别MTBC与NTM的有价值的检测手段。     

PCR诊断牛新孢子虫病的初步应用

目的 以犬新孢子虫Nc-5基因为目的基因的PCR诊断方法,检测奶牛流产的胎牛脑组织的新孢子虫。方法 根据GenBank发布的新孢子虫特异性基因片段Nc-5基因序列,设计1对特异性引物,以犬新孢子虫(Neospora caninum)标准株DNA为模板,PCR扩增Nc-5基因,与pMD18-T载体连接,转化大肠埃希菌JM109,获得阳性重组质粒pMD18-T-Nc-5,并测序。以环形泰勒虫、牛巴贝斯虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫以及犬新孢子虫标准株DNA为模板进行扩增以验证PCR的特异性,采用紫外分光光度计测定犬新孢子虫标准株DNA浓度和纯度,取高纯度的DNA样品用灭菌水稀释,分别取不同量的DNA进行PCR扩增,确定PCR方法的敏感性;利用该方法对32份奶牛流产的胎牛脑组织样品进行检测,同时,对其中23份流产的母牛血样进行ELISA血清学检测(作为对照), 以评价犬新孢子虫PCR方法的检测效果。 结果 克隆的犬新孢子虫标准株目的基因大小为350 bp,与GenBank（AY459289）中Nc-5基因序列一致性为98%,建立的犬新孢子虫PCR方法与环形泰勒虫、牛巴贝斯虫、刚地弓形虫和杜氏利什曼原虫均无交叉反应,最低能检测犬新孢子虫DNA 3.125 pg,检测流产胎牛脑组织阳性率为18.8%（6/32）。ELISA检验流产母牛血样抗体阳性率为17.4%（4/23）,这4份阳性样品与其流产胎牛PCR检测结果均为阳性。 结论 建立的犬新孢子虫PCR诊断方法用于检测奶牛流产的胎牛脑组织新孢子虫的感染效果较好。