肠道病毒71型结构蛋白VP1的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌表达系统表达EV71 VP1蛋白并对其抗原性进行初步鉴定;为EV71疫苗研制奠定基础。方法采用PCR扩增EV71 VP1基因2-274aa片段,并将其插入表达载体pET30a（＋）,转化Transetta（DE3）菌株,SDS-PAGE和Western Blot初步分析蛋白表达及抗原性;探讨目的蛋白的最佳表达条件。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,Western Blot证实其抗原性良好;该蛋白的最佳表达条件是37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导表达4 h。结论表达并鉴定了EV71 VP1抗原;本研究为EV71疫苗研制及检测试剂盒的建立奠定了基础。     

肠道病毒71型VP1蛋白研究进展

肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)为手足口病的主要病原体。目前,手足口病的发病机制并不完全清楚,临床上缺乏有效的疫苗及特异性治疗药物。作为EV71主要衣壳蛋白,VP1在EV71的吸附和穿入过程中起着重要作用。另一方面,VP1上存在特异性中和性抗原表位,在EV71疫苗研究中占有重要地位。本文主要概括EV71 VP1结构、功能及与之相关疫苗的研究进展。     

湖北肠道病毒EV71型流行株VP1基因以及蛋白结构特征分析

目的 全面研究和了解2011年湖北省肠道病毒71型的VP1基因及蛋白结构特征,分析EV71型病毒在湖北省的基因型别,探讨该型病毒在全省的地理分布特征。方法 对2011年湖北省8个区市的20株EV71流行株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸序列进行同源性比较及系统进化分析,并对VP1蛋白序列的亲水性、柔韧性等二级和三级结构进行分析。结果 2011年湖北省EV71型流行株的基因亚型为C4a亚型,其VP1区核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性较高,分别为96.5%～98.7%和98.3%～100%。VP1蛋白特征分析发现该区主要免疫表位均没有发生变异且存在较多亲水性区域。二级结构以无规则卷曲为主,其次为β片层。蛋白质同源建模未发现不同毒株间VP1蛋白三级结构差别。结论 2011年湖北省EV71型流行株与我国其它地区的毒株有较高同源性,且存在一定的地理区域聚集性特征和遗传多样性特点。同时综合多种方法预测EV71 VP1的二级结构和三级结构,为进一步研究开发相关药品和防治EV71感染提供理论基础。     

EV71 VP1黏膜疫苗制备及其诱导黏膜免疫的实验研究

摘要：目的研究表面展示肠道病毒71型（EV71）结构蛋白VP1的枯草芽孢杆菌芽孢制备疫苗的可行性及应用价值。方法以表面展示EV71 VP1蛋白的重组枯草芽孢杆菌及野生型同基因株枯草芽孢杆菌制备疫苗,并分别通过灌胃＋滴鼻途径免疫BALB／c小鼠（观察组和对照组各16只）,4周后摘眼球取血,脱臼处死小鼠收集肺泡及小肠冲洗液,采用ELISA方法检测血清、肺黏膜、肠黏膜中VP1特异性IgA抗体水平。结果枯草芽孢杆菌经培养及溶菌酶处理后均以芽孢形式存在;观察组血清及肺黏膜中VP1特异性IgA抗体水平均显著高于对照组（P均〈0．01）,但两组肠黏膜中抗体水平无显著差异。结论展示EV71结构蛋白VP1的枯草芽孢杆菌芽孢可成功制备疫苗,且能有效刺激机体产生特异性黏膜免疫反应;此为EV71疫苗的研制提供了新思路。     

肠道病毒71型VP1蛋白二级结构及B细胞表位的预测

目的预测C4基因亚型肠道病毒71型的VP1蛋白二级结构及B细胞表位,为EV71疫苗研制提供理论基础。方法本研究将宁波地区EV71分离株与国内外EV71代表株进行同源性分析和并构建亲缘进化树。以VP1基因序列为材料,应用EX-PASY服务器上的GOR4、SOPMA两种方法分析预测蛋白质二级结构,并结合蛋白质的亲水性、柔韧性、表面可能性等指标综合评价VP1蛋白的B细胞抗原表位。结果同源性分析和亲缘进化分析得出,2010年宁波EV71分离株属于C4a基因亚型,与基因库检索到的C4a基因亚型代表株核苷酸和氨基酸同源性较高,分别为93.6%～99.3%和98.3%～100%。VP1蛋白二级结构以无规则卷曲和β-片层为主,有多处抗原指数较高的区段,结合亲水性、柔韧性、表面可能性等指标,综合预测VP1蛋白的B细胞抗原表位在第39～40、159～167、212～220、287～290位氨基酸残基的可能性较大。结论 EV71VP1蛋白多个区段具有抗原潜力通过生物信息学方法预测VP1蛋白二级结构及B细胞表位为EV71疫苗研制提供理论基础。     

肠道病毒71型VP1包涵体蛋白的复性与纯化

目的 利用原核表达系统,经优化诱导条件及变、复性将包涵体形式肠道病毒71型结构蛋白VP1进行纯化。方法 通过RT-PCR扩增VP1基因,并应用基因克隆技术将VP1基因与pET-28a原核表达载体连接,之后将重组载体转化至大肠埃希菌Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后对包涵体进行变、复性,采用His镍柱亲和层析对VP1蛋白进行纯化,利用SDS-PAGE和Western blot对VP1蛋白进行分析鉴定。结果 PCR扩增出891 bp的EV71-VP1基因,双酶切鉴定原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1构建正确。重组载体转化DE3后经IPTG诱导表达VP1蛋白,且以包涵体形式存在。将包涵体变、复性,经SDS-PAGE分离后进行镍柱纯化,得到较纯的目的蛋白,Western blot分析该蛋白能被相应抗体识别。结论 构建的原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1转化DE3后经IPTG诱导表达以包涵体形式存在的VP1蛋白,复性后纯化的VP1蛋白具有免疫原性,为EV71 VP1蛋白的研究与开发奠定了基础。     

人肠道病毒71型VP1和VP4的抗原融合表达及鉴定

目的:构建人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)VP1-VP4重组融合蛋白表达体系.方法:构建EV71 VP1-VP4重组融合蛋白原核表达载体转化大肠杆菌DH5α,诱导表达融合蛋白VP1-VP4,SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定.用融和蛋白包被ELISA板检测41例已知血清.结果:重组片段VP1-VP4测序结果与设计目的片段序列相符,重组载体构建成功;SDS-PAGE显示融合蛋白约42.8kDa,与预期值一致;Westernblot提示该融合蛋白可以和EV71 VP1、VP4抗体特异性结合.融合蛋白包被ELISA板能准确检测出41例血清中16例EV71阳性血清,与CA16无交叉反应.结论:表达的EV71 VP1-VP4融合蛋白具有良好的抗原性,可作为EV71感染检测抗原,为EV71诊断试剂和疫苗的研究奠定实验基础.     

2010年福建省肠道病毒71型分离株的基因型特征研究

摘 要:目的 全面研究和了解肠道病毒71型在福建省的遗传背景,分析和探讨肠道病毒71型在我省的基因型地理分布特征及传播特征。方法 对2010年福建省9个设区市的 50株EV71分离株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 2010年福建省50株EV71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891个bp,核苷酸及氨基酸序列同源性比较,50株EV71型分离株之间的VP1区核苷酸序列同源性为95.4%-100%,编码蛋白氨基酸序列同源性为97.3%-100%,与08年阜阳流行株Fuyang17.08-2同源性最高,核苷酸序列同源性为97.1%-99.3%,氨基酸序列同源性为98.7%-100%;VP1区基因遗传进化分析,与Fuyang17.08-2株进化关系较为接近,同属于C4a基因亚型。结论 2010年福建省50株EV71型分离株均属于C4a基因亚型,未产生明显的抗原漂移及变异;福建省及各个地市均分布亲缘关系较近的C4a基因亚型的EV71多传播链病毒,应加强长期动态地监测和分析。关键词:肠道病毒71型;VP1区;基因型特征;     

肠道病毒71型2C蛋白的异源表达及纯化

目的获得高纯度、性状均一的可溶蛋白肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)2C。方法截取2C蛋白的6个包含ATPase/解旋酶等核心结构域的基因片段,分别使用含有His标签和MBP促溶标签的表达载体在大肠埃希菌中进行异源表达,分子筛层析纯化2C蛋白,SDS-PAGE电泳检测表达产物和纯化蛋白。结果成功将EV71 2C蛋白的6个片段进行了克隆表达并纯化,获得了高纯度、性状稳定的可溶蛋白MBP-2C91aa-256aa和MBP-2C118aa-256aa。SDS-PAGE检测2C蛋白纯度达97%以上,分子质量与预期结果一致。纯化的2C蛋白浓度为8.8mg/ml。结论91aa-256aa和118aa-256aa片段的MBP-2C截短蛋白比包含其他片段的截短蛋白性状稳定、均一,MBP标签提高了2C的6个截短蛋白的可溶性。高纯度可溶蛋白的制备为其晶体结构和功能研究奠定了基础。     

克山病患者心肌肠道病毒VP1结构蛋白检测

目的 探讨肠道病毒感染与克山病发病的关系。方法 应用抗柯萨奇B5病毒(Coxsackie B5 virus，CVB5)VP1蛋白单克隆抗体，采用免疫组化方法，检测黑龙江、山东、云南省克山病病区急型、亚急型、慢型、潜在型克山病死亡病例心肌标本83例，风心病10例，冠心病10例，心肌炎21例，扩张型心肌病29例，非病区非正常死亡的正常人10例，病区发病季节非克山病死亡病例13例。结果 克山病83例心肌标本中有74例VP1结构蛋白阳性，阳性率89．2％；风心病、冠心病、非正常死亡健康人VP1阳性检出率均为10％；心肌炎、扩张型心肌病VP1阳性检出率分别为66．7％和70％；病区发病季节非克山病死亡病人VP1阳性检出率为38．5％。结论 来自3省份的各型克山病死亡病例心肌标本中均能检出肠道病毒VP1结构蛋白，克山病的发生与肠道病毒感染高度相关。     

肠道病毒71型VP1基因及蛋白结构与功能的生物信息学分析

目的 分析肠道病毒71型(EV71)VP1基因及其编码蛋白的结构与功能,以指导其生物学功能研究.方法 利用多种生物信息在线分析工具和分析软件包分析EV71 2008-GZCH07株VP1基因及编码蛋白与其他EV71代表株的序列,进行多序列同源比对,并构建分子进化树.预测该基因编码的蛋白质理化特性,二级结构、三维结构等结构特性,酶学特性和抗原表位等免疫学特性.结果 2008-GZCH07株与ZJ001株同源性最高(97%和98%),与人柯萨奇病毒A16同源性最低,与EV71 A、B、C型病毒的同源性为86%～98%.2008-GZCH07株与ZJ001株和 BJ08-Z025-5株的进化距离较近,属于C4亚型;A、B、C三型EV71的VP1编码蛋白中,2008-GZCH07株VP1编码蛋白与B、C型进化距离较A型近.VP1基因全长510 bp,开放读码框位于116～510 bp区域,编码132个氨基酸,等电点为4.39.VP1蛋白富含α螺旋和无规卷曲,无跨膜区域,含5个高疏水性区域,属于胞外蛋白.蛋白质同源建模分析表明该区域位于蛋白表面,形成环状结构,含有5个抗原簇,7个关键催化位点位于该区域内或其附近.结论 EV71-VP1基因编码蛋白分布有多个磷酸化位点,具有较多的生物功能位点和潜在的抗原表位区域,可能是免疫诊断、药物作用研究及疫苗研制的靶抗原,可为EV71诊断、治疗及预防方面的应用价值提供重要的参考依据.     

肠道病毒71型研究进展

肠道病毒71型是手足口病的主要病原体,在世界范围内广泛流行。本文综述了近年来肠道病毒71型感染的病原学、流行病学、致病机制、预防与治疗等方面的研究进展。     

Differential gene expressions of the MAPK signaling pathway in enterovirus 71-infected rhabdomyosarcoma cells

BackgroundMitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway plays an important role in response to viral infection. The aim of this study was to explore the function and mechanism of MAPK signaling pathway in enterovirus 71 (EV71) infection of human rhabdomyosarcoma (RD) cells.MethodsApoptosis of RD cells was observed using annexin V-FITC/PI binding assay under a fluorescence microscope. Cellular RNA was extracted and transcribed to cDNA. The expressions of 56 genes of MAPK signaling pathway in EV71-infected RD cells at 8 h and 20 h after infection were analyzed by PCR array. The levels of IL-2, IL-4, IL-10, and TNF-α in the supernatant of RD cells infected with EV71 at different time points were measured by ELISA.ResultsThe viability of RD cells decreased obviously within 48 h after EV71 infection. Compared with the control group, EV71 infection resulted in the significantly enhanced releases of IL-2, IL-4, IL-10 and TNF-α from infected RD cells (p < 0.05). At 8 h after infection, the expressions of c-Jun, c-Fos, IFN-β, MEKK1, MLK3 and NIK genes in EV71-infected RD cells were up-regulated by 2.08–6.12-fold, whereas other 19 genes (e.g. AKT1, AKT2, E2F1, IKK and NF-κB1) exhibited down-regulation. However, at 20 h after infection, those MAPK signaling molecules including MEKK1, ASK1, MLK2, MLK3, NIK, MEK1, MEK2, MEK4, MEK7, ERK1, JNK1 and JNK2 were up-regulated. In addition, the expressions of AKT2, ELK1, c-Jun, c-Fos, NF-κB p65, PI3K and STAT1 were also increased.ConclusionEV71 infection induces the differential gene expressions of MAPK signaling pathway such as ERK, JNK and PI3K/AKT in RD cells, which may be associated with the secretions of inflammatory cytokines and host cell apoptosis.     

轻或重症手足口病患儿HEV71分离鉴定及其VP1基因型分析

目的 从不同病情手足口病(HFMD)患儿中分离鉴定人肠道病毒71型(HEV71)并分析其VP1基因型及药物结合位点突变情况。方法 从2014年浙江省绍兴地区轻、重症各4例HFMD患儿标本中分离HEV71并用RT-PCR进行鉴定。采用RT-PCR扩增病毒分离株全长VP1基因并测序。采用专业生物信息学软件,对HEV71分离株进行VP1基因分型、确定VP1基因中药物结合位点突变情况及构建HEV71分离株系统进化树。结果 8例HFMD患儿标本中均分离出HEV71。HEV71分离株与文献报道的VP1-C4a基因亚型的核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达97.2%~98.8%和99.3%~99.7%。2例重症患儿HEV71分离株分别在VP1基因序列第179位药物结合位点发生V179L点突变。5株HEV71与安徽和湖南分离株、3株与上海和山东分离株亲缘关系较近。结论 本地区不同病情HFMD患儿分离的HEV71均为VP1-C4a基因亚型,重症患儿HEV71分离株VP1基因第179位药物结合位点突变可能与病情严重程度有关。