双抗体夹心—ELISA用于旋毛虫活动性感染的诊断及疗效考核

目的 检测宿主血清中旋毛虫循环抗原（ＣＡｇ）以诊断本病和考核药物疗效。方法 双抗体夹心－ＥＬＩＳＡ法,结果 ９４只实验感染旋毛虫小鼠,受染３ｄ后,即有７％的小鼠显示阳性反应,受染３０ｄ,无论受染幼虫数目多寡（５０、１５０及３００条幼虫／只）,全部受染鼠（１００％）均显示阳性反应,给予丙硫咪唑治疗后的第１周,ＣＡｇ的阳性率仍为１００％,但在治疗后第２、３及４周,则分别降为６０％、２０％及１０％。检测     

血清丙氨酸氨基肽酶(AAP)测定在诊断肝胆疾病中的应用

为观察血清丙氨酸氨基肽酶 (AAP)水平对肝胆疾病的临床诊断价值。用自动分析仪速率法测定 2 2 9名肝胆疾病患者和 70名健康人血清AAP活力。结果显示肝癌、各类肝炎、胆道阻塞病人血清AAP活力明显高于健康对照组 (P <0 0 1) ,且与γ -谷氨酰转肽酶 (γ -GT)、碱性磷酸酶 (ALP)活力呈正相关 ;与血清总胆红素 (T -Bil)、丙氨酸转氨酶 (ALT)不存在明显相关性。结论 :在肝胆疾病诊断中 ,AAP较其它肝功能指标更具灵敏的特异性指标     

血清甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶同工酶对原发性肝癌的诊断价值

目的研究血清甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶（grycylprolinedipeptidylaminopeptidase,GPDA）同工酶对PHC的诊断价值,提高早期PHC和AFP阴性PHC诊断水平。方法采用阶段梯度垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行血清GPDA同工酶分离检测,同步测定比较PHC患者血清GPDA同工酶与GPDA总活性（TGPDA）、AFP、肿瘤大小及ALT的关系。结果血清GPDA按其泳动速度可分为快带（GPDA-F）与慢带（GPDA-S）两种同工酶。PHC患者血清GPDA-F的阳性率为85.3%,而肝外肿瘤、转移性肝癌、肝炎后肝硬化、慢性肝炎中阳性率均较低,正常对照组以及良性肝占位全部阴性。GPDA-F阳性率在TGPDA活性增高组明显高于正常组（94.4%对75.0%）,GPDA-F与AFP及肿瘤大小无关系。良性肝病ALT升高组GPDA-F阳性率高于ALT正常组,而PHC患者GPDA-F与ALT无关。PHC患者GPDA-F呈持续阳性,良性肝病患者GPDA-F常为一过性阳性。结论GPDA-F为一新的PHC血清标志物,有助于PHC的定性诊断,尤其对早期PHC及AFP阴性PHC的诊断具有重要价值。     

肝病患者血清亮氨酸氨基肽酶检测及其临床意义

亮氨酸氨基肽酶(LAP)广泛分布于人体内,以肾、小肠、肝、胰含量最多,胆汁中也有分布。在细胞内,LAP位于微粒体中。LAP在胆管和胆小管时的活性最强。在肝实质细胞内则较弱,此种分布同碱性磷酸酶相似。 LAP分3种,一是水解亮氨酸酰胺,称亮氨酸氨基肽酶(LA),二是水解亮氨酸-β萘胺,称亮氨酰萘胺酶(LNA),它对亮氨酸酰酶也有水解作用。三是来源胎盘的胱氨酰胺基肽酶(CAP),其对以上几     

血清脯氨酸肽酶测定在肝病诊断中的意义

血清脯氨酸肽酶测定在肝病诊断中的意义于德航，吴力克，黄永森，逢金聚，王启娟我们同时检测了１３４例血清脯氨酸肽酶（ｐｒｏｌｉｄａｓｅ，ＰＬＤ）和丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ），以便了解ＰＬＤ在肝病检测中的应用价值。现报告如下：材料与方法１３４份血清包括急性肝炎...     

Dot—ELISA法和IEST检测旋毛虫抗体的实验研究

旋毛虫病是一种世界性分布的人兽共患病 ,国内屡见报道〔1～ 3〕。确诊主要依据活检 ,因而漏诊、误诊较多。本文采用斑点ＥＬＩＳＡ(Ｄｏｔ -ＥＬＩＳＡ)法和免疫酶染色试验 (ＩＥＳＴ)对感染旋毛虫豚鼠血清进行特异性抗体的检测 ,旨在研究这二种血清学方法的特异性和敏感性 ,以期替代传统的肌肉活检法。1　材料与方法1.1　受试血清　实验感染 7周的旋毛虫病豚鼠血清4 0份 ,每鼠经口感染旋毛虫幼虫 5 0 0条。 4 0只豚鼠实验感染后每周心脏穿刺取血 1次 ,每次 1ｍｌ,连续10周 ,分离血清备用。正常豚鼠血清 4 0份 ,血吸虫病兔血清 2 0份 ,蛔虫…     

血清首氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶同工酶对原发性肝癌的诊断价值

目的研究血清甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶（ｇｌｙｃｙｌｐｒｏｌｉｎｅ　ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ　ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ,ＧＰＤＡ）同工酶对ＰＨＣ的诊断价值,提高早期 ＰＨＣ和 ＡＦＰ阴性ＰＨＣ诊断水平。方法采用阶段梯度垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行血清ＧＰＤＡ同工酶分离检测,同步测定比较ＰＨＣ患者血清ＧＰＤＡ同工酶与ＧＰＤＡ,Ｑ．活性（ＴＧＰＤ）、ＡＦＰ、肿瘤大小及ＡＬＴ的关系。结果血清ＧＰＤＡ按其泳动速度可分为快带（ＧＰＤＡ－Ｆ）与慢带（ＧＰＤＡ－Ｓ）两种同工酶。ＰＨＣ患者血清ＧＰＤＡ－Ｆ的阳性率为８５．３％,而肝外肿瘤、转移性肝癌、肝炎后肝硬化、慢性肝炎中阳性率均较低,正常对照组以及良性肝占位全部阴性。ＧＰＤＡ－Ｆ阳性率在ＴＧＰＤＡ活性增高组明显高于正常组（９４．４％对７５０％）,ＧＰＤＡ－Ｆ与ＡＦＰ及肿瘤大小无关系。良性肝病ＡＬＴ升高组ＧＰＤＡ－Ｆ阳性率高于ＡＬＴ正常组,而ＰＨＣ患者ＧＰＤＡ－Ｆ与ＡＬＴ无关。ＰＨＣ患者ＧＰＤＡ－Ｆ呈持续阳性,良性肝病患者ＧＰＤＡ－Ｆ常为一过性阳性。结论ＧＰＤＡ－Ｆ为一新的ＰＨＣ血清标志物,有助于ＰＨＣ的定性诊断,尤其对早期ＰＨＣ及ＡＦＰ阴性ＰＨＣ的诊断具有重要价值。     

血清甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶对慢性肝病诊断的价值

观察血清甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶 (GPDA)在慢性肝病中的变化 ,评价临床诊断价值。采用连续监测法测定 131例各类慢性肝病患者和 10 3名正常人血清GPDA活性 ,同步检测血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT) ,进行比较分析。慢性肝炎轻度、中度、重度患者及原发性肝癌患者血清GPDA活性均高于正常对照组 ,差异有显著性意义(P均 <0 0 0 1) ,肝癌患者升高尤为显著 ;肝硬化代偿期和失代偿期患者GPDA水平与对照组无显著差异 (P >0 0 5 ) ;而ALT在慢性肝炎和肝硬化患者组均明显高于对照组 ,差异有非常显著性意义 (P均 <0 0 0 1) ,ALT升高的例数与倍数明显高于GPDA。血清GPDA对慢性肝炎的诊断及病情估计有一定的意义 ,但敏感性不如ALT。GPDA对肝硬化的诊断价值不大 ,但GPDA异常升高有助于肝癌的诊断     

旋毛虫Ts21重组蛋白的免疫诊断价值及免疫保护作用的研究

目的 探讨旋毛虫Ts21重组蛋白的免疫诊断价值及免疫保护作用。 方法 应用旋毛虫Ts21重组蛋白ELISA（Ts21-LISA）与肌幼虫ES抗原ELISA（ES-LISA）对旋毛虫病与其他寄生虫病患者血清及5种旋毛虫（T1、T2、T3、T4和T7）感染小鼠血清进行检测,并观察不同剂量旋毛虫感染小鼠后不同时间的血清抗体水平。将Ts21重组蛋白皮下注射免疫小鼠（20 μg/只,免疫3次,每次间隔10 d）,末次免疫后10 d,每只小鼠用300条旋毛虫肌幼虫经口攻击感染,3.5 d和42 d 后剖杀,观察肠道成虫与肌幼虫数并计算减虫率。 结果 Ts21-LISA检测旋毛虫病、并殖吸虫病、囊尾蚴病及棘球蚴病患者血清的抗体阳性率分别为94.7%（18/19）、15.8%（3/19）、9.1%（1/11）和7.7%（1/13）,与血吸虫病、华支睾吸虫病患者血清及健康人血清无交叉反应;Ts21重组蛋白与ES抗原ELISA检测旋毛虫病患者血清抗体的敏感性与特异性差异均无统计学意义（χ²=0,P＞0.05;χ²=0.358,P＞0.05）。Ts21重组蛋白与ES抗原检测T1感染小鼠血清的敏感性差异无统计学意义（χ²=0.104,P＞0.05）,与T2、T3、T4、T7感染小鼠血清的交叉反应率明显低于ES抗原（χ²=17.069,P＜0.05）。小鼠感染300条旋毛虫后4 周,应用Ts21-LISA检测的血清抗体阳性率为100%（10/10）;小鼠感染5条旋毛虫后6周,血清抗体阳性率为100%（10/10）。Ts21重组蛋白免疫小鼠用旋毛虫攻击感染后3.5 d和42 d,肠道成虫与肌幼虫减虫率分别为42.71%和49.8%。 结论 Ts21重组蛋白可用于旋毛虫病的血清学检测,但不能忽视与并殖吸虫病、囊尾蚴病及棘球蚴病患者血清的交叉反应。     

旋毛虫抗原基因Ts43原核表达及重组蛋白鉴定

目的原核表达旋毛虫相对分子质量(Mr)43 000抗原基因(Ts43)并对重组蛋白进行抗原性鉴定。方法将旋毛虫抗原基因Ts43克隆入原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Ts43,经测序分析正确后转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blotting analysis)鉴定重组蛋白的抗原性。结果SDS-PAGE结果显示表达产物为Mr 41 000的重组融合蛋白,IPTG诱导4 h时表达量最大,薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的14.7%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、乡土旋毛虫及纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别,与人芽囊原虫、微小隐孢子虫感染小鼠和正常小鼠血清和正常人血清无交叉反应,但与棘球蚴病、囊尾蚴病、日本血吸虫病、并殖吸虫病及华支睾吸虫病患者血清均有交叉反应。结论旋毛虫Ts43基因的重组蛋白具有较好的抗原性,但与某些寄生虫病患者血清有交叉反应。     

旋毛虫排泄分泌抗原的成分及应用价值

旋毛虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病，长期以来用于免疫诊断和免疫预防的旋毛虫抗原，尤其是排泄分泌（ES）抗原引起了国内外众多学者的关注。本文综述了近年来旋毛虫ES抗原有效成分的研究及其在免疫诊断和免疫预防方面的应用价值，并且提出应用DNA重组技术在体外大量表达ES抗原和利用多肽合成技术在体外大量合成抗原用于免疫诊断和免疫预防将是今后的研究方向。     

旋毛虫成虫抗原基因的原核表达及表达产物的特性分析

目的　获得旋毛虫成虫抗原基因的原核表达产物并对其进行纯化及免疫特性分析。　方法　旋毛虫成虫Ts87基因片段亚克隆入PET-28a(+)表达载体,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。亲和层析和电洗脱法纯化表达产物,SDS-PAGE、ELISA和Westernblotting对表达产物进行分析鉴定,并将纯化的表达产物人工免疫兔。结果　SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子量约为40kDa的重组蛋白。纯化后免疫兔获得高滴度的抗血清。该基因重组蛋白可被感染旋毛虫的猪、兔血清及人工免疫兔血清所识别,与感染囊尾蚴、棘球蚴的患者血清或感染日本血吸虫的兔血清不发生交叉免疫反应。　结论　获得一个新的旋毛虫成虫Ts87基因重组蛋白,该蛋白具有特异的抗原性。     

抗旋毛虫鸡卵黄抗体的活性检测

目的制备特异性抗旋毛虫的鸡卵黄免疫球蛋白,研究其免疫应答规律及其稳定性。方法用纯化的旋毛虫幼虫免疫育龄种鸡,经水稀释法初步纯化浓缩后获得卵黄抗体。应用酶联免疫吸附试验检测卵黄抗体的效价及其敏感性和稳定性。结果通过免疫可成功诱导出高效价的抗旋毛虫抗体,效价可达1∶106以上,免疫应答持续时间可达34周以上。免疫后卵黄抗体敏感性和血清抗体敏感性无显著性差异(P>0.05)。稳定性试验表明IgY敏感性高,在pH4～10及温度不超过60℃条件下活性稳定。结论成功制备出高效价的特异性抗旋毛虫卵黄抗体,其敏感性高,有一定的耐热、耐酸碱性,可进一步用于旋毛虫感染的研究。     

旋毛虫5'-nucleotidase基因特征与克隆表达

目的 研究旋毛虫5'-nucleotidase基因的序列结构特征及其蛋白克隆表达。方法 从旋毛虫获得5'-nucleotidase基因的序列,利用生物信息学方法进行系统性分析,并进行原核表达。结果 旋毛虫5'-nucleotidase基因大小为1 653 bp,编码550个氨基酸,119个氨基酸残基组成,理论相对分子质量(Mr)为62 kD,分子式为C₂₈₀₀H₄₃₅₈N₇₄₂O₈₀₃S₂₃,等电点为6.13,属于稳定存在的亲水蛋白质。该蛋白含有21个氨基酸组成的信号肽,同时具有跨膜区域,此外还含有3个N-糖基化位点、2个O-糖基化位点、20个磷酸化位点、28个B细胞线性结合位点和13个T细胞结合位点。二级结构中,α-螺旋占43.27%(238个),伸展链占22.73%(125个),β-折叠占7.82%(43个),无规则卷曲占26.18%(144个)。SDS-PAGE显示,5'-nucleotidase基因在原核表达系统中呈可溶性形式表达,重组蛋白大小约为74 kD。结论 成功克隆了旋毛虫5'-nucleotidase基因,对其进行序列分析和原核表达,为进一步探究5'-nucleotidase蛋白在旋毛虫感染过程中的作用奠定基础。     

旋毛虫抗原基因Ts88原核表达及重组蛋白鉴定

目的　原核表达旋毛虫抗原基因Ts88,并对重组蛋白的抗原性进行鉴定。　方法　免疫筛选cDNA文库得到旋毛虫抗原新基因Ts88,克隆入原核表达载体pET28c(+),异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达。重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体滴度。蛋白质印迹法检测重组蛋白的抗原性。免疫荧光试验确定Ts88蛋白在虫体的分布。　结果　经原核表达的Ts88重组蛋白,用其免疫小鼠可得到高滴度的抗体血清。蛋白质印迹法结果表明该重组蛋白能与旋毛虫病患者血清、旋毛虫病猪血清、人工感染及人工免疫兔血清反应,不与其他蠕虫病患者血清发生交叉反应 ,并能识别旋毛虫虫体天然抗原成分。免疫荧光试验显示Ts88蛋白主要分布于虫体体壁。　结论　成功制备Ts88基因的重组蛋白,证明该蛋白具有较好的抗原性     

Comparative dynamics and phenotype of the murine immune response to Trichinella spiralis and Trichinella pseudospiralis

Infection of NIH mice with Trichinella spiralis and Trichinella pseudospiralis results in qualitatively comparable immune responses. Antigen-specific proliferation by mesenteric lymph node cells was transient and temporally associated with intestinal infection, but in contrast was sustained throughout infection by splenocytes. Early cytokine production by mesenteric lymph node cells was dominated by interleukin 10, but also IL-5 and IL-4, with rapid resolution following parasite expulsion from the gut. Splenocytes showed a mixed profile of cytokine production, although again dominated by IL-10 and sustained over 60 days of infection. All antibody classes were evident, with early production of IgA and IgG1, and subsequent secretion of other subclasses including IgG2a. Granulocytic infiltration of the spleen was significantly greater in T. spiralis infection. The concentration of serum corticosterone generally remained within normal boundaries, although was raised by day 60 in T. spiralis-infected mice. We conclude that the systemic suppression of inflammation reported for T. pseudospiralis does not result from selective induction of regulatory cytokines, or a major difference in the immune response to infection with T. spiralis.     

旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达

目的构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体，并且在大肠埃希菌中表达。方法将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a（＋）载体上，构建原核表达载体pET-28a—Ts43，酶切鉴定正确后，导入菌株Rosetta中，用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a—Ts43，IPTG诱导表达分子质量单位约为43ku的融合蛋白，与预测值相符。以0．9mmol／LIPTG诱导4．5h后表达量最高，薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20％。Western blot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别。结论原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功，为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础。     

旋毛虫ES抗原P49基因的体外表达分析

目的克隆和表达旋毛虫ES抗原P49基因,并分析表达产物的免疫原性。方法以重组质粒pCDNA3.1 P49为模板,PCR扩增旋毛虫ES抗原P49基因,将扩增片段双酶切产物连接到质粒pEGFP N1中,构建重组真核表达载体pEGFP N1 P49,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS 7。于转染24h后在荧光显微镜下观察发绿色荧光的转基因细胞;通过Western blot分析证实P49基因表达产物的免疫原性。结果成功构建旋毛虫ES抗原P49基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP N1 P49,并在COS 7细胞中表达了目的蛋白,并且表达的蛋白可被感染旋毛虫小鼠阳性血清特异地识别。结论成功获得了重组蛋白,并证实该融合蛋白具有免疫原性,其结果为研究其生物学功能奠定了基础。     

大鼠对旋毛虫再感染的抵抗力实验观察

目的 研究实验感染旋毛虫（韩国分离株）的大鼠对成虫和肌期幼虫阶段感染的保护性免疫和IgG，IgG1，IgG2a抗体反应。 方法 46只大鼠随机分为7组，其中2组（A1、A2组， 共10只）用于观察成虫阶段引起的保护性免疫，B组（B1、B2组， 共14只）用于观察肌期幼虫阶段引起的保护性免疫，C组（C1、C2组，共17只）为感染对照组，D组（5只）为正常对照组。A、B和C组分别每鼠感染1 000条旋毛虫肌幼虫，分别于感染后第7天（A1、 A2组）和第30天（B1、B2组），用氟苯咪唑治疗（20 mg/kg，10 d）。治疗后第10天，A和B组每鼠再次感染500条旋毛虫肌幼虫，于感染后第7天剖杀A1和B1组大鼠，检测肠道内成虫数，于感染后第30天剖杀A2和B2组大鼠，检测横膈膜内肌期幼虫数，同时分别剖杀感染对照组和正常对照组大鼠。每组同期取血，ELISA检测特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平。结果 旋毛虫成虫阶段对成虫和肌幼虫的保护性免疫分别为100%和99.96%，肌幼虫阶段对成虫和肌幼虫的保护性免疫分别为99.92%和99.89%。肌幼虫感染阶段抗肌幼虫分泌排泄抗原的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体与正常对照组（分别为0.5、 0.1和0.1）和成虫感染阶段（分别为0.5、 0.09和0.09）比较，抗体反应均显著增高（分别为3.0、2.2和0.8）（P<0.01）。且幼虫期抗肌幼虫分泌排泄抗原特异性IgG1抗体（2.2）显著高于特异性IgG2a抗体（0.8）（P<0.01）。 结论 旋毛虫的成虫和肌幼虫阶段的感染均对成虫和幼虫的再感染产生保护性免疫。