骨形态发生蛋白-13促进小鼠骨髓干细胞的软骨分化

目的:研究骨形态发生蛋白-13对小鼠骨髓基质干细胞向软骨分化过程的作用。方法:体外培养小鼠骨髓基质干细胞(MSCs),贴壁细胞传代,取第3代细胞,用骨形态发生蛋白-13溶液干预培养1,4,7,14 d取样检测。倒置相差显微镜观察细胞形态;RT-PCR,western-blot和免疫细胞化学法检测不同时期Ⅱ型胶原,SOX9,阿尔辛蓝(Alcian)染色蛋白多糖。结果:Ⅱ型胶原和SOX9之mRNA和蛋白的表达在第4天开始出现并不断升高;Alcian染色结果显示骨形态发生蛋白-13诱导细胞分泌蛋白多糖基质,可见细胞小结区域呈明显的异染性。结论:骨形态发生蛋白-13可以定向诱导小鼠骨髓干细胞的软骨分化。     

人骨形态发生蛋白—2基因的真核表达载体构建

目的;利用杆状病毒载体,构建可直接转染昆虫细胞Sf9的含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2)基因的重组穿梭载体（bacmidDNA),最终获得重组蛋白。方法：将编码包含hBMP-2 N-端信号肽,中间前肽以及C－端成熟肽共1188bp的cDNA片断,插入真核表达载体pFastBacl的多克隆位点,受控于pPolh启动子,构建成pFastBacl/hBMP-2重组转移载体。重组子转化大肠杆菌DH10Bac。转座后、挑选阳性菌落,提取bacmid DNA,经PCR鉴定后,以重组bacmidDNA转染Sf9细胞。收集重组病毒,扩大转染Sf9,表达产物行SDS－PAGE初步鉴定。结果：获得了含hBMP-2全长cDNA片段的重组bacmid DNA和重组病毒,经SDS－PAGE证实在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白,经激光密度扫描仪扫描显示分泌性蛋白表达量占细胞蛋白总量的35．6％。结论：利用杆状病毒载体成功构建了可用于直接转染昆虫细胞而无需同源重组的重组bacmidDNA,并在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白。     

犬异位移植气管内骨形态发生蛋白诱导软骨再生作用的研究

目的比较研究骨形态发生蛋白-2在犬的自体、异体、冷冻异体气管移植体内诱导软骨再生的作用。方法54只杂种犬随机等分为3组,分别为自体移植组、异体移植组、冷冻后的异体移植组。3组分别于颈部切除4环气管段作为移植体,植入骨形态发生蛋白．2后埋入腹腔大网膜中。各组分别植入不同的气管移植体。术后5周处死实验动物,通过对标本进行组织学观察、碱性磷酸酶活性和钙含量测定,对各组的新生软骨进行观察和定量分析。结果①半定量法组织学评分,自体移植组、异体移植组、冷冻后异体移植组分别为1．68±0．27、5．57±0．72、1．93±0．24,3组结果有统计学差异（F=152．717,P〈0．001）,自体移植组、异体移植组与冷冻后的异体移植组差异均有统计学意义（P〈0．05）,而自体移植组和冷冻后的异体移植组差异无统计学意义（P〉0．05）。②各实验组骨形态发生蛋白．2植人区均可见新生软骨细胞和软骨岛,自体移植组、异体移植组、冷冻后的异体移植组的新生软骨100倍视野下像素面积分别为2573．6±738．4、1691．3±743．6、2482．9±827．5,组间差异有统计学意义（F=5．711,P〈0．05）,自体移植组、异体移植组与冷冻后的同种异体移植组差异均有统计学意义（P〈0．05）,而自体移植组和冷冻后的异体移植组差异无统计学意义（P〉0．05）。③碱性磷酸酶活性和钙含量：自体移植组[（0．42±0．03）U／mg,（5．48±1．15）mg／g]、冷冻后的异体移植组[（0．42±0．05）U／mg,（5．03±0．91）mg／g]与异体移植组[（0．30±0．04）U／mg,（3．57±0．98）mg／g]差异均有统计学意义（P〈0．05）,自体移植组与冷冻后的异体移植组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论骨形态发生蛋白-2能在气管移植体内有效地诱导出新生软骨,在深低温冷冻后的异体气管移植体内的作用效果与自体气管移植体内相似,明显优于异体气管移植体。     

犬异位移植气管内骨形态发生蛋白诱导软骨再生作用的研究

目的比较研究骨形态发生蛋白-2在犬的自体、异体、冷冻异体气管移植体内诱导软骨再生的作用。方法54只杂种犬随机等分为3组,分别为自体移植组、异体移植组、冷冻后的异体移植组。3组分别于颈部切除4环气管段作为移植体,植入骨形态发生蛋白-2后埋入腹腔大网膜中。各组分别植入不同的气管移植体。术后5周处死实验动物,通过对标本进行组织学观察、碱性磷酸酶活性和钙含量测定,对各组的新生软骨进行观察和定量分析。结果①半定量法组织学评分,自体移植组、异体移植组、冷冻后异体移植组分别为1.68±0.27、5.57±0.72、1.93±0.24,3组结果有统计学差异(F=152.717,P<0.001),自体移植组、异体移植组与冷冻后的异体移植组差异均有统计学意义(P<0.05),而自体移植组和冷冻后的异体移植组差异无统计学意义(P>0.05)。②各实验组骨形态发生蛋白-2植入区均可见新生软骨细胞和软骨岛,自体移植组、异体移植组、冷冻后的异体移植组的新生软骨100倍视野下像素面积分别为2573.6±738.4、1691.3±743.6、2482.9±827.5,组间差异有统计学意义(F=5.711,P<0.05),自体移植组、异体移植...     

重组鼠骨形态发生蛋白-7基因转染心肌细胞及其表达

为探讨重组鼠骨形态发生蛋白-7(rrBMP-7)真核表达载体在心肌细胞获得稳定高效表达的可行性,采用PCR技术扩增BMP-7基因,将其插入真核表达载体pCDNA3·1( )中;利用差速法分离培养心肌细胞,将构建的BMP-7表达质粒转染心肌细胞,检测其表达效率。结果表明,经过PCR及酶切鉴定证明获得了真核表达质粒pCDNA3·1-rrBMP7;通过逆转录PCR和免疫细胞化学鉴定证明BMP-7在转染后的心肌细胞中得到了稳定高效表达。结论:应用本文介绍的方法,成功构建了BMP-7真核表达质粒并在心肌细胞中稳定高效的表达,为应用于抗缺血再灌注损伤的研究创造了条件。     

BMP2/β-TCP-HA复合支架体内构建组织工程软骨的实验研究

目的 探讨以骨形态发生蛋白2(BMP2)/β磷酸三钙-透明质酸(β-TCP-HA)复合支架在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性.方法 分别构建BMP2/β-TCP-HA(实验组),BMP2/β-TCP(对照组)及β-TCP(空白组)支架.分离培养大鼠间质干细胞(MSCs)至三代,利用负压吸引将MSCs作为种子细胞分别接种于各组支架内,并植于裸鼠皮下.于术后12周观察其成软骨效果并对修复组织行大体,组织学及免疫组化观察.结果 术后12周实验组支架降解基本完全,能形成丰富的软骨组织,软骨细胞外基质丰富,糖胺多精(GAG)及Ⅱ型胶原免疫组化染色均旱强阳性;对照组支架大部降解,支架内形成岛状软骨增生;GAG及Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性;空白组支架部分降解,以纤维组织和脂肪组织为主;仅在支架边缘见少最软骨组织,GAG及Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阴性.结论 BMP2/β-TCP-HA复合支架为MSCs提供了一条可能有效的关节软骨修复途径,是目前软骨组织工程较为理想的细胞支架材料.     

骨髓基质干细胞移植复合神经节苷酯治疗大鼠急性脊髓损伤的实验研究

目的 观察骨髓间充质干细胞移植并应用单唾液酸神经节苷酯( GM1)治疗大鼠急性脊髓损伤的效果.方法 体外培养大鼠骨髓基质千细(BMSC),传代至第6代,备用.将健康成年SD大鼠48只,采用Allen法在T9造成急性脊髓损伤动物模型.将急性脊髓损伤动物模型随机分为4个治疗组:干细胞组(治疗A组)、GMI治疗组(治疗B组)、干细胞+GMI治疗组(治疗C组)和对照组,每组12只.伤后第1天、第7天和第14天分别用斜板试验、Gale评分观测脊髓恢复情况.结果 大鼠脊髓损伤后A、B、C组斜板试验和Gale评分优于对照组,第3天、第7天斜板试验和Gale评分C组优于A、B组(P＜0.05).结论 大鼠脊髓损伤后早期应用干细胞移植联合GMI对其运动功能的恢复有促进作用.     

降脂壮骨方剂含药血清对大鼠骨髓基质细胞骨形态发生蛋白-2表达的影响

目的研究高胆固醇血清以及降脂壮骨方剂含药血清干预下大鼠骨髓基质细胞骨形态发生蛋白-2（BMP-2）表达的变化。方法取成年大鼠股骨,用密度梯度离心方法分离大鼠骨髓基质细胞,原代培养细胞至第三代,并用流式细胞仪进行细胞鉴定。选取第三代细胞,随机分为三组。A组正常血清对照组：2％空白血清（体积比）;B组高胆固醇血清损伤组：终浓度为4mmol／L高胆固醇血清;C组中药血清预处理＋高胆固醇血清损伤组：2％中药血清（体积比）预处理2h后＋终浓度为4mmol／L高胆固醇血清。回收细胞提取总RNA,检测BMP-2表达变化,并进行统计学分析。结果与空白血清对照组相比,高胆固醇血清损伤组骨髓基质细胞增殖受抑制;BMP-2的mRNA表达水平降低（P〈0．01）。与高胆固醇血清损伤组相比,中药血清预处理＋高胆固醇血清损伤组骨髓基质细胞生长状态明显改善,BMP-2的mRNA表达水平增高（P〈0．01）。结论降脂壮骨方剂含药血清可以增强高胆固醇血清环境下骨髓基质细胞BMP-2、雌激素受体（ER）,明显改善骨髓基质细胞生长状态,有利于骨质疏松症的治疗。     

骨形态发生蛋白2在骨损伤不同时期的表达

目的:检测骨形态发生蛋白2(BMP2)在骨损伤不同时期的表达,了解其高峰表达时间。方法:实验组18只大鼠胫骨损伤造模,对照组6只大鼠假手术后处死,实验组平均分为3组,分别于术后第5天、第15天和第30天处死,提取大鼠骨组织总RNA,RT-PCR后扩增BMP2开放读框中编码成熟肽的基因片段,与pGEM-TEasy载体连接纯化后建立实时荧光定量PCR的标准曲线,检测BMP2的表达水平。结果:BMP2的表达在骨损伤后第5天开始升高,第15天达到高峰,第30天稍高于正常水平。结论:高峰表达时间的确定为进一步研究提供了理论上的依据。     

普罗布考对糖尿病肾病患者血清超敏C反应蛋白和骨形态发生蛋白-7的影响

目的 探讨普罗布考对糖尿病肾病患者血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)和骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的影响.方法 124例糖尿病肾病患者采用数字表法随机分为对照组62例、观察组62例.对照组采用常规治疗,观察组在常规治疗基础上加用普罗布考,共治疗8周.测定两组治疗前后24h尿蛋白定量、血清hs-CRP和BMP-7.结果 治疗后,两组尿蛋白均较治疗前明显减少(t=6.16、5.23,均P＜0.01);两组治疗后差异有统计学意义(t=5.35,P＜0.05).治疗后两组hs-CRP、BMP-7较治疗前明显改善(t=10.50、5.54,均P＜0.05);两组治疗后差异均有统计学意义(t=10.28、4.36,均P＜0.05).结论 普罗布考可以通过抗炎和抗纤维化改善糖尿病肾病患者病情.     

壳聚糖、Ⅱ型胶原和PGA三种支架体外构建组织工程软骨的比较研究

目的 观察兔关节软骨细胞在壳聚糖、Ⅱ型胶原、聚羟基乙酸(PGA)三种细胞支架上的生长情况,探讨更适合构建工程软骨的细胞支架材料.方法 多聚赖氨酸包埋壳聚糖、Ⅱ型胶原和PGA三种多孔海绵支架.将体外分离培养的兔关节软骨细胞种植于三种支架上.体外培养4周,对组织工程软骨进行大体标本观察和HE染色,检测软骨内DNA含量、Ⅱ型胶原和糖胺多糖(GAG)的分泌量.结果 软骨细胞在壳聚糖支架内生长良好,培养4周后仍能维持软骨细胞的表型,其分泌Ⅱ型胶原和GAG的能力较其他两种支架好(P＜0.01).结论 壳聚糖支架更适合软骨细胞的贴附生长,有利于维持软骨细胞的表型,是较好的软骨组织工程细胞支架.     

Fabrication of hybrid scaffold based on hydroxyapatite-biodegradable nanofibers incorporated with liposomal formulation of BMP-2 peptide for bone tissue engineering

In the present study, we fabricated an efficient, simple biomimetic scaffold to stimulate osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs). Electrospun poly L-lactic acid nanofibers were employed to mimic the nanofibrillar structure of bone proteins and coated with hydroxyapatite nanoparticles to simulate bone minerals. Thereafter, we regulated the release pattern of BMP-2 peptide through covalent attachment of an optimized liposomal formulation to the scaffold. The fabricated platform provided a sustained release profile of BMP-2 peptide up to 21?days while supporting cellular attachment and proliferation without cytotoxicity. In-vitro results confirmed the superiority of the scaffold containing liposomes through enhancement of growth and differentiation of MSCs. Ectopic bone formation model exhibited significant localized initiation of bone formation of liposome incorporated scaffold. Consequently, these findings demonstrated that our designed platform with modified release properties of BMP-2 peptide considerably promoted osteogenic differentiation of MSCs making it a unique candidate for bone regeneration therapeutics.     

BMP2、VEGF165双基因共表达质粒在小鼠骨髓基质干细胞的表达

目的观察转染BMP2和VEGF165双基因共表达质粒在小鼠骨髓基质干细胞的表达情况。方法脂质体介导下将双基因真核表达质粒pIRES-BMP2-VEGF165导入小鼠骨髓基质干细胞,用RT-PCR和免疫组织化学方法观察BMP2和VEGF165双基因在小鼠骨髓基质干细胞内的表达。结果转染BMP2、VEGF165的小鼠骨髓基质干细胞有明显的BMP2和VEGF165 mRNA及其蛋白表达。结论转染BMP2和VEGF165双基因的小鼠骨,髓基质干细胞能同时表达以上两种基因。     

应用微重力旋转培养系统构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨微重力旋转培养系统(RCCS)在构建组织工程细胞/载体复合物修复兔关节软骨缺损中的作用。方法将兔骨髓间充质干细胞附着在三维载体壳聚糖上,分为传统的静置培养组和微重力旋转培养组,经过体外成软骨诱导作用后,修复兔关节软骨缺损。考察不同时间点、不同培养体系中细胞增殖情况、成软骨表达情况以及对兔关节软骨缺损的修复情况。结果相对于常规的静置培养组,RCCS组细胞增殖能力、成软骨表达均得到增强,对兔关节软骨缺损的修复更为有效。结论微重力旋转培养系统可以作为构建组织工程软骨一个有效的辅助手段,进而应用临床软骨缺损的修复。     

Cytotoxic and genotoxic effects of matrices for cartilage tissue engineering

Customizing auricles with biodegradable polyurethane colonized with autologous chondrocytes as an approach for tissue engineering cartilage transplants has been suggested for the reconstruction of the external ear to repair auricular deformities. Dextrose, triethanolamine and poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) are matrices of an open-pored polyurethane three-dimensional scaffold. After release from the polymer, these compounds can be absorbed into the human organism. Therefore, cytotoxic effects on human chondrocytes and lymphocytes and genotoxic effects on human lymphocytes were determined. Propidium iodide and fluoresceine diacetate staining as well as quantitative proliferations testing with EZ4U served to detect cytotoxic effects on chondrocytes. In lymphocytes cytotoxicity was checked by trypan blue staining and the alkaline single cell microgel electrophoresis (Comet) assay was used to study genotoxic effects. Dose-dependent cytotoxicity and genotoxicity of the matrices could be shown. Concentrations up to 4.25 mg/ml for dextrose, 0.15 mg/ml for PEG-PPG-PEG and 0.9 mg/ml for triethanolamine did not show cytotoxic effects in chondrocytes or genotoxic effects in lymphocytes. These data suggest that dextrose, triethanolamine and PEG-PPG-PEG could be safely used if scaffolds made of open-pored polyurethane do not release these compounds at a rate giving higher concentrations at the site of implantation or in body fluids, respectively.     

The dose-time effects of fluoride on the expression and DNA methylation level of the promoter region of BMP-2 and BMP-7 in rats

Skeletal fluorosis is a chronic metabolic bone disease caused by excessive exposed to fluoride. Recent studies have shown that fluoride causes abnormal bone metabolism through disrupting the expression of Bone Morphogenetic Proteins (BMPs). However, the relationship between fluoride and BMPs is not fully understood, and the mechanism of fluoride on BMPs expression is still unclear. This study investigated the dose-time effects of fluoride on BMP-2 and BMP-7 levels and DNA methylation status of the promoter regions of these two genes in peripheral blood of rats. Eighty Wistar male rats were randomly divided into four groups and treated for 1 month and 3 months with distilled water (control), 25 mg/L, 50 mg/L or 100 mg/L of sodium fluoride (NaF). Rats exposed to fluoride had higher protein expression of BMP-2 and BMP-7 in plasma at 1 month and 3 months. An increase in BMP-2 expression was also observed with an increase of fluoride exposure time. Significant hypomethylation was observed in 2 CpG sites (CpGs) of BMP-2 and 1 CpG site of BMP-7 promoter regions in the fluoride treatment groups. It concludes that fluoride has a dose-response effect on BMP-2 in fluorosis rats, and fluoride-induced hypomethylation of specific CpGs may play an essential role in the regulation of BMP-2 and BMP-7 expression in rats.     

Chitosan scaffolds with BMP-6 loaded alginate microspheres for periodontal tissue engineering

The aim of this study is to develop an effective growth factor releasing scaffold-microsphere system for promoting periodontal tissue engineering. Bone morphogenetic protein-6 (BMP-6)-loaded alginate microspheres in narrow size distribution were produced by optimising electrospraying conditions. The addition of these microspheres to chitosan gels produced a novel scaffold in which not only the pore sizes and interconnectivity were preserved, but also a controlled release vehicle was generated. Loading capacity was adjusted as 50?ng or 100?ng BMP-6 for each scaffold and the controlled release behaviour of BMP-6 from chitosan scaffolds was observed during seven days. Cell culture studies were carried out with rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow in three groups; chitosan scaffolds, chitosan scaffolds containing BMP-6-loaded alginate microspheres and chitosan scaffolds with free BMP-6 in culture medium. Results showed that controlled delivery of BMP-6 from alginate microspheres has a significant effect on osteogenic differentiation.     

维持性血液透析患者成纤维细胞生长因子-23和骨形态蛋白-2与桡动脉钙化的关系

目的检测维持性血液透析患者成纤维细胞生长因子-23(FGF-23)和桡动脉骨形态蛋白-2(BMP-2)的表达,探讨其与桡动脉钙化(VC)的相关性。方法选取46例血液透析患者为研究对象,钙化组21例,非钙化组25例。桡动脉标本为自体动静脉内瘘手术端-端吻合时留取,行HE染色检测有无钙化,并计算钙化积分;免疫组织化学检测桡动脉BMP-2的表达,测定两组血清FGF-23、血红蛋白(Hb)、钙(Ca)、磷(P)、全段PTH(i PTH)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(CH)、尿酸(UA)水平,并对两组之间的性别、年龄、血压、进行比较。结果钙化组血清Ca、P、i PTH、FGF-23、BMP-2表达水平明显高于非钙化组(P <0.05);两组患者年龄、性别及血压差异无统计学意义,钙化组桡动脉脉钙化程度与BMP-2、FGF-23、血钙、血磷呈正相关(P <0.05)。结论血液透析患者普遍存在桡动脉钙化,FGF-23、 BMP-2与桡动脉钙化呈正相关。