成人破骨细胞骨髓培养法的建立与鉴定

目的　在国内前人建立动物破骨细胞骨髓培养方法的基础上,首次建立人破骨细胞骨髓培养法。方法　采取１３例２５－７５岁行全髋置换术的成人股骨上端红骨髓,经密度梯度离心得骨髓单个核细胞（ｍａｒｒｏｗｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ,ＭＭＮＣ）,在浓度为１ｘ１０－８ｍｏｌ／Ｌ的１,２５－（ＯＨ）２Ｄ３的促分化作用下,于预置盖玻片或人胫骨皮质骨片的２４孔培养板内,每孔接种１ｘ１０６／ｍｌ培养１－３周。结果光镜下观察有单个核细胞融合成多核细胞和单个核细胞团形成,经ＴＲＡＰ染色呈阳性反应,电镜下观察有典型的骨吸收陷窝形成。结论　这些均表明由骨髓培养破骨细胞样细胞的方法是成功的。而且利用此方法较之新生动物的直接分离法,所得破骨细胞量多,特征明显,并且方法简单易行。更重要的是为人的破骨细胞样细胞,因此培养方法更有价值。     

淫羊藿对体外培养破骨细胞的影响

目的 观察淫羊藿提取物对体外培养破骨细胞的影响。方法 以出生２ｄ的Ｗｉｓｔａｒ大鼠长骨为来源,培养已成熟生长的破骨细胞;以出生７￣９周的雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠骨髓为来源,在１．２５－（ＯＨ）２ＶｉｔＤ３作用下,培养出骨髓诱导而产生的破骨细胞。两种细胞培养过程中均分别加入２００μｇ／Ｌ的淫羊藿提取物。结果 皮质骨内层可培养出多核,体积大,抗酒石酸酸性磷酸酶（ＴＲＡＰ）染色阳性的破骨细胞,淫羊藿提取物对     

成年大鼠破骨细胞体外培养及细胞凋亡的观察

目的　为研究骨重建过程中破骨细胞的关键作用,建立成年大鼠（１２ ～５０ 周龄） 破骨细胞的体外培养方法并进行细胞凋亡观察。方法　大鼠处死后,在无菌条件下取出股骨,剪去两骺端,以αＭＥＭ 将骨髓细胞冲洗出, 并离心洗细胞２ 次,置于αＭＥＭ 培养液,内含αＭＥＭ,体积分数为１０％ 的胎牛血清（ＦＣＳ） 和１α,２５（ＯＨ）２ Ｖｉｔ Ｄ３ １０ －８ ｍｏｌ／Ｌ,在２４ 孔板内,以体积分数为５ ％ 的ＣＯ２ ,３７ ℃,培养８ 天。按原位ＤＮＡ 末端标记（ＴＵＮＥＬ）检测试剂盒方法染色细胞,以荧光显微镜观察细胞凋亡。结果　经活体观察、ＨＥ染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（ＴＲＡＰ） 染色,光学显微镜、扫描电镜观察骨片之陷窝的形成,证实培养的细胞为破骨细胞;ＴＵＮＥＬ 检测,荧光显微镜下可见破骨细胞核染色质浓缩、裂解等凋亡细胞的典型变化与未凋亡的破骨细胞。结论　本实验建立了成年大鼠破骨细胞的体外培养方法并进行细胞凋亡观察。     

CTGF对破骨前体细胞RAW264.7增殖及碳酸酐酶Ⅱ分化的影响

目的研究结缔组织生长因子(CTGF)对体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7增殖及对核因子Kappa B配体受体(RANKL)诱导体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7分化为成熟多核破骨细胞的影响。方法使用200 ng/mLCTGF干预培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7,采用3H-TdR掺入法检测RAW264.7细胞增殖率;使用200 ng/mL CTGF与RANKL单独或共同处理RAW264.7细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察TRAP阳性多核细胞,Western blot检测碳酐酶Ⅱ蛋白的表达。结果 CTGF可显著促进RAW264.7细胞增殖;200 ng/mLCTGF与RANKL共同处理RAW264.7细胞可促进RAW264.7细胞分化为成熟多核破骨细胞;200 ng/mL CTGF与RANKL共同处理RAW264.7细胞可促进RAW264.7细胞碳酐酶Ⅱ蛋白的表达。结论 CTGF促进体外培养的破骨细胞前体细胞RAW264.7增殖,促进RANKL诱导的破骨细胞前体细胞RAW264.7分化为成熟多核破骨细胞。     

鸡破骨细胞分离培养方法的建立

为了寻找一种获得大量、纯化、有活力的破骨细胞的方法，我们对已经建立的兔破骨细胞体外分离培养方法的基础上加以改进。利用冲洗的方法，从２８天的鸡的长骨中得到细胞团１破骨细胞后，又对鸡的长骨相继进行胶原酶和胰蛋白酶的消化，得到细胞团２和细胞团３破骨细胞。将这些分离的细胞与盖玻片或骨磨片共同培养，通过相差显微镜观察到：这些分离的多核巨细胞能够运动，并能在骨磨片上形成吸收陷窝。另外，这些细胞对酸性磷酸酶染色呈阳性反应，而酸性磷酸酶是鉴别破骨细胞的标志。表明此分离培养鸡破骨细胞的实验技术是成功的。通过此方法获得的鸡破骨细胞比用以往方法获得的兔破骨细胞量多，且活力强。本方法的建立，为进一步研究骨吸收机理奠定了基础。     

l，25(OH)2D3诱导鼠骨髓细胞形成多核破骨细胞的实验研究

目的：观察１，２５（ＯＨ）２Ｄ３对骨髓干细胞形成破骨细胞的调控作用，从而为破骨细胞骨吸收机制的研究奠定方法学的基础。方法：将不同浓度１，２５（ＯＨ）２Ｄ３加入原代培养的刀骨髓细胞培养液中，利用抗酒石酸酸性磷酸酶（ＴＲＡＰ）染色，监测不同时间点破骨细胞的形成情况，利用倒置光相差异微镜和扫描电镜检测所诱导形成破骨细胞的骨吸收功能情况。结果：培养前３天，细胞ＴＲＡＰ染色阴性，第４天出现ＴＲＡＰ阳性单核细     

破骨细胞体外培养生存数的观察与鳗鱼降钙素的影响

应用改良的Ｆｅｎｔｏｎ方法由出生２４小时内的新生Ｗｉｓｔａｒ大鼠分离破骨细胞（ＯＣ）培养于盖玻片与骨片上，并应用改良的ＶａｎＤｅＷｉｊｎｇａｅｒｔ和Ｍｏｓｔａｆａ方法对培养在骨片上的ＯＣ进行ＴＲＡＰ染色，观察体外培养ＯＣ的形态与生存时间。培养于骨片上的ＯＣ生存时间可长达２４０小时。１×１０（－９）ｍｏｌ／Ｌ鳗鱼降钙素能明显减少体外培养的多核ＯＣ生存数，但对单核前ＯＣ数没有明显影响     

高产量高纯度的破骨细胞分离培养

目的 获得高产量高纯度破骨细胞，为骨吸收的体外研究提供丰富的细胞来源。方法 将经典分离乳兔四肢骨破骨细胞的方法与1，25(OH)2D3诱导骨髓干细胞生成破骨样细胞的方法相结合，并应用0．05％胰蛋白酶／0．02％ EDTA联合消化的方法将其纯化。结果 该方法可诱导生成大量的破骨样细胞，0．05％胰蛋白酶／0．02％ EDTA联合消化可使破骨细胞纯化率达95％。诱导生成的破骨样细胞TRAP染色阳性，体外培养具有噬骨能力。结论 该培养方法可产生大量高纯度的破骨样细胞，可为破骨细胞的体外分子生物学研究提供丰富的细胞来源。     

体外培养的破骨细胞细胞化学测量观察

本文采用Spraque-Dawloy大鼠体外破骨细胞培养及新鲜长骨组织破骨细胞印片方洼研究两种材料中破骨细胞细胞化学的异同，检测了酸性磷酸酶(AcP)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、β-酸性半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、NADH和NADPH脱氢酶．并使用Zeiss氏细胞扫描显微镜连接CD／MD20电脑图像分析系统，定量检测了以上酶的活性。结果表明，大鼠体外培养和新鲜组织印片的破骨细胞含有丰富的多种溶酶体酶和厌氧脱氢酶(线粒体酶)，新鲜组织印片的破骨细胞大多数脱氢酶的活性高于体外培养的破骨细胞。     

应用体外分离培养破骨细胞的技术评价人工骨

本文介绍如何应用分离培养破骨细胞的技术评价人工骨。家兔４８只,随机分成Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四组,每组１２只,人工造成家兔同侧桡骨１０ｍｍ缺损。分别植入不同材料的骨移植物,Ａ组为珊瑚羟基磷灰石,Ｂ组为人工合成羟基磷灰石,Ｃ组为人工多聚体,Ｄ组为自体骨。移植术后６、８、１２、１６周,分期处死动物,取出植入动物体内骨移植物并制成骨磨片,与体外分离的破骨细胞共同培养１周,扫描电镜发现,破骨细胞能够在植入动物体内     

骨细胞的体外分离培养及鉴定

目的 建立较稳定的实验室骨细胞分离培养方法.方法 采用序列酶消化法,从3 d龄Sprague-Dawley乳鼠颅骨中分离骨细胞,通过形态学、改良钙钴法碱性磷酸酶(ALP)染色和免疫细胞化学法骨钙素(BGP)染色来鉴定骨细胞.结果 细胞形态呈星状、有树状突起,ALP染色阴性,BGP染色阳性,说明分离出的细胞为骨细胞.结论 本实验结果为在体外深入研究骨细胞的功能提供实验手段.     

高纯度破骨细胞分离培养与功能表达

目的：获得足量高纯度活性破骨细胞进行破骨细胞生化学和分子生物学研究。方法;利用破骨细胞与I型胶原基质的高亲合力,先用pronase和EDTA作用除去不贴附的造血细胞及结合较疏松的间质细胞,继而用0.01%胶原酶作用进一步除去残留的间质细胞,最后用0.1%胶原酶作用得到高纯度破骨细胞悬液。分离细胞用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色,荧光标记显示细胞骨架,RT-PCR方法检测破骨细胞标志酶基因。结果：胶原基质培养结合酶消化可大大提高破骨细胞纯度,破骨细胞对降钙素反应,并表达MT1-MMP,MMP-9,组织蛋白酶K和TRAP基因mRNA,可产生吸收陷窝。结论：利用兔破骨细胞与I型胶原的亲合力,可获得多量高纯度破骨细胞;并表达特征性基因。     

体外培养破骨细胞的功能观察

观察破骨细胞在离体状态下的骨吸收功能。新鲜牛皮质骨经锯式切片机横切成５０μｍ厚０．５×０．５ｃｍ大小骨片。参照已建立的破骨细胞分离培养方法，从新生Ｗｉｓｔａｒ大鼠四肢长骨分离破骨细胞，培养于２．５ｃｍ细胞培养皿内或上述骨片上，相差倒置显微镜或扫描电镜观察，可见培养的细胞具有典型破骨细胞的形态特点，接种子骨片上的破骨细胞分别培养１、３、５、７天，扫描电镜观察，可见破骨细胞能在骨片表面形成吸收陷窝，其形态多样，深浅不一，边界清晰，底面粗糙，而且随培养时间延长，陷窝扩大，数量增多。结论，破骨细胞在体外培养条件下具有良好的骨吸收功能，可进行药物干预的研究。     

破骨细胞对磷酸三钙陶瓷人工骨生物降解的研究

目的 采用破骨细胞与磷酸三钙（ＴＣＰ）陶瓷体外混合培养方法，观察其对ＴＣＰ陶瓷的降解作用。方法 从新生ＳＤ大鼠长骨骨髓中分离出破骨细胞，与ＴＣＰ陶瓷圆盘混合培养，分别于４８及９６小时终止培养并观察。结果 在倒置显微镜下见破骨细胞胞体呈圆形或椭圆形，多核，胞浆伸出许多细胞突起。抗酒石酸酸性磷酸酶（ＴＲＡＰ）染色阳性。ＳＥＭ观察见在ＴＣＰ陶瓷圆盘表面出现许多散在分布的圆形吸收空隙，直径一般〈２０μｍ，     

破骨细胞体外培养研究进展

破骨细胞是骨吸收的主要功能细胞,体外培养破骨细胞是骨吸收研究和抑制骨吸收药物开发研究的基础.该文综述破骨细胞体外培养常用的5种方法及近年研究进展,并对各种方法进行比较.成熟破骨细胞分离培养法仍是目前获得成熟破骨细胞的最佳途径;骨髓诱导破骨细胞培养法是目前最常用的破骨细胞培养法;脾干细胞诱导培养法和外周血单核细胞诱导培养法是近年新发展起来的培养方法,能排除骨髓基质细胞及其他造血干细胞干扰,更具有应用价值;骨巨细胞瘤破骨细胞样细胞分离培养法是其他破骨细胞培养方法的一个重要补充.     

破骨细胞体外培养技术

由于破骨细胞在骨质疏松及相关疾病中的关键作用,对它的研究成为攻克这些疾病的必由之路。选择便捷高效的体外培养方法,是开展体外破骨细胞研究的前提。破骨细胞是终末分化细胞,不能增殖传代,因此破骨细胞的体外培养一直是一个具有挑战性的难题。本文就常见的破骨细胞体外培养技术和鉴定方法做简要概述。     

不同氧环境中破骨细胞的发育分化和功能变化研究

目的 本实验拟观察不同氧浓度下破骨细胞诱导过程中的分化发育,寻找破骨细胞体外培养的适宜氧浓度,为骨转换平衡的修复提供依据.方法 取野生型C57B/L小鼠(2个月龄左右,雄性)骨髓进行破骨细胞的诱导培养.用RANKL(10ng/ml)和M-CSF(10ng/ml)联合的诱导方案,将小鼠骨髓中单核-巨噬细胞系体外诱导为破骨细胞样细胞.将原代破骨细胞置于20%O2、7%O2、2%O2下诱导培养,MOCP5不同氧浓度下普通培养.用MTT法检测MOCP5的增殖变化,用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测破骨细胞形成的变化,并进行TRAP阳性细胞计数,用象牙骨片骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色检测破骨细胞骨吸收活性的变化.结果 骨髓中单核-巨噬细胞体外经RANKL和M-CSF联合诱导可分化为多核的破骨细胞样细胞,在诱导第3天细胞开始融合,第5天TRAP染色强阳性,第8天可见象牙骨片上形成圆形、椭圆形、腊肠形等多种形态的骨吸收陷窝.MTT检测显示MOCP5在20%O2培养时一直处于增殖状态,7%O2条件下由增殖期进入平台期,2%O2时增殖缓慢且没有规律.20%O2、7%O2、2%O2培养下形成的TRAP阳性破骨细胞数分别为22±5.97、34±2.97、7±1.39(P<0.05),原代诱导的破骨细胞在20%O2、7%O2、2%O2形成的骨吸收陷窝面积(μm2)分别为3892.28±1642.78、5356.7±1655.6、2573±994.48(P<0.05).结论 体外RANKL和M-CSF联合可将骨髓单核-巨噬细胞诱导成多核的破骨细胞样细胞作为破骨细胞的研究模型.常氧条件下破骨细胞的TRAP阳性细胞数和骨吸收活性均低于7%O2.7%O2培养下的破骨细胞更接近于体内生理状态的破骨细胞.     

淫羊藿苷对破骨细胞活性的影响

目的:观察淫羊藿苷对破骨细胞骨吸收及凋亡的影响,探讨淫羊藿苷的抗骨质疏松作用机制。方法:体外分离、培养兔破骨细胞,与玻片及骨磨片共同培养,用10-7、10-6、5×10-6、10-5mol/L浓度的淫羊藿苷刺激破骨细胞,倒置相差显微镜下观察活体细胞、HE染色、TRAP染色及骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色,鉴定破骨细胞,并进行骨吸收陷窝计数和面积测量,吖啶橙染色观察凋亡破骨细胞所占的比例。结果:与空白对照组比较,10-6、5×10-6、10-5mol/L浓度的淫羊藿苷组破骨细胞凋亡率均明显增高,骨吸收陷窝数目、面积明显减少,随浓度增加抑制作用增强,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:淫羊藿苷可诱导破骨细胞凋亡,抑制骨吸收,并随浓度增加抑制作用增强。     

体外破骨细胞分离培养方法的建立

本研究采用出生２４小时内的新生兔，从其四肢长骨中分离出破骨细胞，与盖玻片、骨磨片共同培养。相差显微镜观察到分离的多核细胞能够移动，并在骨片上形成吸收陷窝，扫描电镜观察到这些吸收陷窝内的胶原原纤维。另外，这些细胞用目前公认的鉴定破骨细胞的标志－酸性磷酸酶和降钙素染色，呈阳性反应。这些结果均表明：分离、培养破骨细胞的实验技术是成功的。     

1,25—二羟基维生素D3对小鼠骨髓细胞形成破骨细胞样细？…

目的动态观察１，２５－二羟基维生素Ｄ３「１，２５－（ＯＨ）２Ｄ３」对ＮＨ小鼠骨髓细胞培养在体外形成破骨细胞及其骨吸收的剂量效应和作用时象。方法收集ＮＨ小鼠骨髓细胞于含１０％胎牛血清的α－ＭＥＭ培养基中行体外培养，设置不同的１，２５－（ＯＨ）２Ｄ３浓度组和给药时间组，并于培养第３、６、９、１２天观察记录抗酒石酸酸性磷酸酶（ｔａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＴＲＡ