破骨细胞体外培养研究进展

破骨细胞是骨吸收的主要功能细胞,体外培养破骨细胞是骨吸收研究和抑制骨吸收药物开发研究的基础.该文综述破骨细胞体外培养常用的5种方法及近年研究进展,并对各种方法进行比较.成熟破骨细胞分离培养法仍是目前获得成熟破骨细胞的最佳途径;骨髓诱导破骨细胞培养法是目前最常用的破骨细胞培养法;脾干细胞诱导培养法和外周血单核细胞诱导培养法是近年新发展起来的培养方法,能排除骨髓基质细胞及其他造血干细胞干扰,更具有应用价值;骨巨细胞瘤破骨细胞样细胞分离培养法是其他破骨细胞培养方法的一个重要补充.     

体外培养破骨细胞的功能观察

观察破骨细胞在离体状态下的骨吸收功能。新鲜牛皮质骨经锯式切片机横切成５０μｍ厚０．５×０．５ｃｍ大小骨片。参照已建立的破骨细胞分离培养方法，从新生Ｗｉｓｔａｒ大鼠四肢长骨分离破骨细胞，培养于２．５ｃｍ细胞培养皿内或上述骨片上，相差倒置显微镜或扫描电镜观察，可见培养的细胞具有典型破骨细胞的形态特点，接种子骨片上的破骨细胞分别培养１、３、５、７天，扫描电镜观察，可见破骨细胞能在骨片表面形成吸收陷窝，其形态多样，深浅不一，边界清晰，底面粗糙，而且随培养时间延长，陷窝扩大，数量增多。结论，破骨细胞在体外培养条件下具有良好的骨吸收功能，可进行药物干预的研究。     

重组人骨保护素对体外培养兔破骨细胞的影响

目的观察重组人骨保护素(recombinanthumanosteoprotegerin,rhOPG)对体外培养兔破骨细胞(osteoclast,OC)生存和功能的影响。方法将rhOPG用于干预从新生兔分离出的OC,于干预后1、3、7d取细胞玻片、皮质骨片进行HE、Giemsa、甲苯胺蓝染色,并观察抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色阳性细胞和骨片吸收陷窝,扫描电镜进一步观察吸收陷窝形态。结果分离培养的兔OC多核形态明显;rhOPG对TRAP阳性OC生存的影响,1、3d结果差别不明显,7d的结果差异有显著性(P<0.05);rhOPG能够明显地抑制OC在骨片上形成吸收陷窝,三个时点计数结果差异均有显著性(P<0.01)。结论rhOPG可明显地抑制体外培养兔OC的骨吸收功能。     

体外培养破骨细胞骨吸收功能的检测和应用

体外培养破骨细胞骨吸收功能的检测和应用高建军王洪复审骨吸收是破骨细胞（ＯＣ）的主要功能，受内分泌激素和骨组织微环境的调控。如何检测ＯＣ的骨吸收功能一直是骨代谢研究的重要课题。随着ＯＣ分离培养技术的发展，体外检测ＯＣ骨吸收功能的指标不断完善。酶组织化学...     

体外破骨细胞分离培养方法的建立

本研究采用出生２４小时内的新生兔，从其四肢长骨中分离出破骨细胞，与盖玻片、骨磨片共同培养。相差显微镜观察到分离的多核细胞能够移动，并在骨片上形成吸收陷窝，扫描电镜观察到这些吸收陷窝内的胶原原纤维。另外，这些细胞用目前公认的鉴定破骨细胞的标志－酸性磷酸酶和降钙素染色，呈阳性反应。这些结果均表明：分离、培养破骨细胞的实验技术是成功的。     

高产量高纯度的破骨细胞分离培养

目的 获得高产量高纯度破骨细胞，为骨吸收的体外研究提供丰富的细胞来源。方法 将经典分离乳兔四肢骨破骨细胞的方法与1，25(OH)2D3诱导骨髓干细胞生成破骨样细胞的方法相结合，并应用0．05％胰蛋白酶／0．02％ EDTA联合消化的方法将其纯化。结果 该方法可诱导生成大量的破骨样细胞，0．05％胰蛋白酶／0．02％ EDTA联合消化可使破骨细胞纯化率达95％。诱导生成的破骨样细胞TRAP染色阳性，体外培养具有噬骨能力。结论 该培养方法可产生大量高纯度的破骨样细胞，可为破骨细胞的体外分子生物学研究提供丰富的细胞来源。     

破骨细胞及其骨吸收调控研究进展

一、概述破骨细胞是一个高度分化的多核巨细胞,直接参与骨吸收,是骨组织吸收的主要功能细胞。破骨细胞的来源:由于长期以来对于破骨细胞(Osteoclast,OC)的来源问题一直不清楚,给研究工作带来许多困难,因而对临床各种骨疾患的诊断及其防治水平,也不可能进一步深入和提高。对于破骨细胞来源的认识,在本世纪40～70年代,普遍应用的经典理论为多潜能的骨源细胞学说,认为破骨细胞是由骨源细胞融合而成。直至70年代中期还认为OC与成骨细胞(OB)为共同的祖代来源。这种观点多年来一直是疑问,不能被证实,现已被否定。自80年代初开始,提出了OC来源…     

破骨细胞体外培养技术

由于破骨细胞在骨质疏松及相关疾病中的关键作用,对它的研究成为攻克这些疾病的必由之路。选择便捷高效的体外培养方法,是开展体外破骨细胞研究的前提。破骨细胞是终末分化细胞,不能增殖传代,因此破骨细胞的体外培养一直是一个具有挑战性的难题。本文就常见的破骨细胞体外培养技术和鉴定方法做简要概述。     

黔岭藿对体外培养的破骨细胞作用的研究

从新生兔四肢长骨中分离的破骨细胞与牛骨片在体外培养后，加入不同浓度黔岭霍注射液再培养，并设立对照，用倒置相差显微镜观察黔岭霍对破骨细胞形成骨吸收陷窝的影响。结果显示黔岭著３个浓度组（０．１５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ）与对照组比较均能抑制破骨细胞在骨片上形成吸收陷窝的数量，增加药物浓度抑制作用亦趋增强（Ｐ＜０．０５）。     

BM210955对破骨细胞骨吸收的抑制作用

细胞水平研究国产双磷酸盐药物－ＢＭ２１０９５５的骨吸收抑制作用。由１日龄ＳＤ大鼠四肢长骨分离破骨细胞（ＯＣ）并接种于牛皮质骨薄切片上,在不同浓度ＢＭ２１０９５５作用下培养,定时取骨片作ＴＲＡＰ免疫组化染色,计数阳性多核细胞后,经超声去除细胞后作甲苯胺蓝染色,光镜下作吸收陷窝计数,数据以ｘ±ｓ表示,并与对照比较作ｔ检验。结果显示：①ＢＭ２１０９５５能降低体外培养ＯＣ的数目,１０－８ｍｏｌ／Ｌ组的ＴＲＡＰ阳性多核细胞较对照组减少７３％,差异具有非常显著性,Ｐ＜０．０１。②ＢＭ２１０９５５抑制ＯＣ的陷窝形成能力,１０－１０、１０－８ｍｏｌ／Ｌ组的抑制率分别为７６．３２％和８７．９９％,均与对照有明显差异,Ｐ＜０．０１。③上述结果与剂量有关,剂量越高,抑制效应越明显     

17β-雌二醇对体外培养破骨细胞钙离子浓度的影响

目的 :研究 1 7β -雌二醇对体外培养破骨细胞细胞内钙离子浓度 ( [Ca2 + ] i)的影响 ,探讨雌激素对破骨细胞骨吸收功能的调节机制。方法 :体外培养Wistar大鼠破骨细胞 ,用Fluo 3AM钙离子荧光探针进行细胞内钙离子荧光标记 ,激光扫描共聚焦显微镜测定不同浓度 1 7β -雌二醇 ( 1 7βE2 )对破骨细胞钙离子浓度的影响及观察破骨细胞的形态变化与伸展面积。结果 :1 7βE2 可诱发破骨细胞钙离子浓度的升高 ,伴随细胞变小 ,伪足回缩 ,破骨细胞伸展面积从 ( 1 386± 4 3) μm2 /细胞核下降至 ( 40 6± 31 ) μm2 /细胞核。结论 :1 7βE2 可诱发破骨细胞 [Ca2 + ] i的升高 ,细胞变小 ,伪足回缩。 1 7βE2 可能是通过 [Ca2 + ] i途径抑制破骨细胞的骨吸收功能     

源于脾细胞的破骨细胞样细胞体外培养及其对成骨细胞的影响

目的探讨破骨细胞及其亚细胞结构对成骨细胞生长的影响。方法C57雌性小鼠,经尾静脉注射5-FU后,取其脾脏细胞,在白介素(IL)-3,6和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、1α,25-(OH)2D3的诱导下获得大量的破骨样细胞(OLC)。将破骨样细胞、NaF、离心去除OLC的培养基及其亚细胞结构——细胞核、线粒体与成骨细胞共培养5d后,检测成骨细胞增殖率和碱性磷酸酶含量以及成骨细胞Cbfα1的表达活性。结果OLC及离心去除OLC的50%培养基均可使成骨细胞增殖率显著增加(P<0.05)。NaF、OLC、OLC细胞核和离心去除OLC的25%培养基均可使成骨细胞的碱性磷酸酶活性增高(P<0.05);离心去除OLC的培养基对成骨细胞的碱性磷酸酶比活性具有显著的促进作用(P<0.05)。NaF、OLC细胞质和离心去除OLC的50%培养基均可使成骨细胞的Cbfα1的表达明显加强(P<0.05)。结论OLC对成骨细胞的生长和功能均有促进作用。     

体外培养的破骨细胞细胞化学测量观察

本文采用Spraque-Dawloy大鼠体外破骨细胞培养及新鲜长骨组织破骨细胞印片方洼研究两种材料中破骨细胞细胞化学的异同，检测了酸性磷酸酶(AcP)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、β-酸性半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、NADH和NADPH脱氢酶．并使用Zeiss氏细胞扫描显微镜连接CD／MD20电脑图像分析系统，定量检测了以上酶的活性。结果表明，大鼠体外培养和新鲜组织印片的破骨细胞含有丰富的多种溶酶体酶和厌氧脱氢酶(线粒体酶)，新鲜组织印片的破骨细胞大多数脱氢酶的活性高于体外培养的破骨细胞。     

应用体外分离培养破骨细胞的技术评价人工骨

本文介绍如何应用分离培养破骨细胞的技术评价人工骨。家兔４８只,随机分成Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四组,每组１２只,人工造成家兔同侧桡骨１０ｍｍ缺损。分别植入不同材料的骨移植物,Ａ组为珊瑚羟基磷灰石,Ｂ组为人工合成羟基磷灰石,Ｃ组为人工多聚体,Ｄ组为自体骨。移植术后６、８、１２、１６周,分期处死动物,取出植入动物体内骨移植物并制成骨磨片,与体外分离的破骨细胞共同培养１周,扫描电镜发现,破骨细胞能够在植入动物体内     

氟对破骨细胞骨吸收陷窝的影响

目的 观察氟对大鼠破骨细胞(Osteoclast,OC)形成的骨吸收陷窝的影响。方法 通过机械分离新生大鼠乳鼠四肢长骨方法体外培养Oc,并于1 d后加入含不同浓度氟的培养基,观察氟对OC形成的骨吸收陷窝数量及面积的影响。结果 随染氟剂量的增加,骨吸收陷窝数及陷窝面积逐渐增加,各剂量组与对照组比差异均有显著性(P<0.05),其中尤以4.0mg/L染氟组最为明显(P<0.01)。结论 在一定的剂量范围内,随染氟剂量的增加,OC的骨吸收作用是增强的。     

新伐他汀体外对破骨细胞性骨吸收及大鼠骨代谢的影响

目的探讨新伐他汀体外对破骨细胞骨吸收功能的作用及其大鼠骨代谢的影响.方法采用体外成熟破骨细胞和大鼠颅盖骨培养体系,检测新伐他汀作用7 d后破骨细胞骨吸收陷窝和培养上清钙的变化;检测大鼠颅盖骨培养上清碱磷酶和钙含量,组织学观察颅盖骨形态学变化.结果新伐他汀体外可明显抑制破骨细胞骨吸收陷窝的形成及培养上清钙的释放,新伐他汀体外可增强大鼠颅盖骨培养上清碱磷酶的活性,组织学观察到新伐他汀使大鼠颅盖骨矿化增强.结论新伐他汀体外不仅可促进大鼠颅盖骨的成骨活性,并且可明显抑制破骨细胞骨吸收功能,对骨质疏松有重要的防治作用.     

成年大鼠破骨细胞体外培养及细胞凋亡的观察

目的　为研究骨重建过程中破骨细胞的关键作用,建立成年大鼠（１２ ～５０ 周龄） 破骨细胞的体外培养方法并进行细胞凋亡观察。方法　大鼠处死后,在无菌条件下取出股骨,剪去两骺端,以αＭＥＭ 将骨髓细胞冲洗出, 并离心洗细胞２ 次,置于αＭＥＭ 培养液,内含αＭＥＭ,体积分数为１０％ 的胎牛血清（ＦＣＳ） 和１α,２５（ＯＨ）２ Ｖｉｔ Ｄ３ １０ －８ ｍｏｌ／Ｌ,在２４ 孔板内,以体积分数为５ ％ 的ＣＯ２ ,３７ ℃,培养８ 天。按原位ＤＮＡ 末端标记（ＴＵＮＥＬ）检测试剂盒方法染色细胞,以荧光显微镜观察细胞凋亡。结果　经活体观察、ＨＥ染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（ＴＲＡＰ） 染色,光学显微镜、扫描电镜观察骨片之陷窝的形成,证实培养的细胞为破骨细胞;ＴＵＮＥＬ 检测,荧光显微镜下可见破骨细胞核染色质浓缩、裂解等凋亡细胞的典型变化与未凋亡的破骨细胞。结论　本实验建立了成年大鼠破骨细胞的体外培养方法并进行细胞凋亡观察。     

两种方法培养大鼠破骨细胞的比较研究

目的比较分析直接分离培养的Wistar大鼠破骨细胞（osteoclast，OC）和诱导培养的Wistar大鼠破骨样细胞（osteoclast-like cell，OLC）的形态和功能的差异，为体外药物干预试验奠定基础。方法采用两种培养法，即从新生（24h内）的Wistar大鼠的四肢长骨骨髓腔内壁机械分离成熟OC直接培养和10^-8mol／L的1，25（OH）2D3诱导4周龄Wistar大鼠骨髓单核细胞形成OLC的方法，对获得的OC／OLC进行形态和破骨功能观察。结果两种方法都培养出了抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色阳性的多核细胞，诱导法获得的破骨细胞数量较多（P〈0．05）。成熟OC与诱导获得的OLC形态特征相似，但后者在骨片上形成的陷窝较小而浅。结论直接分离培养法可获得骨吸收功能较活跃的OC，但数目较少，适合骨吸收功能分析、破骨迁移黏附、凋亡研究及单细胞分子生物学研究。1，25（OH）2D3诱导鼠骨髓单核细胞形成的OLC数量较多，但骨吸收功能较差，适合用于破骨细胞分化发育过程的研究。     

破骨细胞骨吸收机制的研究进展

人体骨骼依赖于骨吸收和骨形成之间的动态平衡 ,当破骨细胞的骨吸收功能超过成骨细胞的骨形成作用后 ,这一平衡的失调将导致骨质疏松或骨质破坏。因妇女绝经、过量服用糖皮质激素等多种因素引起的骨质疏松 ,Ｐａｇｅｔ’ｓ病 ,以及癌症骨转移造成的骨破坏 ,都与破骨细胞异常活跃的分化增殖和骨吸收功能有关。因此 ,破骨细胞 (ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ,ＯＣ)是治疗上述疾病的靶细胞[1,2 ] 。1　破骨细胞分化形成的微环境ＯＣ是一种特殊类型的多核巨细胞 ,来源于ＣＤ3 4+ 的骨髓造血干细胞 ,其分化主要受骨髓基质细胞和成骨细胞所分泌的集落细胞…     

应用颅骨-破骨细胞联合培养体系研究先天性成骨不全破骨细胞骨吸收活性

目的 先天性成骨不全(OI)的主要临床表现为骨矿化过程不良,骨量丢失,骨骼畸形和骨折.但是其发病机理,尤其在其骨再建过程中成骨细胞(OB)及破骨细胞(OC)的功能改变尚不清楚.本实验以先天性成骨不全小鼠模型,oim/oim为基础,应用破骨细胞-颅骨联合培养体系研究OB和OC两种细胞在骨再建过程中的功能改变和相互作用.方法 本实验采用小鼠颅骨(CAL)组织培养模型.本模型采用颅骨组织培养,利用颅骨中成骨细胞可以从颅骨片游离出到培养皿及颅骨表面,从而支持培养皿及颅骨表面前体破骨细胞分化成为成熟破骨细胞,并吸收颅骨产生吸收陷窝.本实验中,共2组颅骨-破骨细胞联合培养体系:(1) 对照组(WT)颅骨与对照破骨细胞(WTCAL-WTOC);(2) OI颅骨与OI破骨细胞(OICAL-OIOC).联合培养颅骨及骨髓组织14日后,以TRAP免疫组化染色方法识别破骨细胞,ALP免疫组化染色方法识别成骨细胞,计算OC/OB.破骨细胞骨吸收活性以颅骨表面骨吸收陷窝占颅骨表面百分比并除以培养系统中的破骨细胞数表达.结果 第14日,OICAL-OIOC组的破骨细胞数低于WTCAL-WTOC组(92.50+23.18/mm2 对比 379.00+ 136.53/mm2,P<0.01); OICAL-OIOC组的OC/OB明显低于WTCAL-WTOC组(0.68+0.57对比1.65+0.67,P<0.01);OICAL-OIOC组OI破骨细胞的吸收能力高于WTCAL-WTOC组(27.76+22.81对比7.32+5.09,P<0.001).结论 oim/oim小鼠破骨细胞-颅骨培养体系中破骨细胞的数目明显减少,成骨细胞支持破骨细胞分化能力减低;但其破骨细胞骨吸收活性明显增强,以代偿成骨细胞功能,维持骨再建过程中成骨过程及骨吸收过程的平衡.