抑癌基因Deleted in Liver Cancer1在人胶质瘤细胞株中的作用及机制

目的探讨抑癌基因DLC1表达的isoform1及isoform2两个亚型在人胶质瘤细胞株中的表达、功能及机制。方法RT-PCR方法检测体外培养的胶质瘤细胞株U87-MG和SHG-44中DLC1isoform1,2的mRNA水平;10μM5-aza-2'-de-oxycytidine(5'-AZA)或者共含有500nMtrichostatinA(TSA)处理细胞36h,检测DLC1isoform1,2的表达;MTT方法检测转染DLC1isoform2及没有GAP活性的isoform2突变体DLC1-K714E表达质粒对胶质瘤细胞株U87-MG和SHG-44增殖的影响。结果在U87-MG细胞株中没有检测到DLC1isoform1;在SHG-44中检测到微量的DLC1isoform1,5'-AZA或者共含有TSA处理使其表达上调;DLC1isoform2在上述细胞株都能检测到,5'-AZA或者共含有TSA处理细胞未改变其表达水平;过表达DLC1isoform2及其突变体DCL1-K714E促进U87-MG和SHG-44细胞株增殖。结论DLC1isoform1在胶质瘤细胞株中不表达或低表达,可能原因是由于不转录或者启动子发生甲基化。DLC1isoform2有一定的表达水平,高表达的DLC1isoform2促进胶质瘤细胞增殖,且不依赖GAP活性。     

丙戊酸钠对脑胶质瘤细胞系SHG-44促增殖分化作用

目的研究丙戌酸钠对培养人脑胶质瘤SHG-44细胞的增殖抑制和分化诱导.方法以0.25、0.5、1、2、4mol/L丙戊酸钠处理处理SHG-44细胞,用MTT比色、用流式细胞术、光镜观察细胞形态、免疫组织化学检测GFAP.结果SHG-44细胞经丙戊酸钠处理后①细胞增殖受到明显抑制,并具有时间、剂量依赖性;②细胞周期受阻,S期细胞比例减少,G1期细胞增多;③胶质纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)表达增强.结论丙戊酸钠能抑制人脑胶质瘤SHG-44细胞的增殖,1mmol/L丙戊酸钠能诱导SHG-44细胞发生明显分化.     

曲古菌素A诱导髓系白血病细胞株U937细胞凋亡的分子途径

目的　研究曲古菌素A(TSA)诱导髓系白血病细胞株U937细胞凋亡的分子途径。方法　不同浓度 ( 50、1 0 0、2 0 0、30 0、4 0 0nmol/L)的TSA在不同时间范围 ( 1 2、2 4、36、4 8和 6 0h)作用于U937细胞。用流式细胞仪检测细胞的凋亡率和Fas抗原 (CD95)的表达 ,用Westernblot法检测凋亡蛋白caspase 6、caspase 8和caspase 9的蛋白表达。结果　TSA诱导髓系白血病细胞株U937细胞的凋亡 ,并呈时间、剂量依赖性。在IC5 0 浓度 ( 30 0nmol/L)作用 2 4h凋亡细胞超过 50 % ;1 0 0～ 30 0nmol/LTSA作用 2 4h ,U937细胞Fas抗原表达也明显升高 (P <0. 0 1 )。TSA作用凋亡蛋白caspase 6、caspase 8和caspase 92 4h后 ,蛋白表达明显增高 (P <0 . 0 5)。结论　TSA诱导白血病细胞系U937凋亡涉及死亡受体参与的外源性途径和线粒体参与的内源性途径。     

TRPV1基因过表达逆转录病毒载体的构建和鉴定

目的 TRPV1基因过表达逆转录病毒载体的构建和鉴定研究。方法 PCR法扩增TRPV1基因的编码序列,克隆到pBaBe-puro载体上。对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用磷酸钙法制备pBaBe-puro-TRPV1逆转录病毒,将其感染到U87-MG细胞,经嘌呤酶素筛选阳性克隆后用荧光定量PCR和Western blot法检测TRPV1表达。结果经DNA测序和酶切鉴定表明,pBaBe-puro-TRPV1表达载体构建成功。pBaBe-puroTRPV1逆转录病毒感染U87-MG细胞后,细胞中TRPV1表达量明显增高。结论成功构建了人TRPV1基因的pBaBe-puro-TRPV1表达载体。pBaBe-puro-TRPV1能有效上调TRPV1基因在U87-MG细胞中的表达,为应用其研究TRPV1在利多卡因致细胞损伤中的作用奠定了基础。     

长链非编码RNA AGAP2-AS1在胶质瘤增殖过程中作用机制的研究

目的探究长链非编码RNA AGAP2-AS1在胶质瘤增殖过程中的作用机制。方法选取2018年12月-2019年11月期间的30例胶质瘤患者为观察组,同时期的30例脑外伤患者为对照组。比较两组的组织AGAP2-AS1 mRNA表达量、Ras及ERK1/2蛋白表达情况,并比较观察组中不同分级胶质瘤的AGAP2-AS1 mRNA表达量、Ras及ERK1/2蛋白表达情况,比较转染siRNA AGAP2-AS1与siRNANC的U87及U251细胞克隆数。结果观察组的RNA AGAP2-AS1 mRNA表达量、Ras及ERK1/2蛋白表达显著高于对照组,不同分级胶质瘤的RNA AGAP2-AS1 mRNA表达量、Ras及ERK1/2蛋白表达比较,差异有统计学意义(P<0.05),转染siRNA AGAP2-AS1的U87及U251细胞克隆数显著低于siRNA-NC,差异有统计学意义(P<0.05)。结论长链非编码RNA AGAP2-AS1可通过调控ERK/MAPK信号通路影响胶质瘤的增殖,下调AGAP2-AS1可显著影响胶质瘤细胞的克隆形成能力。     

检测肿瘤凋亡和p53再生化合物对不同p53状态人脑胶质瘤细胞的生长抑制作用

目的探讨p53靶向小分子RITA对不同p53状态人脑胶质瘤细胞的生长抑制作用。方法基因测序确定实验所用U251和U87细胞中p53基因状态;MTS法检测0μmol/L、1μmol/L、4μmol/L、10μmol/L RITA作用于U251和U87细胞0 h、24 h、72 h、120 h、168 h的增殖情况;qRT-PCR法和Western blot法分别检测抑癌基因p53、p21的mRNA和蛋白质表达水平;计算抑制率和IC50。结果基因测序结果表明实验所用U251细胞表达突变型p53基因而U87表达野生型;RITA对2种细胞的增殖均有显著抑制作用,且对U251的抑制作用更强;5μmol/L RITA作用下,U251中p53、p21表达均显著增加,U87中p21表达增加,p53 mRNA表达变化不明显,但p53蛋白累积显著增加;RITA作用于U251、U87细胞24 h和120 h的IC50分别为123.870μmol/L、776.682μmol/L和2.817μmol/L、7.147μmol/L。结论RITA能有效促进人脑胶质瘤细胞U251和U87中p53和p21基因表达,发挥高效生长抑制作用,且含突变型p53的U251比含野生型p53的U87效果显著。     

Tamoxifen对人脑胶质瘤细胞SHG-44辐射敏感性的影响

目的 研究tamoxifen(TAM,三苯氧胺)对人脑胶质瘤细胞SHG-44辐射敏感性的影响。方法 以⁶⁰Co为辐射源,细胞接受0、1、3、5、7、9Gy的γ射线照射,³H-TdR掺入法检测脑胶质瘤细胞DNA合成。人体外周血中T、B淋巴细胞分别由植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)刺激后,同法测定TAM对T、B淋巴细胞转化的影响。结果 TAM使SHG-44细胞的剂量-效应曲线发生改变,且向左移,D₀值下降。当TAM浓度在2~8μmol/L时对T、B细胞转化无明显抑制作用,与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。结论 TAM能提高人脑胶质瘤细胞SHG-44对⁶⁰Coγ射线的辐射敏感性,且在2~8μmol/L浓度时对外周血T、B免疫细胞的增殖无影响。     

应用干扰RNA慢病毒技术抑制人脑胶质瘤细胞中红细胞生成素受体mRNA的表达

目的探讨重组红细胞生成素受体(EPOR)干扰RNA慢病毒抑制人脑胶质瘤细胞中EPOR mRNA的表达情况。 方法选择人脑胶质瘤U251细胞株和人胚肾293T细胞株为研究对象。利用RNA干扰技术构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,进行病毒包装、病毒收集、病毒滴度检测后,感染人脑胶质瘤U251细胞,选择最佳MOI值;采用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测U251细胞和感染重组EPOR干扰RNA慢病毒的U251细胞EPOR mRNA相对表达量,并计算重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞EPOR mRNA表达的干扰效率。 结果①本研究成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,并测定其病毒滴度为1×10¹⁴TU/L。②MOI值为100的重组EPOR干扰RNA慢病毒感染U251细胞的荧光蛋白表达量最高,MOI值为1的荧光蛋白表达量最低。③重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞的干扰效率为69%,并使EPOR mRNA表达明显受到抑制。 结论成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,使U251细胞的EPOR mRNA相对表达量明显降低,为后续EPOR转录水平变化的相关研究奠定实验基础。     

恶性人脑胶质瘤的HSV-Tk/GCV自杀基因治疗系统的构建及应用研究

目的构建恶性人脑胶质瘤细胞株TJ899的单纯疱疹病毒的胸腺激酶/丙氧鸟苷（HSV-Tk/GCV）自杀基因治疗系统，探讨该体系在脑胶质瘤治疗中的作用。方法采用PCR、RT-PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建由自杀基因pcDNA3.1（-）CMVTK表达载体；用脂质体介导法将pCMVTK质粒转染进入TJ899恶性人脑胶质瘤细胞，并用M IT法检测感染后细胞对（GCV）的敏感性。结果pCMVTK质粒经测序证实含有TK目的基因；脂质体介导Pcmvtk质粒成功转染了TJ899细胞，并在体外实验研究中显示很好的治疗效果。结论建立了作用于恶性人脑胶质瘤细胞株TJ899的HSV-Tk/GCV自杀基因治疗系统，为脑胶质瘤的临床研究打下了基础。     

新靶点CDK2干扰RNA对人脑胶质瘤增殖影响

目的 构建4个新靶点的人细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)干扰RNA真核表达载体,转染人脑胶质瘤细胞后,检测出干扰效果最好的载体及细胞增殖能力的变化.方法 构建4个新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体并用双酶切和测序鉴定;分别转染上述4个载体到人脑胶质瘤细胞株SHG44;通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)比较转染后CDK2 mRNA的表达量,选出干扰效果最好的一个,检测细胞增殖能力的变化.结果 成功构建4个新靶点的CDK2干扰RNA真核表达载体PCDK2-1、PCDK2-2、PCDK2-3、PCDK2-4;CDK2 mRNA表达和细胞增殖明显受到抑制,PCDK2-1的干扰效果为56％;PCDK2-1-SHG44细胞与对照组相比增殖能力减弱.结论 成功构建并筛选出效果最好的新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体,并使SHG44细胞的增殖水平降低.     

曲古抑菌素A和多西他赛联合应用治疗前列腺肿瘤的实验研究

目的研究组蛋白去乙酰化抑制药物与常用的紫杉类化疗药物联合应用对人类前列腺癌细胞的杀伤作用,探讨其可能的分子机制。 方法用不同浓度的组蛋白去乙酰化抑制药物曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)和紫杉类化疗药物多西他赛(Docetaxel,DTX)分别处理DU145和22Rv1前列腺肿瘤细胞,体外观察二者对肿瘤细胞的细胞毒作用。采用水溶性四唑盐(water soluble tetrazolium,WST-1)法检测细胞的增殖抑制率;蛋白质免疫印迹(western blot,WB)检测细胞中DNA损伤标志物磷酸化H2A.X(p-H2A.X)和细胞凋亡标志蛋白聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)特异性裂解片段的表达水平;采用定量实时荧光聚合酶链反应(quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测细胞中相关肿瘤抑制分子Maspin、p21^CIP1/WAF1和Bax的转录表达水平。 结果TSA和DTX对于前列腺肿瘤细胞增殖的抑制作用随着浓度升高而增强。TSA对DU145细胞的细胞毒作用(IC50=0.16 μM)较对22Rv1细胞(IC50=0.06 μM)弱。而DTX对DU145细胞的细胞毒作用则较对22Rv1细胞表现更显著。低剂量的TSA(0.01 μM,0.1 μM)能协同DTX抑制肿瘤细胞的增殖。DTX能诱导肿瘤细胞中的PARP分子产生细胞凋亡的特异性裂解、使p-H2A.X表达水平升高,并促进肿瘤抑制分子MASPIN、p21^CIP1/WAF1和细胞凋亡分子Bax的转录表达。使用低剂量的TSA处理虽未见产生PARP的细胞凋亡特异性裂解片段和p-H2A.X表达升高,但促进DU145细胞表达maspin和Bax,也使22Rv1表达maspin和p21^CIP1/WAF1升高。同时TSA协同DTX显著诱导DU145细胞转录表达maspin、p21^CIP1/WAF1和Bax,协同诱导22Rv1细胞转录表达maspin和Bax分子。 结论TSA和DTX均能抑制肿瘤细胞增殖。DTX处理能有效损伤肿瘤细胞的DNA,诱导肿瘤细胞凋亡。联合应用TSA和DTX可以显著提高抗肿瘤相关分子的表达。这种药物诱导的细胞毒作用可能是通过诱导肿瘤抑制基因的表达而发挥作用,并具有组织和细胞特异性。该结果为临床应用TSA和DTX药物干预和治疗前列腺肿瘤提供用药指导,同时也提醒临床医师用药时必须考虑患者的个体化差异。     

RNA干扰HMGA1基因表达对神经胶质瘤细胞增殖凋亡的影响及机制

目的 探讨RNA干扰HMGA1基因表达对神经胶质瘤细胞增殖凋亡的影响及机制。 方法 RT-PCR及Western blot检测神经胶质瘤组织中HMGA1的mRNA及蛋白表达;siRNA-NC、HMGA1-siRNA1、HMGA1-siRNA2转染人神经胶质瘤U251细胞,未转染任何siRNA作为空白对照组,48 h后检测各组细胞中HMGA1的蛋白表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、β-catenin、cyclin D1蛋白表达。 结果 神经胶质瘤组织中HMGA1基因的mRNA及蛋白表达均显著高于瘤旁组织(P<0.01);RNA干扰HMGA1基因能显著抑制其表达,HMGA1-siRNA2组的抑制效果更明显,选择作为后续研究;与对照组及siRNA-NC组比较,HMGA1-siRNA组细胞存活率及Ki67、PCNA、β-catenin、cyclin D1蛋白表达显著降低,细胞凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.01)。 结论 HMGA1基因在神经胶质瘤组织中高表达,抑制其表达可通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制人神经胶质瘤U251细胞的增殖及促进凋亡。     

蛇毒解聚素抑制荷U87胶质瘤裸鼠移植瘤的实验研究

目的 研究蛇毒解聚素在可移植性人脑胶质瘤间质化疗的疗效并探讨其作用机制.方法 建立BALB/c裸鼠U87胶质瘤移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为两组,采用间质内注射给药方法.蛇毒解聚素组:蛇毒解聚素40μg/d;对照组:为空白对照组,瘤内接种0.9%NaCl溶液,不给药,每组各15只裸小鼠.持续3周.定期观察肿瘤生长情况并测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线图并计算抑瘤率.全部BALB/c裸鼠移植瘤石蜡标本用SP法免疫组化染色,检测移植瘤组织中的微血管密度(MVD)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达.结果 与对照组相比,蛇毒解聚素组均能抑制肿瘤生长(P＜0.05),其体积抑瘤率为50%,并能明显降低肿瘤MVD(14.16 4±2.49比38.01±6.07)和下调移植瘤组织中bFGF的蛋白表达(免疫反应积分为2.38±0.91比6.00±1.15).结论 蛇毒解聚索能明显抑制U87裸鼠移植瘤生长.     

新靶点CyclinE干扰RNA对人脑胶质瘤增殖的影响

目的构建人CyclinE建新靶点的干扰RNA真核表达载体,转染人脑胶质细胞瘤U251细胞,观察CyclinE表达受抑制后的人脑胶质瘤细胞的增殖能力的变化,为进一步研究CyclinE表达受抑制后对人脑胶质瘤细胞质和细胞核蛋白组学的影响及人脑胶质瘤发生、发展、诊断与治疗提供有价值的资料。方法①构建4个新靶点Cyclin E干扰RNA的真核表达载体后,用双酶切和碱基序列测定的方法鉴定载体构建成功与否。②用Lipofectamine 2000转染4个成功构建的载体到胶质瘤U251细胞株,通过RT-PCR的结果检测转染后CyclinEmRNA表达量,选出干扰效果最好的1个。③用塞唑蓝（MTT）法检测CyclinE沉默后细胞增殖能力的变化。结果①成功构建了4个新靶点的CyclinE干扰RNA真核表达载体,即PCyclinE-1、PCyclinE-2、PCyclinE-3、PCyclinE-4。②CyclinE mRNA表达明显受到抑制,并获得效果最好的CyclinE干扰RNA真核表达载体。③PCyclinE-1-U251组细胞与两对照组相比增殖能力减弱。结论成功构建了新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体,与对照组比增殖能力削弱。     

金雀异黄素对U251MG的抑制作用及对癌基因表达的影响

[目的]探讨金雀异黄素(Genistein)对胶质瘤细胞株U251MG增殖的影响及可能的作用机制。[方法]用MTT比色法观察不同浓度Genistein在不同作用时间下对U251MG细胞增殖的影响,并通过流式细胞仪和免疫细胞化学染色检测p53(突变型)、c-erbB1、c-myc、cyclinD1蛋白表达。[结果]当Genistein在达到一定浓度或(和)一定时间后,对U251MG细胞增殖均有不同程度的抑制作用,且呈时间剂量依赖性。U251MG细胞经Genistein作用48h后,p53(突变型)、c-myc基因蛋白表达均较对照组明显下降(F=25.766,P﹤0.01;F=22.974,P﹤0.01),且呈剂量依赖性,而c-erbB1、cyclinD1基因蛋白表达无明显变化(F=0.984,P﹥0.05;F=2.416,P﹥0.05)。[结论]Genistein对U251MG细胞的增殖有明显的抑制作用,其抗肿瘤的机制可能与p53(突变型)和c-myc蛋白表达降低有关。     

曲古抑菌素A与5-氟尿嘧啶协同对肝癌细胞HepG2的抑制作用

[目的]研究5-氟尿嘧啶(5-FU)与曲古抑菌素A(TSA)单独及联合应用对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用,并初步探讨其与NF-κBp65和AKT表达的关系。[方法]以MTT法观察5-FU或(和)TSA对HepG2细胞生长的影响,Hoechst染色法分析细胞凋亡情况,Westernblot检测NF-κBp65和AKT蛋白表达水平的变化。[结果]与对照组相比,5-FU与TSA均可导致处理的细胞增殖速度减慢,且抑制效应随药物剂量的增加而增强,两药联合应用可明显增强其抑制作用,促进HepG2细胞凋亡,并降低NF-κBp65和AKT蛋白的表达(P﹤0.01)。[结论]TSA和5-FU联合应用可能通过协同调控下调NF-κBp65与AKT蛋白表达而抑制HepG2细胞的增殖。