携带信号肽NT4-GFP-穿膜肽Ant融合基因的重组腺相关病毒载体的构建及意义

目的：构建携带具有穿膜功能的融合报告基因NT4-GFP-Ant基因的重组腺相关病毒载体。方法：应用PCR技术和T载体克隆法克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因;用T4 DNA连接酶将测序正确的GFP与已构建成功的Ant基因片段及PBV220/NT4线性质粒载体定向连接,构建PBV220/NT4-GFP-Ant融合载体,酶切获取融合基因,并将其连入腺相关病毒载体PSSHG中,构建PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关载体并进行酶切鉴定。结果: T-easy/GFP经EcoRⅠ酶切后,可得到730 bp左右的片段,GFP基因经DNA测序证实与GenBank序列一致;pBV220/NT4-GFP-Ant经BamHI/EcoRⅠ联合双酶切后,得到约为 1 000 bp的基因片段; PSSHG /NT4-GFP-Ant经 BamHI/EcoRⅠ联合双酶切后,得到大小约为1 000 bp长度的基因片段。结论：成功克隆GFP基因,成功构建NT4信号肽-GFP-Ant穿膜肽融合基因和PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒载体。     

NT4 TAT 6×His VHLβ结构域肾癌抑制融合肽cDNA克隆的构建

目的构建VHL蛋白(von Hippel Lindau protein, pVHL)β结构域肾癌抑制融合肽cDNA,并将其应用于肾癌的微基因治疗。方法分别设计合成pVHLβ结构域104 123短肽cDNA的正向和反向引物以及编码TAT 6×His cDNA的正、反向引物,使用互为引物模板PCR方法,扩增获得具有NaeI/Eco72I酶识别位点的TAT 6×His cDNA片段和具有Eco72I/BamH I酶识别位点的VHLβ抑制肽cDNA片段,将两个片段分别克隆到pGEM T easy中,使用双脱氧终止法测序,通过DNASIS软件分析同数据库资料一致性和编码的氨基酸序列。用Nae I和BamH I双酶切获取的TAT 6×His VHLβcDNA片段插入到具有NT4信号肽的pBV220载体中,构建了pBV220 NT4 TAT 6×His VHLβ质粒。结果经DNA测序证实,获得了编码TAT 6×His cDNA片段和编码VHLβ抑制肽的cDNA片段,分析证实核酸序列和推导的氨基酸同数据库资料一致。重组质粒pBV220 NT4 TAT 6×His VHLβ酶切图谱证实已将NT4 TAT 6×His VHLβ融合肽cDNA克隆到pBV220原核表达载体中。结论成功扩增了编码TAT膜渗透肽和6×His标签肽以及VHL抑癌基因β结构域肾癌抑制肽的cDNA片段,构建了具有NT4信号肽的TAT 6×His VHLβ融合肽cDNA。     

人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的 设计并合成人TERT特异性的锤头状核酶(hammerhead ribozyme)基因并构建其真核表达载体.含有核酶靶基因hTERTcDNA保守序列的T载体pMD18-T-hTERT的构建.方法 运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ),将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3.1(+)中,重组子由BamH I和EcoR I酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序.RT-PCR法扩增目的 基因cDNA保守序列,与pMD-18进行T-A连接,重组子经菌液PCR及测序鉴定.结果 RZ人工合成后与pcDNA 3.1(+)连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3.1(+)的BamH I和EcoR I位点之间,命名为pcDNA 3.1-RZ.220bp的hTERT基因cDNA保守序列准确克隆于pMD18-T,命名为pMD18-T-hTERT.结论成功合成hTERT特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的pMD18-T-hTERT载体.     

PEGFP-C1-PHF6质粒的构建和鉴定

目的:构建含有PHF6基因的PEGFP-C1-PHF6重组质粒并对重组质粒进行鉴定,为进一步研究其在核仁中的定位和功能奠定基础。方法:野生型293细胞中提取总RNA,反转录为cDNA后采用聚合酶链反应从总cDNA中扩增出PHF6基因,上下游分别引入EcoRⅠ及BamHⅠ酶切位点,双酶切后将其插入PEGFP-C1质粒中,构建PEGFP-C1-PHF6重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌DH5α进行克隆,提取质粒进行酶切和测序鉴定。脂质体法转染重组质粒至Hela细胞株中,Western blot检测PHF6基因蛋白的表达情况。结果:重组质粒经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定及DNA测序鉴定结果均证实PHF6基因已正确克隆到PEGFP-C1载体中,Western blot结果进一步证实PEGFP-C1-PHF6重组质粒构建正确。结论:成功并正确构建PEGFP-C1-PHF6重组质粒。     

人胎盘TRAIL基因cDNA的克隆和鉴定

目的:利用基因工程技术克隆TRAIL基因全长cDNA,并构建其原核表达载体.方法:从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了TRAIL,将其连接于克隆载体pMD18-T中,并通过酶切及测序鉴定载体构建的正确性.结果:应用RT-PCR技术和BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切成功获得1049 bp的目的片段,测序分析结果表明该基因序列与报道的TRAIL基因片段的序列完全相同.结论:成功克隆了TRAIL基因的cDNA全长,为其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：构建人血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF-C的cDNA序列，设计合成一对5′端分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法克隆人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的VEGF-C cDNA(1．26Kb；回收PCR产物(1．28Kb），并将其连接至克隆载体pMDl8-T中；重组的pMDl8-T在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF-C cDNA全长的酶切片断(1．27Kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1(-)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT-PCR产物合有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pMDl8-T中含有正确的人VEGF-C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1（-)中含有人VEGF-C cDNA全长序列。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体VEGF-C／pcDNA3．1（-)。     

人resistin基因原核表达载体构建和表达

【目的】构建人resistin基因原核表达载体并观察其表达，为开展对resistin的研究打下实验基础。【方法】酚氯仿一步法从一位2型糖尿病合并胆管癌患腹壁皮下脂肪组织抽取总RNA，RT-PCR法扩增出resistin基因cDNA，经测序后，PCR产物亚克隆入 T载体，用EcoR I和Kpn I分别酶切重组T质粒和原核表达载体pGENKS，然后resistin基因片段和表达载体通过T4DNA连接酶进行定向连接，用核酸内切酶EcoR I、KpnI酶切和测序方法鉴定出重组表达质粒。重组表达质粒转化大肠杆菌JM109，经1mmol／LIPTG在32℃诱导表达2h，裂解细菌，进行PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达。【结果】RT-PCR扩增产物分子大小为327bp，序列分析表明为人resistin基因完整编码区。PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后，从细菌质粒中酶切回收了目的片段。重组表达质粒经EcoR I和Kpn I双酶切后能产生出327bp、4980bp大小的两个片段，序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区，基因编码无移位，PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为39．5kD的融合蛋白。【结论】成功构建了人resistin基因原核表达载体，且构建的载体能表达出含目的蛋白的融合蛋白，为下一步研究打下了实验基础。     

人卵泡抑素基因全长cDNA的克隆

目的克隆人卵泡抑素(FS)全长cDNA基因.方法采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中扩增FS cDNA,构建PMD18-T载体,采用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切以及DNA测序进行鉴定.结果RT-PCR扩增长度为968 bp的基因片段,BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切结果显示重组T载体中含有目的基因片段,测序结果显示编码区无基因突变.结论人FS全长cDNA基因克隆成功,并构建了重组PMD18-T载体.     

人卵泡抑素基因全长cDNA的克隆

目的 克隆人卵泡抑素(FS)全长cDNA基因。方法 采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中扩增FS cDNA。构建PMD18-T载体，采用BamHⅠ、HindⅢ双酶切以及DNA测序进行鉴定。结果 RT-PCR扩增长度为968bp的基因片段，BamHⅠ、HindⅢ双酶切结果显示重组T载体中含有目的基因片段，测序结果显示编码区无基因突变。结论 人FS全长cDNA基因克隆成功，并构建了重组PMD18-T载体。     

tRNA~(val)-CTE复合核酶真核表达载体构建

目的构建tRNA^val—CTE复合核酶真核表达载体，为进一步研究打下基础。方法用RT—PCR法扩增CTE DNA；合成含tRNA^val启动子和HCV5-NCIK区195住的核酶以覆内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ序列，通过退火连接到pPUR质粒的BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点之间，构建质粒pPHCV—Rz；用KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切后，将CTE cDNA定向插入表达载体pPHCV—Rz多克隆位点中，构建成重组表达质粒，并用酶切分析和序列测定进行了鉴定。结果酶切鉴定和测序证实tRNA^val启动子和HCV5-NCIK区195住的核酶基因以覆CTE cDNA被正确克隆入真核表达载体pPUK。结论tRNA^val-CTE复合核酶真核表达载体的成功构建，为开展利用tRNA^val-CTE复合核酶切割HCV RNA的研究奠定了基础。     

血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.     

应用聚合酶链反应方法突变和克隆人CD4基因

ＣＤ４是Ｔ淋巴细胞分化抗原，是ＨＩＶ的受体。作设计并化学合成了一对ＰＣＲ引物，以人ＣＤ４ｃＤ－ＮＡ为模板，成功扩增出人ＣＤ４Ｎ端两个结构域的编码基因（６００ｂｐ），并在此基因两端分别插入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点及起终止码。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点将ＣＤ４基因克隆入ｐＵＣ１９质粒，经过ＰＣＲ和酶切鉴定得到ＣＤ４重组克隆ｐＴ４０３．ＤＮＡ序列分析结果表明，所克隆ＣＤ４基因与已...     

hHGF-αcDNA的克隆及表达载体的构建

目的定点突变法扩增制备完整hHGF-α cDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果以含有人HGF cDNA全序列的质粒pRC/CMV-hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应(PCR),扩增hHGF-α cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增得到了1.34 kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶Xho Ⅰ酶将其切为386 bp、954;bp两个片段,分别以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ与pBSKS载体连接重组,对目的基因分段克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGF cDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ从pBSKS-HGF-α 386、pBSKS-HGF-α 954中切出的386 bp、954 bp两个片段以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220-HGF-α,限制性内切酶图谱分析显示HGF-α cDNA插入到载体pBV220的EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS-PAGE显示一分子量与单体hHGF-α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论设计制备了hHGF-α链cDNA,克隆建立了hHGF-α链原核表达质粒。     

EcoRⅡ限制性内切酶和甲基化酶基因克隆,表达和缺失突？…

目的 同时克隆ＥｃｏＲⅡ限制性内切酶基因和ＥｃｏＲⅡ甲基化酶基因,初步探讨该限制－修饰系统的协同表达机制。方法 采用外切酶Ⅲ删除法构建单向缺失亚克隆,根据亚克隆的酶活性对上述两种基因进行初步定位,经核酸序列测定确定亚克隆的缺失部位,再以Ｓ１核酸酶保护分析法测定基因的转录起始点。     

PCR靶向克隆法构建携带人类神经生长因子β基因的含有EGFP的重组腺病毒穿梭质粒

目的:在靶向克隆酶的作用下,利用PCR靶向克隆构建携带人神经生长因子的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-hNGFβ-EGFP。方法:按PCR引物设计原则设计两条引物,分别在上下游引物的5′端加上12个碱基与线性化载体切口两端同源载体序列,引物合成后PCR反应扩增目的基因hNGF-β,提纯后与EcoRⅤ酶切的穿梭质粒pShuttle-IRES-hrEGFP在靶向克隆酶(LPReccoenzyme)的作用下37℃孵育15min,转化感受态大肠杆菌,碱裂解法制备及纯化质粒DNA。结果:EcoRⅤ酶切鉴定证实pShuttle-hNGFβ-EGFP构建成功。结论:在不需要限制性内切酶的情况下用靶向克隆酶连接可快速、准确得到穿梭质粒pShuttle-hNGFβ-EGFP。     

FLAG Pull-down技术筛选人乳腺癌细胞中NGAL相互作用蛋白

目的 构建含有NGAL基因的p3XFLAG-NGAL真核表达载体并对其进行鉴定,获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白.方法 提取MCF7细胞中总RNA,反转录为cDNA后采用聚合酶链反应扩增NGAL基因,上下游分别引入NotⅠ和EcoRⅠ酶切位点,双酶切后将其插入p3XFLAG-CMV-14质粒中,构建p3XFLAG-NGAL重组质粒,并进行双酶切和测序鉴定.采用脂质体法转染该质粒至MCF7细胞中,经Western blot检测FLAG-NGAL融合蛋白的表达情况.再使用FLAG pull-down技术和蛋白质谱测定获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白.结果 经过NotⅠ和EcoRⅠ双酶切及DNA测序验证,本研究成功构建p3XFLAG-NGAL真核表达载体,免疫印迹法证实转染了p3XFLAG-NGAL载体的人乳腺癌细胞MCF7高表达FLAG-NGAL融合蛋白,并利用FLAG pull-down技术筛选出人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白,经蛋白质谱测定为角蛋白-1(Keratin 1,KRT1).结论 成功构建p3XFLAG-NGAL真核表达载体,并获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白KRT1,为下一步研究乳腺癌的发生、发展机制提供新的思路和靶点.     

人类8型疱疹病毒K8.1基因原核表达重组质粒的构建

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）K8.1基因原核表达重组质粒,获得HHV-8外壳蛋白重组融合蛋白,为制备检测抗原建立平台。方法：根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物,分别在引物两端添加特异酶切位点,以pGEM-Teasy/K8.1质粒为模板,PCR扩增K8.1基因全长序列,克隆入原核表达载体pET-41a,构建原核表达质粒pET41a-K8.1;转化大肠杆菌DH5α,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性。结果：酶切鉴定表明在约500bp处可见酶切片段,测序结果表明构建的pET41a-K8.1原核表达质粒连接正确,插入的K8.1基因片断为494bp。结论：成功构建了pET41a-K8.1原核表达质粒,为获得重组融合HHV-8外壳蛋白建立了平台。