HCV核心蛋白DNA疫苗诱导的小鼠体液免疫应答

目的：观察丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白ＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体液免疫应答的效力，为研制应用于人类的ＨＣＶ ＤＮＡ疫苗提供实验依据。方法：将全长ＨＣＶ核心蛋白基因插入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１，构建ＨＣＶ核心蛋白重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＨＣＶｃｏｒｅ，肌注ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，以ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清ＨＣＶ抗体。以此重组质粒转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞，以ＨＣＶ抗体阳性小鼠血清为捕获抗     

HCV定量RT—PCR竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５‘ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的Ｅｃｏ ＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶ ＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏＩ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。     

一株庚型肝炎病毒NS3区和NS5区部分基因序列的分析

用ＲＴ－ＰＣＲ的方法从非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病人血清中检测到一株庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）。其中扩增ＮＳ３区基因采用５６例循环周期减温ＰＣＲ方法；扩增ＮＳ５区基因采用３５个循环周期的正常ＰＣＲ方法。并对其ＰＣＲ产物进行了克隆测序。在ＮＳ３区，样品与ＧＢＶ－Ｃ和ＨＧＶ的核苷酸序列同源性分别为８４．２％和８９．９％；而在ＮＳ５区样品与ＨＢＶ－Ｖ和ＨＧＶ的核苷酸同源性分别为９４．９％和９８．     

中国株HGV部分基因的分子克隆与核苷酸序列分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ对广东地区３３例肝炎病人血清进行ＨＧＶＲＮＡ检测，结果２例（６．１％）阳性。对其中１株输血后ＨＧＶ（ＣＨ－３）基因组５＇端非翻译区（５＇ＵＴＲ）进行分子克隆与测序，并分别与Ｌｉｎｎｅｎ等报道的２株ＨＧＶ（ＰＮＦ２１６１，Ｒ１０２９１）和Ｌｅａｒｙ等报道的ＧＢＶ－Ｃ相比较，其核苷酸序列的同源性分别为８９．２％、８８．７％、８７．１％。本研究首次证实我国华南地区存在ＨＧＶ感染。ＨＧＶ高度保守区５＇ＵＴＲ的分子克隆与核苷酸序列的测定对开展ＨＧＶ感染的基因诊断具有重要意义。     

中国人庚型肝炎病毒部分基因的克隆及序列分析

目的：分析中国人血清中庚型肝炎病毒（ＨＧＶ或ＧＢＶ－Ｃ）ＮＳ３区部分基因序列。方法：从个体供血者及肝硬化患者血清中，通过逆转录合成ｃＤＮＡ，设计特异性引物进行多聚酶链式聚合反应，将产物克隆于载体上，采用双脱氧核苷酸链终止法进行双向测序。结果：分离出的５株ＮＧＶ毒株的ＮＳ３区部分核苷酸序列之间同源性从８５％到９８％，与国外已发表的ＨＧＶ序列比较，同源性在７９％～９１％。推测的其编码氨基酸序列，５株之间１００％一致，与国外已报告的ＨＧＶ比较，同源性为９４．９％～１００％。结论：从中国人血清中分离出５株ＨＧＶ序列，其ＮＳ３区部分核苷酸存在着一定的变异性，但其编码的氨基酸非常保守。     

HCV 定量 RT-PCR 竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５’ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的ＥｃｏＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ，反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏⅠ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。应用限制性酶切和ＰＣＲ对这两种重组质粒进行了鉴定，为ＨＣＶ－ＲＮＡ的定量ＰＣＲ提供有用的内参照模板。     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

人肝细胞生长因子在CHO细胞中的表达

以ｐＲＣ／ＣＭＶ作为真核细胞表达性载体，用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＸｂａⅠ将ＨＧＦｃＤＮＡ全序列定向重组到ｐＲＣ／ＣＭＶ的多克隆位点上。筛选得到的重组质粒以磷酸钙ＤＮＡ共沉淀的方法转染ＣＨＯ细胞，经８００ｍｇ／Ｌ的Ｇ４１８筛选，获得阳性细胞克隆。用ＨＣＣ－７９０２细胞及原代培养的成年大鼠肝细胞对转染阳性细胞培养基收集上清进行活性测定。３Ｈ－ＴｄＲ掺入等分析证明，它能有效地抑制体外培养的人肝癌细胞的生长，并可明显刺激鼠肝细胞ＤＮＡ的合成。结果表明，重组人ＨＧＦ基因在ＣＨＯ细胞中成功地获得表达，为基因工程大量制备和纯化ＨＧＦ奠定了基础     

庚型肝炎病毒NS5非结构蛋白在昆虫细胞中的表达

目的;研制特异的抗ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ抗体诊断试剂。方法：ＰＣＲ扩增ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ ＮＳ５基因片段并定向克隆至转座载体ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ,转化ＤＨ１０Ｂａｃ感受态细胞,３７℃振荡培养４ｈ使发生转座,于三抗选择平皿筛选重组ｂａｃｍｉｄ。脂质体介导转染ｓｆ９细胞,将转染上清再次感染ｓｆ细胞,以批量表达ＮＳ５重组蛋白。利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法分析,检测重组蛋白。结果：序     

CR3的Ⅰ结构域的克隆和在CHO细胞中的表达及配体结合特性的研究

研究白细胞整体合素ＣＲ３α亚基的Ⅰ结构域在配体结合中的作用。方法克隆ＣＤ１１ｂ的Ⅰ结构域，用重叠ＰＣＲ的方法将其与信号肽ＤＮＡ连接，克隆到表达载体ＰＥＥ６ＨＣＭＶ．ＧＳ，转化ＣＨＯ－Ｋ１细胞。表达的Ⅰ－结构域经ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ｍｏｎｏ－Ｓ柱纯化后，与Ｃ３ｂｉ进行配体结构实验。结果用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得重组的Ⅰ结构域分子量为２９ＫＤ。重组的Ⅰ结构域可以与Ｃ３ｂｉ结合，Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析     

乙肝核心抗原DNA疫苗的构建及其免疫原性分析

构建ＨＢＶ核心抗原ＤＮＡ疫苗,并探讨基实验动物内的表达及其免疫原性。方法：采用ＰＣＲ法从ＨＢＶ全基因ＤＮＡ中获得核心抗原ＤＮＡ片段,并将其重组到ｐｃＤＮＡ３载体。以此为候选疫苗分别免疫小鼠和树Ｊｕ,并检测其抗ＨＢｃＩｇＧ。结果：构建了乙肝核心抗原候选核酸疫苗ｐｃＤＮＡ３－ＨＢｃ。免疫接种该疫苗后第２周抗ＨＢｃＩｇＧ水平开始升高,小鼠至第９周,树Ｊｕ至第７周升至峰值。结论：构建ｐｃＤＮＡ３－ＨＢＣｄ     

广东地区GBV-C/HGV5'NCR区序列变异的研究

目的 了解广东地区ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ５＇ＮＣＲ区的序列变异情况。方法 以ＧＢＶ－Ｃ和ＨＧＶ的５＇ＮＣＲ区安全同源的序列设计合成引物用于套式ＲＴ－ＰＣＲ。从广东地区的１０例ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ感染者血中扩增了１０个充列,分别克隆对ｐＵＣ１９、ｐＴ－Ａｄｖ载体。以３５Ｓ标记的双脱氧链末端终止法对这１０个序列分别进行正反两个方向的序列测定。结果 １０株充列相互间同源性最大为１００％,最小为８４．４％。与Ｇ     

小鼠造血干细胞因子基因克隆及在CHO细胞中的表达

克隆造血干细胞因子并在ＣＨＯ细胞中表达。方法：采用ＰＣＲ方法从ｐＲＣ／ＣＭＶ（含ＳＣＦｃＤＮＡ）中钓取ＳＣＦｃＤＮＡ膜外段活性区，克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，转染入ＣＨＯ细胞；用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ｍＲＮＡ水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。     

人肝癌组织中黄曲霉毒素和肝炎病毒基因检测分析

以肝细胞场（ＨＣＣ）患者手术切除标本为研究材料，采用高效液相色谱荧光法检测组织中的黄曲霉毒素Ｂ１（ＡＦＢ１），嵌套式多聚酶链反应技术检测组织中的ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ。在６９．２％（１８／２６例）的ＨＣＣ患者中检出了３．６５－８９．０６ｎｇ不等的ＡＦＢ１／ｇ肝组织；ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ检出率分别为９０．５％（５７／６３例）和１２．７％（８／６３例）。其中，ＡＦＢ１和ＨＢＶＤＮＡ重叠检出率为６１．５％（１６／２６例），ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ重叠检出率为７．９％（５／６３例），４例ＨＣＣ患者重叠检出了ＡＦＢ１、ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ；同步检测对照组５例，无１例出现这种情况。结果表明，上述３种因素均与人类肝癌密切相关，并且可能存在协同致癌效应。     

人Vigilin基因5＇端EcoRI片段的克隆及限制性酶切图谱分析

为了解人基因组Ｖｉｇｉｌｉｎ基因结构和探讨Ｖｉｇｉｌｉｎ蛋白的功能，在人基因组Ｖｉｇｉｌｉｎ基因全长克隆的基础上，在５＇端ＥｃｏＲＩ片段亚克隆（Ｖｉｇ－ＣＧ５－７Ｅ），并从１３个限制性核酸内切酶中选出６种对亚克隆ＤＮＡ进行部分酶切和分子杂交，组建了克隆Ｖｉｇ－ＣＧ５－７ＥＤＮＡ的详细限制性酶切图谱，从而为克隆Ｖｉｇｉｌｉｎ基因的转录调控序列提供合适的酶切位点。     

PCR法区别HBV RC—和CCC—DNA

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）和基因组为一松驰环状、部分双链ＤＮＡ（ＲＣ－ＤＮＡ）。在其负链的５与３端之间存在一缺口。当ＨＢＶ进入宿主细胞后，基因组转变为共价闭合环状ＤＮＡ（ＣＣＣ－ＤＮＡ）。我们根据ＨＢＶ－ＲＣ－和ＣＣＣ－ＤＮＡ的结构特点，设计了ＰＣＲ区别ＲＣ－和ＣＣＣ－ＤＮＡ。实验表明，该方法可有效地区别两种形式的ＨＢＶＤＮＡ》     

庚型病毒性肝炎最近研究进展

庚型病毒性肝炎最近研究进展广西医科大学第一附院吴继周１９９５年美国科学家Ｋｉｍ等首先克隆出了ＨＧＶ的ｃＤＮＡ，并于同年的第三届国际病毒性肝炎会议上宣布了他们的发现。Ｓｉ－ｍｏｎ等也先后克隆出两种与ＨＧＶ序列相似的黄病毒ＧＢＶ－Ａ和ＧＢＶ－Ｂ核苷酸序列...     

阳离子脂质体介导血管内皮生长因子的基因表达

以ＲＴ－ＰＣＲ自人胎肝中克隆和筛选血管内皮生长因子全长ｃＤＮＡ，测序鉴定正确后，插入真核表达载体ｐＡｄＣＭＶｌｉｎｋ１中的ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎＩ位点。用ｌｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮＥ体外介导转染ＣＨＯ细胞，收集转染后２４ｈ至第５ｄ的培养上清，用ＲＴ－ＰＣＲ检测转染细胞中外源ＶＥＧＦ１６５基因的转当，Ｍｉｌｅｓ试验检测细胞培养上清中ＶＥＧＦ的生物活性。     

乙型和丙型肝炎重叠感染患者组织免疫组织化学双标记研究

探讨丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒重叠感染患者肝组织中 复制状况和相互关系。方法采用免疫组织化学双标记技术，以抗－ＨＣＶ ＮＳ３，抗－ＨＣＶＮＳ５单克隆抗体和抗－ＨＢｓ，抗－ＨＢｃ多克隆抗体，检测２５例尸检肝组织中ＨＣＶＡｇ和ＨＢＶＡｇ的分布和表达。