竞争性RT-PCR法定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因的表达

目的 :建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,以研究GPI PLD与白血病等疾病的关系。方法 :首先用PCR定点诱变法构建GPI PLD的竞争性cDNA模板 ,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区 ,但在长度上要比靶cDNA少 2 0个碱基。把该竞争性cD NA模板在体外转录出的竞争性RNA作为RT PCR的内标准 ,与白血病细胞株K5 6 2细胞的总RNA在同一体系内进行逆转录和PCR扩增 ,二者的PCR产物因长度不同可经电泳区分开 ,然后对电泳图像进行光密度扫描 ,根据已知的竞争性RNA模板的量计算出GPI PLDmRNA的量 ,从而得到GPI PLD基因的绝对表达量。结果 :构建和制备了长度为 198bp的GPI PLD竞争性RNA模板 ,该模板与靶模板呈明显的竞争性RT PCR反应 ;测得K5 6 2细胞GPI PLD基因的表达水平为每纳克 (44 0± 2 0 )拷贝。结论 :成功地建立了一种定量检测GPI PLD基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,该方法具有灵敏、准确等优点。     

竞争PCR用于乙肝病毒DNA定量检测初探

目的　评估竞争PCR这种检测方法的临床有效性。方法　用竞争PCR和荧光定量PCR两种方法对同一组患者血清HBVDNA进行了定量检测。竞争PCR是通过聚合酶链反应过程中竞争子和目的乙肝病毒DNA竞争同一反应管内的同一引物 ,通过凝胶成像比较目的乙肝病毒DNA和已知量竞争子的亮度 ,推测出目的DNA的含量。再将其结果与荧光定量PCR的结果相比较。结果　竞争PCR与荧光定量PCR检测的结果一致。结论　运用竞争PCR的方法对乙肝病毒DNA进行定量检测结果精确、成本较低 ,简便快速、易于操作 ,可推广使用。     

应用竞争聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的探讨竞争聚合酶链反应(C-PCR)在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义。方法根据中国人群最常见的HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物,并制备内对照DNA,将适量的内对照DNA加入到常规HBV DNA PCR检测反应体系中,使其与HBV靶序列共扩增。结果在20μl C-PCR反应体系中,加入约100～500拷贝内对照DNA能够有效的获得共扩增信号;在120个临床血清标本的C-PCR扩增中识别出5个不能有效扩增的标本。结论C-PCR能够有效地指示临床标本HBV DNA体外扩增的假阴性。     

冬虫夏草中虫草素相关基因的克隆及生物信息学分析

目的：虫草素是冬虫夏草和蛹虫草的有效成份之一,根据野生型虫草菌的虫草素相关基因片段,利用PCR技术在冬虫夏草中扩增获取相似基因片段。方法：根据已公开专利报道的野生型虫草菌的虫草素相关基因片段,设计引物在冬虫夏草DNA中PCR扩增目的序列,测序并用生物信息学分析相关片段。结果：在冬虫夏草的DNA中利用PCR扩增到一条613 bp虫草素相关基因片段,与NCBI基因数据库比对显示,与蛹虫草的中ATCC34164序列相似性达到96%。利用ORF Finder共查询到6个ORF片段,其中最大的为294 bp;利用ProtScale分析最大ORF序列翻译成的蛋白质,发现该翻译蛋白质为亲水性蛋白;利用TMpred预测到该翻译蛋白质存在2种跨膜模型,推荐相对膜的取向由内到外,N端处在膜外。结论：本研究为冬虫夏草中虫草素相关基因功能的后续研究提供了可靠基础数据。     

日本血吸虫14-3-3蛋白epsilon亚型基因扩增及表达载体的构建

目的　扩增日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建其表达载体 ,以研究其在血吸虫信号转导以及免疫预防和诊断方面的作用。方法　以日本血吸虫成虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链 ,设计合成引物 ,用PCR法扩增 1 4 3 3蛋白epsilon亚型基因编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体 ,双酶切和以质粒为模板的PCR鉴定后 ,将基因片段亚克隆入表达载体pBK CMV ,转染大肠杆菌BL2 1 ,经双酶切后鉴定。结果　RT PCR扩增出一条约 753bp的特异性条带 ,TA克隆重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT PCR扩增出大小相同条带 ,pBK Sj1 4 3 3表达载体经双酶切后也同样获得了一条约 753bp的特异性条带。 结论　在体外成功的扩增了日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建了 pBK Sj1 4 3 3表达载体 ,为进一步的免疫预防和免疫诊断研究提供了条件。     

限制性显示-聚合酶链反应扩增苏云金杆菌基因片段的克隆与分析

目的运用限制性显示-PCR技术(RD-PCR)扩增苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)基因片段,并进行克隆、测序分析。方法设计特异性引物扩增长片段Bt基因,对扩增产物进行RD-PCR扩增,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定。提取阳性克隆质粒进行测序分析。结果运用RD-PCR技术,将长片断的基因(2 000-3 000 bp)分为多个短的片段,片段长度较为均一(200~600 bp)。测序结果表明,所扩增的片段均属于特异扩增的Bt基因。结论运用RD-PCR技术可以将长片段基因进行片段化,使其适用于基因芯片的探针。     

限制性显示-聚合酶链反应扩增苏云金杆菌基因片段的克隆与分析

目的 运用限制性显示-PCR技术(RD-PCR)扩增苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)基因片段，并进行克隆、测序分析。方法 设计特异性引物扩增长片段Bt基因，对扩增产物进行RD-PCR扩增，扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定。提取阳性克隆质粒进行测序分析。结果 运用RD-PCR技术，将长片断的基因(2000—3000bp)分为多个短的片段，片段长度较为均一(200～600bp)。测序结果表明，所扩增的片段均属于特异扩增的Bt基因。结论 运用RD-PCR技术可以将长片段基因进行片段化，使其适用于基因芯片的探针。     

间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段，分析其分子特征，评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物，采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段，与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定分析其序列特征；以SSUrDNA为靶基因，建立间日疟PCR诊断方法，并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。蛄果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段，含有267个核苷酸，与间日疟原虫Sall株孢子期SSUrRNA基因序列比较，同源性为99．3％，其中第220住为插入了1个碱基“T”，243住碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板，PER扩增结果显示检测灵敏度至少迭102copy／μl；特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段，而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准，PCR敏感性为100％（102／102），特异性为100％（76／76）。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定，不同地理株间存在单核苷酸多态性，以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异，具有良好的推广使用价值。     

T-载体在聚合酶链反应扩增产物克隆中的应用

目的　探讨克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增产物的简便方法。方法　用PCR方法分别特异性扩增Wilms瘤基因wt1和尿激酶受体 (UPAR)基因 ,并利用Taq聚合酶具有的延伸酶活性将扩增产物直接克隆入T -载体 ,EcoRⅠ酶切鉴定阳性重组子。结果　设计的引物可分别扩增wt1基因锌指区 (34 3bp)和UPAR基因编码区全长 (10 83bp) ;未经修饰的常规PCR和高保真PCR扩增产物可被直接克隆入pGEM -TEasy载体 ,其中正确重组率为 6 2 .5 %～ 87.5 % ;克隆的wt1基因和UPAR基因已被成功用于竞争性PCR或表达。结论　T -载体法是克隆PCR产物通用而有效的方法。     

竞争性定量RT-PCR检测妊高征患者血清对脐静脉内皮细胞TR基因表达的影响

目的 建立一种能有效检测培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中硫氧还蛋白还原酶(TR)基因表达的方法。探讨硫氧还系统与妊高征(PIH)发病之间的关系。方法 以RT-PCR方法克隆TR基因。用内部缺失法构建其竞争模板，将竞争模板加入目的基因的逆转录扩增体系中，根据标准曲线得出模板中目的基因的含量。用该方法分别检测22例PIH患者及15名正常孕妇血清对体外培养的HUVEC中TR基因表达水平的影响。结果 建立了竞争性定量逆转录．聚合酶链反应(cQRT-PCR)半定量分析TR基因表达水平的方法；用该方法测得PIH患者及正常孕妇血清均能使HUVEC中TR基因表达显著上调。且两者上调幅度无明显差异。结论 PIH患者内在TR基因调节缺陷是导致患者体内抗氧化能力不足的主要因素，与血清中病理性细胞因子改变无明显关系。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3．0,并转入DH5ct宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增方法对重组质粒进行鉴定。结果重组质粒PCDNA—MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120bp大小相同的片段。结论成功构建弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA—MIC3．     

改良的降落PCR扩增中国地鼠目的基因

目的优化PCR程序，尝试用降落PCR扩增中国地鼠目的基因。方法设计了4对引物，用普通PCR和改良的降落PCR扩增中国地鼠COX1、COX2、NADH5、NADH6部分基因。结果普通PCR只有1对引物扩增出特异性条带，而降落PCR4对引物都扩增出特异性条带，并与中国地鼠目的基因大小一致。结论降落PCR省略了常规PCR中摸索最适退火温度的过程，对中国地鼠一些Tm值相近的基因可以使用降落PCR温度程序扩增，是一种行之有效的PCR方法。     

9种柴胡属植物的核糖体ITS序列及其在药材鉴定中的应用

目的 研究9种柴胡属药用植物rDNA ITS序列的差异和规律,寻找可准确鉴定柴胡类药材的分子性状。方法 PCR扩增ITS序列,测序,DNAssist version 2．2软件进行序列比对,并计算同源性。结果 柴胡属植物ITS序列与外类群ITS序列比对同源性均小于75％,序列间两两比对同源性均大于88％,同种植物则大于99％。结论 ITS序列作为柴胡类药材鉴定依据具有一定实用性和可靠性。     

PCR技术快速检测结核性脑膜炎患者脑脊液中结核分枝杆菌的研究

采用 PCR 技术体外 DNA 扩增,检测结核分枝杆菌,扩增片断为165 bp,非肺结核分枝杆菌及其它细菌结果阴性,证实其具有较高的特异性。通过与常规 DNA 制备方法的比较,证明对脑脊液标本煮沸后进行直接圹增,方便、快捷,节省费用,不影响实验结果,值得推广。通过对33例结核性脑膜炎(结脑)及26例非结脑患者脑脊液进行结核分枝杆菌 DNA 检测,并与其它诊断方法进行比较,结果显示 PCR 的阳性率为84.8%(28/33),染色镜检3%(1/33),抗原检测60.6%(20/33),抗体检测54.5%(18/33),对照组无一例扩增阳性,表明 PCR 技术在特异性和敏感性方面均优于其它方法(P<0.01),可望成为结脑可靠的诊断手段。     

应用聚合酶链反应扩增HIV—1gag基因序列

作者设计了一对DNA引物,用于扩增1型人免疫缺陷病毒(HIV—1)gag基因的一段保守序列。应用聚合酶链反应(PCR)技术,采用含有ARV-2gag基因的亚克隆质粒pAG423作模板,可以使靶基因片段数目增加1×10~7倍以上,经电泳染色后,扩增产物清晰可辨。实验结果表明,这种方法的敏感性极高,足以检测到6.5个拷贝的HIV-1基因。用特异性DNA探针打点杂交证实扩增产物为特异性gag基因片段。实验还表明,经过30～35次PCR循环可以得到最佳扩增效果,而且应用PCR和打点杂交方法还可以对HIV-1基因进行定量分析。因而PCR是一种可以取代病毒分离的常规测定HIV-1感染的简便方法。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

人胎盘基因表达谱芯片的初步研究

目的：制备人胎盘基因表达谱芯片，并用于基因差异表达分析。方法：用基因芯片点样仪将胎盘基因文库探讨打印在氨基包被的玻片上制备表达谱芯片。分别提取对照组与三氧化二砷处理的K562细胞总RNA，纯化mRNA后反转录成cDNA，再以限制性显示技术进行荧光标记，将两组荧光标记的样品混合后与芯片进行杂交，杂交后清洗芯片，干燥后对芯片进行扫描，分析杂交结果。结果：建立了较可靠的制备与检测基因表达谱芯片的方法，并筛选出45个差异表达基因片段，结论：制备的人胎盘基因表达谱芯片可有效地应用于基因的差异表达分析。     

人幽门螺杆菌UreB与Omp11双价疫苗载体的构建与鉴定

目的:构建含人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)郑州分离株MEL HP27 ureB-omp11融合基因的重组表达载体.方法:利用分子克隆技术,扩增Hp UreB、Omp11编码基因及融合基因ureB-omp11,将融合基因ureB-omp11与载体pET30a( )进行酶切、连接,然后转化并筛选含有目的基因的重组载体.结果:酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp ureB-omp11融合基因,由2 280 bp组成.与GenBank报道的相比,核苷酸序列同源性为99.39%,氨基酸序列同源性为99.47%.结论:成功构建了MEL Hp27融合蛋白UreB-Omp11的双价疫苗重组载体,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础.     

天麻ITS序列的聚合酶链反应扩增

目的:为天麻核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer ,ITS)序列分析提供可靠、特异的聚合酶链反应(PCR)条件.方法:选择ITS序列通用引物对天麻ITS序列进行PCR扩增,对一系列PCR条件参数进行摸索,同时对PCR产物进行纯化后直接测序.结果:天麻ITS序列PCR扩增产物约为750 bp,不同来源样本存在有一定的差异.经测序后与Genebank中相关序列比对,天麻ITS序列总长度为598 bp,其中ITS1为235 bp,ITS2为209 bp,5.8S为154 bp,G C(%)为52%.结论:扩增天麻ITS序列的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果.