抗土拨鼠肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的制备、性质鉴定及初步应用

目的研制出能特异与土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（WHc）结合的单克隆抗体,使之能特异性地对土拨鼠肝炎病毒（WHV）进行检测,并可能应用于相关肝炎病毒的筛查。方法以原核表达的土拨鼠肝炎病毒重组核心蛋白（WHc 1～149氨基酸）免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术进行细胞融合,有限稀释法克隆化,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫组织化学（IHC）筛选、鉴定。结果筛选出5株（4B1E、6C5D、6C5C、6D1D、6D1G）能稳定分泌抗土拨鼠肝炎病毒核心蛋白抗体的杂交瘤细胞株。此5株单抗适用于ELISA、IHC、Western blot等方面的研究,与HBcAg有交叉反应,并且在部分中国旱獭的肝脏组织进行IHC检测呈现阳性反应。结论制备的5株单抗可用于土拨鼠肝炎病毒等嗜肝脱氧核糖核酸病毒的研究,可能在寻找新的相关肝炎病毒中起重要作用。     

截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建截短型鸭乙型肝炎病毒(DHBV)核心蛋白的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体.方法:应用基因工程技术将编码截短型DHBV核心蛋白(DH-BeAg 1～214 aa)的基因片段装入原核表达载体pRSET-B内,在宿主菌Rosetm(DE3)pLacI内进行诱导表达,运用Ni-NTA方法纯化目的蛋白.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验(ELISA),Westemblot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性.结果:成功地构建了含截短型DHBV核心区基因的质粒,并纯化得到了相对分子质量(Mr)约为28 000的目的蛋白,用之免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体.结论:获得的重组截短型DHBV核心抗原纯度高,免疫反应性强;获得的多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性,为DHBV的检测和研究奠定了实验基础.     

小鼠肝炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]制备并鉴定小鼠肝炎病毒(MHV)N蛋白的单克隆抗体(mAb).[方法]以Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的重组N蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术将免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤进行融合,用间接ELISA方法筛选分泌N蛋白mAb的杂交瘤细胞系.并用Western blot和IFA方法对所获得的mAb进行鉴定.[结果]共获得4株稳定分泌抗N蛋白mAb的杂交瘤细胞系,其亚类鉴定2株为IgG2a,1株为IgG2b,1株为IgG1,轻链均为k型.经鉴定4株mAb均能与重组N蛋白发生特异性反应.[结论]成功获得了特异性抗MHV N蛋白的mAb,为进一步研究N蛋白的结构功能及建立诊断学方法奠定了基础.     

乙型肝炎病毒核心蛋白作为免疫载体的结构与功能基础

ＨＢＶ核壳是由２４０个核心蛋白（ＨＢｃ）单体组成，而且，ＨＢｃ有很强的适应性，对外源蛋白的插入不十分敏感，仍能形成对称性颗粒。如果在其暴露部位插入外源性抗原，可形成由２４０个单体规则排列的聚合体，它不仅能显著增强刺激免疫反应的能力，而且用于免疫检测也可有放大作用。本文就ＨＢｃ作为免疫载体的结构与功能基础作一综述。     

乙型肝炎病毒核心蛋白小干扰RNA载体的构建与验证

目的 构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,并验证其干扰效果.方法 设计针对HBV基因组（ayw亚型）HBc基因的小干扰RNA序列（位于2147 bp ～2165 bp序列）,目的片段与载体成功连接后转入大肠埃希菌DH5α,酶切及测序验证其正确性.最后以脂质体转入HepG2.2.15细胞中,检测其干扰效果.结果 成功构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,并命名为pshRNA-HBc..酶切及测序验证正确,pshRNA-HBc对HepG2.2.15细胞中HBc表达具有特异性干扰效果.结论 构建针对乙型肝炎病毒核心蛋白的小干扰RNA真核表达载体,为后续研究HBc的生物学功能奠定良好基础.     

乙型肝炎病毒核心基因变异的研究

用聚合酶键反应（ＰＣＲ）对３份肝癌组织及１份乙型肝炎表面抗原阳性但核心抗体（抗－ＨＢｃ）为阴性的无症状携带者血清，扩增及克隆了核心（Ｃ）基因。经核苷酸序列分析，与我国ＨＢＶ克隆株ＰＡＤＲ－１比较，发现无症状携带者的Ｃ基因与ＰＡＤＲ－１的基因差别不大；但自肝癌组织克隆的Ｃ基因平均每例有１５．６个核苷酸变异。结果提示，ＨＢＶ核心基因的变异与疾病的严重程度可能有关。     

丙型肝炎病毒核心蛋白DNA免疫初步研究

目的　观察HCV核心蛋白基因的DNA免疫效果。方法　将HCV核心蛋白基因插入真核表达载体pcDNA3.1( ) ,构建重组质粒pcDNA3.1 c。在证明该重组质粒可在哺乳动物COS7细胞中表达的基础上 ,用重组质粒 10 0 μg免疫小鼠 ,同时设立空白质粒组和PBS组两组对照 ,初次免疫后 4周、8周各进行一次加强免疫。小鼠体液免疫反应和T淋巴细胞增殖检测分别采用间接免疫荧光法和MTT法。结果　pcDNA3.1 c可在COS7细胞内表达HCV核心抗原 ,接种于Balb c小鼠能有效诱导体液和细胞免疫应答。结论　重组质粒pcDNA3.1 c对于丙型肝炎防治具有潜在价值     

土拨鼠肝炎病毒核心蛋白的高效表达和B细胞表位鉴定

目的 建立高效表达土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（WHcAg）的方法并对其B细胞表位进行鉴定。方法分别构建不同截短型WHcAg的质粒以了解能大量表达并形成WHV核心颗粒的区段，利用变性WHcAg制备单克隆抗体以寻找能与WHcAg线性B细胞表位结合的单克隆抗体。结果 WHcAg前144或149氨基酸残基能够大量表达并能形成颗粒样结构。这2种截短型WHcAg能够在大肠杆菌中表达并组装成直径为34肿的核心颗粒，最终纯化获得毫克级的核心蛋白。截短型WHcAg保留了全长WHcAg的抗原性，而且变性WHcAg存在另外的B细胞线性表位，利用变性WHcAg进行免疫制备单克隆抗体获得的5株抗体均针对WHcAg的N末端表位，该表位在WHcAg和HBcAg高度保守。结论 建立了高效表达WHcAg的方法，制备了针对WncAg单克隆抗体。并对WHcAg的线性B细胞表位进行了鉴定，发现WHcAg和HBcAg的N末端存在共同的线性B细胞表位。     

剪接导致截短的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白可诱导肝细胞空泡化

目的　研究 4 5 8～ 130 8nt乙型肝炎病毒 (HBV)基因组剪接变异体截短的表面抗原大蛋白 (largesurfaceantigen ,LS)的肝细胞致病性。方法　将 4 5 8～ 130 8nt剪接变异体HBVDNA(基因号为AY2 38972 ,长度为 2 36 6bp)及全长HBVDNA(基因号AY2 0 6 390 ,长度 32 15bp)中PreS2及S起始密码由ATG定点突变为ACG。以突变后的剪接变异体DNA为模板 ,PCR扩增剪接产生的截短LS编码基因(LS splice)及LS氨基端 2 76个氨基酸的编码基因 (LS2 76) ;以突变后的全长HBVDNA为模板 ,PCR扩增全长LS编码基因。将上述DNA片段克隆至pCDNA3.1/Hyg( )真核表达载体。重组载体以脂质体转染HepG2及Chang肝细胞 ,以HE染色观察细胞的空泡病变 ,并以流式细胞仪检测转染细胞的凋亡率。结果　表达LS、LS splice、LS2 76的重组载体转染后均可引起HepG2及Chang肝细胞发生空泡样病变。此外 ,LS可引起HepG2及Chang肝细胞凋亡 ,而LS2 76、LS splice致肝细胞凋亡作用消失。结论　 4 5 8～130 8ntHBV基因组剪接变异体产生的截短LS可致肝细胞病变 ,其作用与其氨基端 2 76个氨基酸有关。该类型HBV基因组剪接变异体在乙型肝炎发生发展中可能具有一定作用     

乙型肝炎病毒核心基因的酶切图谱及核苷酸序列分析

对慢性乙型肝炎患者的２２份肝穿刺活检组织及其中配对的６份血清用ＰＣＲ扩增出乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的ＰｒｅＣ／Ｃ基因，选用ＡｖａⅡ、Ｓａｕ３ＡⅠ、ＸｍｎＩ，ＢｓｔＮＩ及ＴａｑＩ５种限制性内切酶消化后，对Ｃ基因进行酶谱分析。发现有６份肝组织及１份血清出现异常酶谱。对Ｓａｕ３ＡⅠ酶解异常标本进行分子克隆及核苷酸序列分析，发现２例患者因２１３７位核苷酸点突变出现了Ｓａｕ３ＡⅠ的新酶切点。类似变化在肝癌组织的ＨＢＶＣ基因中也曾发现，其意义待进一步研究。     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白的研究进展

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）是一种单股正链ＲＮＡ病毒。ＨＣＶ的基因组编码的核心蛋白自身或者与细胞的蛋白结合形成不同的复合物形式，对于ＨＣＶ感染的致病机制、ＨＣＶ感染的慢性化、以及感染的宿主细胞的信号转导、生长特点和细胞的恶性转化过程密切相关。     

鼠抗丙型肝炎病毒NS3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

鼠抗丙型肝炎病毒ＮＳ３蛋白单克隆抗体的制备及鉴定潘秀珍唐家琪李越希李先富（南京军区军事医学研究所，南京２１０００２）丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）是严重危害人民身体健康的病原。感染ＨＣＶ的病人血液中，很难直接检测到病毒抗原，只能通过检测病人血液中特异性抗体来...     

检测乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的临床意义

目的检测乙肝患者血清中乙肝两对半（HBVM）、乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白（HBV—LP）以及HBVDNA，比较在不同乙肝两对半模式的患者中HBV．LP与HBVDNA的检出率，探讨乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白（HBV—LP）用于乙肝患者临床诊断的意义。方法采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测HBV．LP和乙肝两对半，采用荧光定量PCR方法对患者HBVDNA进行检测。结果（1）相同乙肝模式患者血清中HBV．LP与HBVDNA检出率差异无统计学意义；（2）143例小三阳乙肝患者血清中HBV．LP与HBVDNA阳性率差异无统计学意义，二者的检出一致率为82．52％[（65＋53）／143]；（3）HBV—LP吸光度（A值）与HBVDNA呈正相关关系（r=0．983）。结论乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白与HBVDNA有良好的正相关关系，在HBeAg阴性的乙肝患者中乙肝病毒表面抗原大蛋白（HBV—LP）与HBVDNA有较高检出一致率，HBV—LP用于临床反映乙肝病毒复制水平，特别是HBeAg阴性乙肝患者体内病毒复制情况有重要的意义。     

环孢素A促进HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒核心蛋白入核的研究

目的观察磷酸脂酶抑制剂环孢素A（CSA）对HBcAg表达和定位的影响，了解HBV生活的周期。方法以30μg/ml的CSA处理HepG2．2．15细胞2d或4d；共聚集显微镜观察细胞内HBcAg和HBsAg亚细胞定位；TUNEL方法检测细胞凋亡。结果对照组HepG2．2．15细胞中HBcAg主要定位于胞质。CSA处理2d后可使胞质中HBcAg和HBsAg水平下降，细胞核内HBcAg水平升高，可见约5％细胞发生凋亡。CSA处理4d后细胞核内HBcAg水平进一步提高，约25％细胞核内表达强度明显高于胞质，并约有30％细胞发生凋亡。结论CSA可促使HepG2．2．15细胞内HBcAg进入细胞核。HBcAg的核内表达定位增强可能与蛋白磷酸化水平增高，及细胞衰老或者凋亡有关。     

抗乙型流感病毒单克隆抗体的制备和分析

抗乙型流感病毒单克隆抗体的制备和分析韩洪彦张容惠张励力（解放军第２６２医院临床实验科，北京１０００８８）流感是人类还不能控制的世界性传染病。我国被认为是流感病毒流行和变异的发源地之一［１］，对人类危害较大的是甲型和乙型流感病毒。以往认为乙型流感病毒设...     

乙型肝炎病毒前S蛋白检测及其与病毒复制标志的关系

采用LAB-ELISA对80份肝病患者血清前S_1及前S_2蛋白进行了检测,并与多种病毒复制标志进行比较。这些标本中,HBsAg的阳性率为61.3％.前S_1及前S_2的阳性率分别为53.8％及47.5％,且仅见于HBsAg阳性者。与血清HBV-DNA、PHSAR、HBcAg、HBeAg及抗-HBc/IgM等乙肝病毒复制标志之间有较好的平行关系。     

乙型流感病毒单克隆抗体的制备与评价

目的制备抗乙型流感单克隆抗体,为建立特异、灵敏、简便的乙型流感病毒快速检测方法奠定基础。方法应用鸡胚接种法、ELISA方法、免疫扩散法、血凝抑制法筛选能稳定分泌抗乙型流感病毒单抗的杂交瘤细胞,并对分泌的单抗的安全性,有效性、抗体亚型,特异性及灵敏性进行了全面评价。结果获得了3株能稳定分泌抗乙型流感病毒单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3G11、4F9、8G6;制备的抗乙型流感病毒单克隆抗体无鼠源病毒污染;抗体亚型为IgG2a亚型,轻链均为κ链;对乙型流感病毒具有高度特异性,而与甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、呼吸道腺病毒等无交叉反应。结论制备的乙型流感病毒单克隆抗体具有特异性强、灵敏性高,为临床乙型流感的早期快速诊断及流行病调查奠定了实验基础。