人釉成熟蛋白Amelotin基因的启动子活性区域分析

目的构建人牙釉质蛋白（Amelotin,AMTN）基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,比较不同的启动子片段在成釉细胞及Hela细胞中的活性,为进一步判定上游启动子的转录调控区奠定基础。方法以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3．Basic中,瞬时转染成釉细胞及Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果成功地获得了不同长度的Amelo—tin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在不同的细胞中活性不同,-190～-358与-35～-93区域为特异的转录调控作用区。结论成功构建了不同长度的Ame｜otin基因启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,初步确定Amelotin基因启动子的转录活性区,为进一步研究Amelotin基因转录调控特点奠定基础。     

人釉蛋白基因启动子在成釉细胞中的转录活性研究

目的构建人釉蛋白（Enamelin,ENAM）基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,通过分析不同的启动子片段的活性,确定启动子的功能区域,为进一步研究Enamelin基因的转录调控机制奠定基础。方法以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成釉细胞及Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果成功地获得了不同长度的Ehamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在成釉细胞中活性不同,-1216～-554与-312～-133区域为特异的转录调控作用区。结论成功构建了不同长度的Enamelin基因启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,初步确定Enamelin基因启动子的转录活性区,为进一步研究Enamelin基因转录调控特点奠定基础。     

大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)基因启动子区,并构建其萤火虫荧光素酶报告基因载体。方法:在对大鼠GLUT3基因5′侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从大鼠基因组中扩增出GLUT3基因5′侧翼区-1037～155bp段长为1 292bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1),再用定向克隆的方法将这一启动子区片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic)中,构建出包含大鼠GLUT3基因启动子区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-GLUT3),电泳与测序鉴定,最后再将pGL 3-GLUT3与内参pRL-TK用脂质体转染的方法瞬时共转染PC12和原代培养的神经元中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL 3-GLUT3的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL3-basic与内参pRL-TK。结果:构建出荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。与转染空质粒pGL3-basic组相比,原代神经细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性升高(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008),在PC12细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性也升高(2.797 7±0.512 0 vs 1.179 8±0.312 5,P=0.010)。结论:成功克隆GLUT3基因启动子区,并构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并且在PC12和原代培养的神经元中pGL 3-GLUT3可以表现出启动子活性。这为后续大鼠GLUT3基因转录调控研究提供研究素材。     

人Sox2对CD133基因启动子的调控研究

目的构建人Sox2基因的真核表达载体并研究其对CD133基因启动子的调控。方法采用PCR方法,从人乳腺癌细胞MCF-7的cDNA中扩增出Sox2基因全长,将其定向克隆至真核表达载体pcDNA3.0中,构建重组质粒pcDNA-Sox2,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序正确后,分别将空载pcDNA3.0与重组质粒pcDNA-Sox2转染人神经胶质瘤U251细胞系,通过RT-PCR和Western blot方法,验证Sox2 mRNA和蛋白的表达。同样采用PCR方法,以人全基因组DNA为模板扩增CD133基因的启动子P1-3片段,并将此片段克隆到PGL3-basic荧光素酶报告基因质粒中,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序正确后,将空载PGL3-bas-ic与PGL3-CD133-p1-3转染人神经胶质瘤U251细胞系,用双荧光素酶检测方法分析Sox2对CD133基因转录水平上的调控。结果扩增出954bp的Sox2基因,并检测到重组质粒Sox2 mRNA和蛋白的表达。扩增出2440bp的CD133-p1-3启动子片段,且Sox2可上调CD133基因启动子的表达。结论成功构建了人Sox2基因真核表达载体,以及CD133启动子荧光素酶报告质粒,并检测到Sox2与CD133之间存在一定的调控关系,为进一步研究人Sox2对CD133的作用奠定了基础。     

人SMYD3基因启动子荧光素酶报告载体的构建与分析

目的:克隆5′长度不同的SMYD3基因启动子序列并进行活性鉴定。方法:采用PCR方法克隆出SMYD3基因转录起始位点上游不同长度的基因片段,构建T载体并利用酶切与测序进行鉴定;将该基因亚克隆至pGL3-Basic荧光报告基因载体上;瞬时转染Hep3B细胞后用双荧光报告检测系统检测不同片段的荧光活性。结果:T载体酶切与测序结果正确,成功构建了pGL3-Basic+370～1400bp荧光报告载体并利用双荧光素酶报告基因检测系统分析了重组质粒的荧光活性。结论:pGL3-Basic+370～1400bp重组质粒转染组与阳性对照组相比并未表现出显著的荧光活性,本研究认为SMYD3基因的启动子核心区域位于-1334bp的上游。     

含人P21启动子双荧光素酶基因载体的构建

目的构建带有EGFP标记含人P21启动子的双荧光素酶报告基因载体。方法从人血白细胞DNA中克隆P21启动子,用于控制firefly荧光素酶的表达;renilla荧光素酶基因和EGFP基因用IRES连接,在CMV启动子控制下表达;上述元件和基因克隆至载体pLL3.7中,应用酶切和测序的方法进行鉴定正确后转染至293FT细胞观察EGFP表达。结果经酶切、测序证实成功构建了带有EGFP标记的含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体,并成功表达EGFP。结论含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体成功构建,为下一步的药物筛选打下基础。     

人源DNMT1基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其活性检测

目的:利用PCR扩增人源DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体并对其活性进行检测。方法:运用PCR技术以人非小细胞肺癌细胞A549基因组DNA为模版扩增出目的片段,将PCR产物用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上,然后进行转化、菌落PCR及测序验证等。将构建成功的pGL3-proDNMT1-luc重组质粒和内参质粒pRL-CMV-luc共转入H1299细胞中检测DNMT1启动子活性。结果:成功扩增出长度为1634 bp的目的片段,并成功构建出DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体,启动子具有活性。结论:DNMT1启动子的成功克隆为进一步研究其分子调控机制和生物学意义奠定了基础。     

Hes1基因启动子的克隆及活性研究

目的:获取人Hes1基因的启动子并对其进行活性分析。方法:以人Hela细胞基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增Hes1基因5’侧翼序列,将扩增的片段与pMD18-T载体连接,然后利用双酶切进行鉴定,并送测序;将测序正确的启动子插入pGL3-Basic,双酶切并测序鉴定。将测序正确的重组DNA质粒瞬时转染宫颈癌细胞,运用双荧光素酶报告基因检测系统检测其启动子的活性。结果:PCR扩增到的人Hes1基因启动子与基因库的序列完全一致,双荧光素酶报告基因检测系统显示其在宫颈癌细胞中具有启动子活性。结论:成功得到人Hes1基因启动子并且其具有活性。     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

骨桥蛋白启动子区报告基因的构建

目的 克隆和构建带人骨桥蛋白(OPN)启动子区基因的载体pGL3-OPN.方法 一步法提取人脐静脉内皮细胞(HUVEC)总DNA,PCR扩增 OPN全长基因,克隆入T载体,测序,双酶切连入真核表达载体pGL3-vector,酶切鉴定.将构建好的pGL3-OPN瞬时转染到人乳腺癌细胞MDA-MB-435中,利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测,通过计算两种质粒荧光素酶活性的比值来筛选药物.结果 扩增出人OPN基因全长,测序结果和GenBank记载一致,成功克隆入真核表达载体.p47可一定程度激活OPN启动子活性.结论 成功构建带有人OPN基因的真核表达载体pGL3-OPN.     

人二硫键氧化还原酶类似蛋白基因启动子克隆和上游抑制元件分析

目的 克隆DsbA-L基因启动子,并对其活性进行初步分析。方法 以人基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增DsbA-L基因5’端2115bp片段（从翻译起始点ATG上游-2128~-14区域）。将PCR产物插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic。随后,构建5’端系列缺失的报告基因质粒。将构建的一系列质粒转染3T3-L1和HEK 293细胞,检测荧光素酶活性。利用在线软件MAPPER预测转录调控关键序列潜在的转录因子结合位点。通过Real-time PCR比较这些转录因子在肥胖和正常人脂肪组织中的表达。结果 成功构建人DsbA-L启动子报告基因质粒。系列缺失分析表明-2128~-1302区域是影响转录活性的关键序列。MAPPER软件预测此区域可能与一些转录因子结合。比较这些转录因子在肥胖患者和正常人脂肪组织中的表达情况,发现其中NF-κB和FOXO1在肥胖患者中表达显著增加,进一步推测NF-κB和FOXO1可能是人DsbA-L基因启动子上游的调控抑制因子。结论 成功构建人DsbA-L基因启动子系列缺失质粒,初步分析了其上游可能存在的关键调控元件,为进一步的转录调控研究奠定了基础。     

人类新基因CHID1的克隆与功能初步研究

使用生物信息学手段,从人公共蛋白质数据库的蛋白质序列中筛选到新的分泌蛋白基因CHID1(Chitinase domain containing 1),该基因定位于人11号染色体短臂15区5带(11p15.5),cDNA长1 182 bp,其编码蛋白共有393个氨基酸。转染COS-7细胞后Western blot实验显示:在细胞培养液中没有检测到CHID1蛋白。对CHID1基因在mRNA水平上进行组织分布考察发现:它在肺、肾、肝、心、胸腺中都有表达,肝中最高。细胞生长曲线揭示,Lovo-CHID1稳定细胞株有生长抑制的现象,而细胞周期分析发现细胞株在G1期发生阻滞。这表明CHID1有可能是个潜在的抑癌基因。     

PTEN异常表达及甲基化与PTC的关系

目的探讨PTEN异常表达及其基因启动子区异常甲基化与甲状腺乳头状癌发生、发展及转移的关系。方法采用免疫组化、western-blot、甲基化特异性PCR(MSP)分析正常甲状腺与甲状腺乳头状癌组织中PTEN蛋白表达差异及PTEN基因启动子区甲基化情况。结果与正常甲状腺组织相比,甲状腺乳头状癌组织中PTEN蛋白表达明显下调(P<0.01),同时笔者发现PTEN基因蛋白的下调与肿瘤的淋巴结转移状况呈负相关(P<0.005),且甲状腺乳头状癌组织中PTEN基因启动子区甲基化程度显著增高。结论 PTEN蛋白低表达是甲状腺乳头状癌的发生、转移的重要原因之一,其低表达与基因启动子区过度甲基化有关。     

高血压相关基因CAT启动子多态结构对基因转录活性作用初步研究

目的 研究高血压相关基因过氧化氢酶(Catalase,CAT)基因启动子上游区T多态结构对转录活性的影响.方法 将CAT基因启动子T多态片断插入pGFP-1报告载体GFP基因上游的多克隆位点,重组质粒转化E.coli TG1受体细胞,经蛋白电泳和荧光显微镜观察,检测GFP报告基因的表达情况.结果 显示CAT启动子上游T多态不影响GFP报告基因的表达,实验结果与人细胞中分析结果相同.结论 说明从多态遗传结构而言,CAT启动子上游T多态结构不影响转录活性.     

抑癌基因RAS启动子甲基化与乳头状甲状腺癌的关系

目的观察抑癌基因RAS在乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)中的表达,分析其启动子甲基化与肿瘤发生的关系。方法 选择50例PTC和32例良性甲状腺肿瘤(对照组,包括20例结节性甲状腺肿,12例甲状腺腺瘤)患者,对2组患者手术获取的标本提取RNA后,反转录为cDNA,进行多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),检测RAS基因的表达情况;运用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测上述组织中RAS基因启动子区甲基化的情况,并对2种抑癌基因甲基化和未甲基化的组织随机进行测序。结果 PTC组患者中,有30例(60%)RAS基因启动子发生甲基化;对照组患者中,有10例(31.3%)RAS基因启动子发生甲基化;PTC组织RAS基因启动子甲基化率均显著高于对照组,差异有统计学意义(χ2=6.46,P<0.05)。乳头状甲状腺癌mRNA的半定量的值为0.56±0.10,对照组mRNA半定量的值为0.67±0.16,乳头状甲状腺癌mRNA的表达明显低于对照组,两者差异具有统计学意义(t=2.83,P<0.05)。经DNA测序证实,RAS基因启动子发生甲基化的其CpG岛的碱基未发生改变,仍为CG;未发生甲基化的,碱基由CG变为TG。结论 PTC患者RAS基因启动子甲基化发生率显著高于良性甲状腺肿瘤患者,而RAS基因mRNA的表达则较良性甲状腺肿瘤降低;推测RAS基因启动子甲基化可能与PTC的发生、发展相关。     

一个小型人酪氨酸羟化酶基因启动子的分离和活性分析

目的探讨酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因上游调控区的功能。方法PCR法扩增人TH基因上游片段,插入pGL3-Basic质粒,构建一个表达荧光素酶的报告基因。将报告基因瞬间转染MES23.5、293及Cos7细胞,用Dual Luciferase Assay法测定目的DNA片段的启动子活性。结果测序结果表明,分离的DNA片段长度为520bp,与人TH基因-493/+27区一致。与pGL3-Basic质粒相比较,构建的报告基因在3种细胞中显著表达(P<0.01)。结论TH基因-493/+27区具有明显的启动子活性,构建的报告基因有助于研究TH基因表达的调节。     

3种胃癌细胞株中GSTP1基因表达及其启动子区甲基化状态的研究

目的研究候选基因GSTP1在胃癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨胃癌细胞株GSTP1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。方法采用RT-PCR和Western blot技术分别检测GSTP1在人胃癌细胞株MGC803、BGC823和SGC7901中的mRNA和蛋白表达水平。甲基化特异性PCR(MSP)法检测启动子区域甲基化状态。分别用不同浓度的去甲基化药物5-氮杂胞苷处理GSTP1基因启动子区高甲基化状态细胞后,再检测GSTP1基因蛋白表达水平。结果人胃癌细胞株BGC823和SGC7901中GSTP1 mRNA和蛋白呈阳性表达,MGC803中mRNA和蛋白呈阴性表达;BGC823和SGC7901细胞GSTP1基因启动子区域未发生甲基化,而MGC803细胞启动子区呈高甲基化状态;经5-氮杂胞苷药物干预后,MGC803细胞的GSTP1蛋白表达明显增强。结论胃癌MGC803细胞株中GSTP1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。