微小RNA-23a调控大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化的实验研究

目的:研究微小RNA-23a(microRNA-23a,miR-23a)调控大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的作用和分子机制。方法:分离大鼠BMSCs并转染miR-23a基因后,通过RT-PCR和番红O染色法检测miR-23a调控大鼠BMSCs成软骨分化的作用,并进一步利用Western blot研究番红O调控BMSCs成软骨分化的分子机制。结果:转染miR-23a组和未转染组相比,成软骨分化相关基因如Sox9、二型胶原(CollagenⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)发生明显上调,而软骨肥大相关基因十型胶原(CollagenⅩ)表达发生下调。番红O染色显示转染miR-23a组和未转染组相比,硫酸软骨素表达亦发生明显上调。Western blot检测显示转染miR-23a能明显促进大鼠BMSCs的Sox9蛋白表达而抑制其Runx2蛋白表达。结论:miR-23a可能通过上调Sox9表达及抑制Runx2表达来达到促进BMSCs成软骨分化并抑制其进一步肥大的作用。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的:探讨一种简便可行的兔骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法。方法:通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线;倒置相差显微镜观察细胞形态;并向软骨细胞诱导分化,采用番红快绿染色和甲苯胺蓝染色鉴定。结果:经全骨髓贴壁法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长;成软骨诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出软骨细胞的形态特征和生物学特征。结论:采用全骨髓贴壁分离法操作简便,是培养兔骨髓间充质干细胞的理想方案,在适当的条件下BMSCs能多向分化。     

流体剪切力作用下间隙连接蛋白Cx43在骨改建中的机制初探

目的 探讨骨细胞在受到机械流体剪切力作用后，间隙连接蛋白Cx43参与骨改建的机制。方法 将受流体剪切力作用的骨细胞分成5组，即施加生理流体剪切力组，过大流体剪切力组，siRNA干扰组，18a-GA阻断组，对照组。收集加力后系统内的循环液体作为条件培养基对单核细胞株RAW264.7和骨髓间充质干细胞MSCs进行培养，观察破骨细胞的生成和钙化结节形成情况。结果 抑制骨细胞内Cx43的表达或阻断胞间的间隙连接通路，均能导致破骨细胞诱导生成相关因子增加，促进破骨细胞生成，抑制骨髓间充质干细胞MSCs成骨向分化。结论 间隙连接蛋白Cx43作为骨细胞上的力学感应受体，能通过影响成骨、破骨活动对骨改建发挥重要的调节作用。     

Y-27632对小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的：观察ROCK抑制剂Y－27632对体外缺血清培养的小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响。方法原代分离培养小鼠骨髓单个核细胞,应用流式细胞术对细胞CD29、CD44、CD90、CD34表面标志进行检测。成骨、成脂肪、成软骨分化后分别进行茜素红、油红O及甲苯胺蓝染色。将第3代细胞随机分为3组：对照组、模型组（无血清）、Y－27632组（无血清＋10μmol／L Y－27632）,分别于培养后24、48、72 h收集细胞进行流式细胞仪TUNEL法观察各组细胞凋亡率,培养后24 h Western blot法检测ROCK1及cleaved caspase 3表达。结果分离的骨髓单个核细胞CD29（＋）、CD44（＋）、CD90（＋）、CD34（－）,三系分化后茜素红染色（＋）,油红O染色（＋）,甲苯胺蓝染色（＋）。 Y－27632能明显降低由于缺血清培养导致的BMSCs的凋亡率（P＜0.01）,Y－27632能够明显降低ROCK及cleaved－caspase 3表达（ P＜0.01）。结论分离的骨髓单个核细胞就是骨髓间充质干细胞。Y－27632能够抑制由于缺血清培养导致的小鼠骨髓间充质干细胞的凋亡。     

骨髓间充质干细胞的分离培养及定向诱导软骨细胞的实验研究

目的　体外培养大鼠骨髓间充质干细胞并向软骨细胞表型分化 ,探讨其作为组织工程软骨种子细胞的可行性。方法　取成年大鼠股骨骨髓 ,体外培养、纯化。取第三代成年大鼠骨髓间充质干细胞 ,实验组用HG DMEM无血清培养液诱导 ;对照组用含 1 0 %胎牛血清的HG DMEM培养液自然分化。形态学观察 ,免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌。结果　大鼠骨髓间充质干细胞为均一的成纤维细胞样。实验组与对照组Ⅱ型胶原免疫组化阳性率有显著差异 (P <0 .0 1 )。结论　成年大鼠骨髓间充质干细胞在特定的培养基能向软骨细胞方向转化 ,作为软骨组织工程种子细胞具有可行性     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化及凋亡的研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经细胞诱导分化的潜能,及分化后的凋亡情况?方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用含有表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导培养基对第三代MSCs进行诱导分化,诱导分化的细胞按分化时间3?7?14 d分成A?B?C三组?三组诱导分化细胞分别进行NSE免疫组织化学,MAP2免疫荧光化学以及TUNEL凋亡细胞检测?结果:A?B?C三组细胞在细胞形态上与神经细胞相似,并且表达神经细胞特异性标记抗原NSE?MAP2,但是C组细胞表达强度弱于B组,并且阳性细胞比例少于B组(P < 0.05)?A?B?C三组TUNEL凋亡阳性细胞比例呈逐渐增多趋势(P < 0.05)?结论:含有表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导培养基可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,随着诱导时间的推移,分化细胞状态下降,凋亡比例增多?     

骨髓间充质干细胞复合壳聚糖凝胶体外构建可注射组织工程软骨

目的：探讨壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶用作骨髓间充质干细胞的载体体外构建可注射型组织工程软骨的有效性和可行性。方法：骨髓间充质干细胞与壳聚糖/β-甘油磷酸钠制成注射型细胞/凝胶复合物并行体外成软骨诱导培养,通过倒置显微镜、扫描电镜和组织学检查等观察细胞在凝胶内黏附、生长、增殖、向软骨细胞分化及形成软骨样组织等情况。结果：在体外成软骨培养条件下,壳聚糖凝胶支持骨髓间充质干细胞生长、增殖、向软骨细胞分化并形成软骨样组织。结论：骨髓间充质干细胞/壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶复合物,有望用作可注射型组织工程软骨修复软骨缺损。     

霉酚酸对人骨髓来源间充质干细胞的作用

目的:研究霉酚酸( mycophenolic acid,MPA)对人骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的作用及其机制.方法:在MSCs生长和分化过程中加入不同浓度的MPA,用CCK-8方法分析MSCs增殖的情况,用Annexin V/PI双染色法检测MPA各浓度组的细胞凋亡,RT-PCR方法分析MSCs次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)的表达;应用von Kossa染色、钙定量和real-time PCR方法分析MPA对MSCs成骨分化的影响.结果:1～100 μmol/L的MPA呈时间浓度依赖性地抑制间充质干细胞的生长,添加鸟嘌呤核苷可以解除该抑制效应,且该抑制效应与细胞凋亡无关;RT-PCR结果显示,MSCs表达IMPDH I和IMPDH Ⅱ两种亚型;yon Kossa染色和钙定量显示,MPA抑制MSCs的成骨分化,Osteopontin和BMP-2的表达相应减低;进一步研究发现,MPA可能通过影响转录因子Runx2、Osterix的表达而影响MSCs的成骨分化.结论:MPA通过耗竭鸟嘌呤核苷的方式呈时间浓度依赖性抑制人骨髓来源的间充质干细胞的增殖;同时,MPA通过抑制Runx2和Osterix蛋白的表达,抑制MSCs的成骨分化.     

滑膜间充质干细胞软骨分化能力的实验研究

目的 探讨滑膜间充质干细胞软骨分化能力.方法 无菌状态下获取兔颞下颌关节滑膜组织,酶消化法进行滑膜间充质干细胞原代培养,并进行传代扩增.第3代细胞消化后离心成为细胞团块,用软骨诱导液培养,并以鸡尾酒法添加生长因子人重组转化生长因子β1(recombined human transforming growth factorβ1,rhTGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),即前3天2种生长因子共同使用,之后只用rhTGF-β1继续培养18d.细胞团块培养21 d后,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原的表达.细胞团块培养在普通培养基中不添加rhTGF-β1和bFGF作为对照组.结果 滑膜间充质干细胞经过传代培养后,成为形态一致的梭形细胞;细胞团块经软骨诱导液、rhTGF-β1和bFGF培养后,免疫组织化学染色可见Ⅱ型胶原在细胞之间的细胞外基质中明显显色,并且细胞团块的周边要比中央浓染;原本二维培养状态下的梭形滑膜间充质干细胞变为球形的软骨样细胞形态.结论 滑膜间充质干细胞具有很强的成软骨能力,可以作为髁突软骨组织工程的种子细胞.     

Delta阿片受体激活对大鼠骨髓间充质干细胞存活的影响

目的探讨Delta-阿片受体激活对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)存活的影响。方法体外分离培养骨髓间充质干细胞,实验分为4组,Ⅰ组(正常对照组),Ⅱ组(模型组):MSCs中加入放线菌素D;Ⅲ组(放线菌素D+SNC80组):MSCs细胞中加入放线菌素D和SNC80;Ⅳ组:MSCs细胞中加入放线菌素D、SNC80和Naltrindole。继续培养24 h后MTT法测定细胞活力;Annexin V-FITC/PI双标记法测定细胞凋亡;免疫印迹分析Caspase-3表达水平。结果 Delta-阿片受体激动剂SNC80可抑制骨髓间充质干细胞凋亡,但可被Delta阿片受体阻断剂Naltrindole抑制。结论 Delta-阿片受体激活可促进骨髓间充质干细胞存活,为提高骨髓间充质干细胞移植存活提供理论依据。