与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库构建

目的 构建与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库,为进一步筛选、克隆按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵差异新基因奠定基础.方法 以大劣按蚊-约氏疟原虫为实验模型,分别将饱吸约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后14 d的大劣按蚊作为T 组和D 组,采用抑制差减杂交方法和T/ A克隆技术构建按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入...     

大劣按蚊AdS7基因的克隆及分析

目的克隆AdS7基因cDNA序列,为大劣按蚊基因定量研究提供内参照.方法采用RT-PCR扩增、TA克隆技术获得AdS7 cDNA部分序列,标记地高辛AdS7探针,从大劣按蚊cDNA文库中筛选得到AdS7全长克隆,以半定量RT-PCR方法研究血餐和约氏疟原虫感染对其表达水平的影响.结果从大劣按蚊cDNA克隆得到长464 bp的AdS7基因cDNA部分序列,从大劣按蚊cDNA文库筛选获得了长871 bp的AdS7基因全长克隆,大劣按蚊吸血和感染约氏疟原虫后24 h,AdS7表达水平没有显著变化.结论 AdS7基因可作为大劣按蚊基因定量研究的内参照.     

大劣按蚊感染约氏疟原虫defensins基因的克隆及生物信息学分析

目的为探讨大劣按蚊对约氏疟原虫侵入的免疫反应,克隆大劣按蚊的抗菌肽defensins基因并对基因序列进行生物信息学分析。方法分别提取感染疟原虫的大劣按蚊的蚊胃总RNA,根据冈比亚按蚊defensins基因设计、合成简并引物,进行RT-PCR扩增目的片段,TA克隆后测序并进行序列分析。结果用简并引物的RT-PCR扩增出约氏疟原虫感染的大劣按蚊的189bp目的片段,序列分析表明与冈比亚按蚊defensins有87%同源性,与白蚊伊蚊defensinsD有88%同源性,为大劣按蚊的defensins基因。结论成功克隆并分析了大劣按蚊抗菌肽defensins基因,为进一步的重组表达和研究按蚊抗菌肽的生物活性奠定基础。     

约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶的变化

目的比较分析约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)的分布及其变化,探讨中肠PPO与按蚊抗疟原虫感染免疫防御反应的关系.方法解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后3、5、7、11和15 d斯氏按蚊与大劣按蚊的中肠.利用烟草天蛾PPO抗体分别进行免疫组化染色和免疫印迹分析.结果斯氏按蚊与大劣按蚊在未感染约氏疟原虫前的中肠循环管道内均已存在PPO,而感染后循环管道内的PPO扩散到中肠组织间隙并聚集成片状、块状或条索状,大劣按蚊中肠PPO的聚集程度大于斯氏按蚊;在感染前和感染后不同时期免疫印迹均可检测到斯氏按蚊与大劣按蚊中肠PPO蛋白带,分子量约为67×103,感染后的PPO蛋白带型比感染前明显增强,而且大劣按蚊中肠PPO蛋白带型比斯氏按蚊尤为明显.结论约氏疟原虫感染前按蚊中肠循环管道内存在的PPO可能是经与血淋巴相通的循环管道扩散而来,感染后导致的中肠内PPO不同分布及其变化可能与疟原虫感染按蚊密切相关,并可能具有重要的生理学意义以及与激活按蚊抗疟原虫感染的免疫防御反应相关.     

大劣按蚊感染约氏疟原虫defensins基因的克隆及生物信息学分析

目的 为探讨大劣按蚊对约氏疟原虫侵入的免疫反应,克隆大劣按蚊的抗菌肽defensins基因并对基因序列进行生物信息学分析.方法 分别提取感染疟原虫的大劣按蚊的蚊胃总RNA,根据冈比亚按蚊defensins基因设计、合成简并引物,进行RT-PCR扩增目的片段,TA克隆后测序并进行序列分析.结果 用简并引物的RT-PCR扩...     

约氏疟原虫感染诱导大劣按蚊AdSP1 和AdSP3的转录

目的观察丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊主要组织中的表达,分析血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞AdSP1 和AdSP3转录的影响.方法离心收集血细胞,解剖分离大劣按蚊蚊胃和唾液腺,提取相应的总RNA,RT-PCR扩增;然后将同批3～5 d龄大劣按蚊分为正常组(N)、吸正常血组(B)和感染约氏疟原虫组(I),分别在血餐后1、2、3、4、7 d和11 d,收集3组各50只雌大劣按蚊血细胞和提取总RNA,以Ads7为内参照,进行半定量RT-PCR分析.结果丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊血细胞和唾液腺中表达,不在蚊胃表达;吸血和约氏疟原虫感染后,大劣按蚊血细胞中AdSP1 和AdSP3的转录上调,尤以约氏疟原虫黑化期间明显.结论 AdSP1和AdSP3可能参与大劣按蚊对约氏疟原虫的黑化反应,并可能是大劣按蚊的PPAE.     

约氏疟原虫感染对大劣按蚊PPO4基因转录与卵囊内Ca2+的影响

目的观察约氏疟原虫感染对大劣按蚊前酚氧化酶(prophenoloxidase, PPO)基因转录的影响与卵囊黑化期间囊内Ca2 的变化,探讨疟原虫感染不易感蚊种时卵囊黑化的相关机制.方法分别在大劣按蚊吸血感染约氏疟原虫前与感染后1、2、3和5 d抽提蚊总RNA进行RT-PCR,PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后扫描进行凝胶图像分析,并对所得数据进行统计学处理.在吸血感染后5、7、11和15 d解剖分离按蚊中肠,以荧光染料Fluo-3/Am作为卵囊内Ca2 指示剂,利用共聚焦扫描显微镜观察不同时期约氏疟原虫卵囊内Ca2 的分布及变化.结果吸血感染约氏疟原虫前大劣按蚊PPO4基因的RT-PCR扩增产物较少,但感染后明显增加(P<0.01),尤其在感染后1 d与2 d最为明显;约氏疟原虫未黑化卵囊内Ca2 为(137.15±7.02) nmol/L,完全黑化卵囊内Ca2 为(18.44±1.75) nmol/L、并在囊壁出现明显的钙沉着.结论吸血感染约氏疟原虫后大劣按蚊PPO4基因转录比感染前明显增强,黑化卵囊内Ca2 较未黑化卵囊明显减少,并有外排现象.     

吸血和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中rpS7转录的影响

目的　观察血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中核糖体蛋白S7(Ribosomalprotein ,rpS7)转录的影响。方法　同批 3～ 5d龄大劣按蚊分为正常组 (N)、吸正常血组 (B)和感染约氏疟原虫组 (I) ,分别在血餐后 1、2、3、7d ,离心法同时收集 3组各 5 0只雌大劣按蚊血细胞总RNA ,所有样品进行RT PCR后 ,各吸取 10ulPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 ,凝胶图像分析系统扫描并读取数据 ,并对所得数据进行统计学分析。结果　 3组大劣按蚊血细胞rpS7mRNA的RT PCR扩增产物量无显著差异 (P >0 0 5 )。结论　类似于人类和小鼠 β actin ,以及冈比亚按蚊rpS7,大劣按蚊血细胞rpS7可作为从分子水平研究大劣按蚊抗约氏疟原虫感染防御相关因子的内参照     

斯氏按蚊MyD88基因生物信息学分析及其在抗约氏疟原虫感染中的作用

目的 对斯氏按蚊MyD88基因进行生物信息学分析,并研究其在抗约氏疟原虫感染中的作用。方法 首先,通过VectorBase数据库获取斯氏按蚊MyD88基因cDNA序列,并利用VectorNTI、DNAMAN等软件对MyD88基因cDNA序列进行生物信息学分析。然后,根据MyD88的cDNA序列设计Real-time PCR引物,提取斯氏按蚊总RNA,通过反转录合成 cDNA,利用Real-time PCR方法检测MyD88基因在蚊各个生活史阶段转录水平情况及其在约氏疟原虫感染后的转录水平变化。结果 斯氏按蚊MyD88基因位于斯氏按蚊KB664619号染色体155 163~158 066 bp的反义链上,包含两个外显子,其cDNA全长1 383 bp,编码460个氨基酸。系统发育树结果显示,斯氏按蚊与大劣按蚊和冈比亚按蚊系统发育的距离近,其氨基酸序列同源性达79%。对斯氏按蚊各时期MyD88基因转录水平的研究结果显示,吸食正常血和感染血均能够上调MyD88的转录,吸血后3 d和5 d吸感染血组MyD88基因转录水平上调明显,显著高于正常血组和未吸血组。结论 本研究证实了Toll信号通路中的MyD88基因在蚊抗疟原虫感染的天然免疫中发挥了重要作用,在感染后3 d时作用明显。     

约氏疟原虫卵囊黑化期间大劣按蚊血淋巴蛋白的分析

目的　初步探讨大劣按蚊 (Anophelesdirus)黑化包被约氏疟原虫 (Plasmodiumyoelii)卵囊相关蛋白。方法　挤压法分别收集血餐后第 1、3、4、5天时不吸血组、吸正常血组和感染组的雌大劣按蚊血淋巴 ,经SDS PAGE分离后 ,银染显色。同时 ,用烟草天蛾 (ManducaSexta)前酚氧化酶 (Prophenoloxidase ,PPO)亚基 1IgG检测正常雌大劣按蚊血淋巴中的PPO。结果　SDS PAGE发现感染约氏疟原虫后 ,部分大劣按蚊的血淋巴蛋白带增强 ,而部分血淋巴蛋白带却减弱 ,免疫印迹发现大劣按蚊血淋巴PPO有 87× 10 3 、6 7× 10 3 、6 3× 10 53条蛋白带 ,而相应分子量的 3条蛋白带在约氏疟原虫感染后第 4、5天开始增强 ,其中尤以 87× 10 3 的增强最为明显。结论　大劣按蚊在对约氏疟原虫卵囊黑化包被期间诱导合成的某些血淋巴蛋白与前酚氧化酶级联反应主要成分有关联     

2型糖尿病患者脂肪组织CD14+细胞基因表达的变化及其与环境因子的关系

目的:基于芯片数据研究2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者脂肪组织CD14+细胞的基因表达情况,筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),利用生物信息学方法分析肥胖影响T2DM患者免疫状况的分子机制及环境因子对该机制的影响.方法:...     

Screening for genes associated with ovarian cancer prognosis

Background Human epithelial ovarian cancer cell line SKOV3.ipl is more invasive and metastatic compared with its parental line SKOV3. A total of 17 000 human genome complementary DNA microarrays were used to compare the gene expression patterns of the two cell lines. Based on this, the gene expression profiles of 22 patients with ovarian cancer were analyzed by cDNA microarray, and screened the 2-fold differentially expressed genes compared with the normal ones. We screened genes relevant to clinical prognosis of serous ovarian cancer by determining the expression profiles of ovarian cancer genes to investigate cell receptor and immunity-associated genes, and as groundwork, identify ovarian cancer-associated antigens at the gene level.
Methods Total RNA was extracted from 22 patients with ovarian cancer and DNA microarrays were prepared. After scanning, hybridization signals were collected and the genes that were differentially expressed twice as compared with the normal ones were screened.
Results We screened 236 genes relevant to the prognosis of ovarian cancer from the 17 000 human genome cDNA microarrays. According to gene classification, 48 of the 236 genes were cell receptor or immunity-associated genes, including 2 genes related to the International Federation of Gynecology and Obstetrics （FIGO） stage, 4 genes to histological grade, 18 genes to lymph node metastasis, 11 genes to residual disease, and 13 genes to the reactivity to chemotherapy. Several functionally important genes including fibronectin 1, pericentriolar material 1, beta-2-microglobulin, PPAR binding protein were identified through review of the literature.
Conclusions The cDNA microarray of ovarian cancer genes developed in this study was effective and high throughput in screening the ovarian cancer-associated genes differentially expressed. Through the studies of the cell receptor and immunity-associated genes we expect to identify the molecular biology index of ovarian cancer-associated antigens.     

人鼻咽癌组织中转录因子相关基因的差异表达分析

目的 用cDNA微阵列膜比较鼻咽癌组织及正常组织的基因表达谱,研究鼻咽癌组织中转录因子相关基因的差异表达,为进一步探讨差异表达基因的调控机制奠定基础.方法 24例鼻咽癌组织总RNA和正常对照总RNA(24例正常鼻咽组织RNA等质量混合)分别经逆转录探针标记与微阵列膜杂交.然后用Pathway4.0软件分析杂交结果,并用RT-PCR反应验证微阵列杂交结果.结果 在1625个鼻咽癌差异表达基因中,共有转录因子相关基因35个,12个基因表达上调,23个基因表达下调.结论 在鼻咽癌组织中,多个转录因子相关基因的表达水平发生了变化,这些转录因子在鼻咽癌组织的基因表达调控中发挥重要作用.     

基于差异性表达谱分析挖掘不同亚型鼻咽癌的保护性转录因子

目的探究41例鼻咽组织活检样本中差异基因表达谱所显示的失调基因及挖掘调控这些基因的转录因子。方法利用
EXCEL及生物信息学方法分析Ⅰ、Ⅱ型鼻咽癌（NPC）患者鼻咽组织活检样本中差异表达基因谱,挖掘出同时符合以下条件的
转录因子：（1）在两组差异表达基因的结合位点具有统计学意义;（2）鼻咽组织中转录因子与基因的表达存在相关性;（3）相关基
因的表达至少有40%是受转录因子影响的。结果在Ⅰ型NPC较Ⅱ型NPC上调的差异表达基因谱（“Ⅰ_Ⅱ_Up”）中,找到对应
的符合条件的转录因子有80 个。其中RUNX3、GATA3、NR3C1、NRF1、RXRA、SMAD7、TBP、ZBTB6 等8 个正调节因子和
HLF、MTF1等2个负调节因子,它们调控与T细胞受体信号通路相关的基因。然而在Ⅰ型NPC较Ⅱ型NPC下调的差异表达基
因谱（“Ⅰ_Ⅱ_Down”）中,未找到符合条件的转录因子。结论通过分析Ⅰ、Ⅱ型NPC患者鼻咽组织活检样本的差异表达基因
谱发现,Ⅰ型NPC（NPC_Ⅰ）患者的差异表达基因主要与机体免疫反应相关,利用EXCEL及生物信息学方法,挖掘出8个正调
节因子和2个负调节因子,主要调控与T细胞受体信号通路相关的基因。预测到的这10个转录因子有可能成为药物研发的新
靶点,通过增强机体免疫防御能力,有望提高NPC患者的生存率。但研究中未能发现与“Ⅰ_Ⅱ_Down”基因谱明显相关的转录
因子,这可能与NPC_Ⅱ患者差异表达基因受转录因子、DNA修饰、磷酸化、染色体变异、环境等多因素影响有关。
     

2型糖尿病患者心肌间充质细胞基因表达变化及相关环境化学物的筛选

目的 基于全基因组高通量测序数据研究2型糖尿病(T2DM)患者心肌间充质细胞的基因表达情况,筛选差异表达基因,采用生物信息学分析评估T2DM心肌间充质细胞的遗传规律及环境因素对上述规律的影响。方法 从高通量基因表达公共数据库中获得数据集GSE106177,采用Network Analyst、Cytoscape、String11.0、CTD、HMDD等分析软件或数据库对数据进行预处理,筛选差异表达基因,进行生物学功能与信号通路富集分析,建立差异基因蛋白质相互作用(PPI)网络,筛选相关环境化学物。结果 T2DM患者心肌间充质细胞的基因表达模式与对照组明显不同,共有135个差异表达基因,其中上调基因58个(42.96%),下调基因77个(57.04%);差异表达基因主要参与多细胞生物发育、解剖结构发展和系统发育等生物学过程,主要涉及肝细胞癌、库欣综合征、胆固醇代谢等通路。PPI网络显示,UBC为核心蛋白节点;microRNA-Gene交互作用网络显示,以hsa-mir-8485为代表的7个microRNA与差异表达基因具有交互作用关系;UBC、DNER、CNTN1等T2DM重要相关基因均与双酚A有交互作用关系。结论 T2DM患者心肌间充质细胞的基因表达模式发生明显改变,UBC可能在上述过程中发挥重要生物学作用,双酚A暴露也可能影响T2DM患者心肌细胞的发育和正常功能。     

NF-κB通过调控早期反应基因-2参与小鼠肝再生启动

目的结合基因芯片技术、生物信息学分析和染色质免疫共沉淀技术分析小鼠肝再生启动阶段的差异表达基因,并探讨其调控方式。方法采用小鼠全基因组基因表达谱芯片检测并验证肝再生启动阶段2组差异表达基因;应用基于TRANSFAC数据库的PAINT对差异表达基因进行转录调控分析;最后运用染色质免疫共沉淀技术验证NF-κB的潜在靶基因。结果肝切后4 h小鼠差异表达基因共332个(上调127个,下调205个),其中早期反应基因-2(immediate earlyresponse 2,IER2)上调约5倍;对所有差异表达基因进行PAINT分析,预测到多个转录因子如Stat家族和NF-κB均参与差异表达基因调控网络;免疫共沉淀技术证实IER2受NF-κB调控。结论NF-κB可能通过调控IER2参与肝再生启动。     

六价铬暴露人支气管上皮细胞致DNA损伤相关差异表达基因筛选

目的 建立六价铬Cr（Ⅵ）暴露人支气管上皮细胞（16HBE）的基因差异表达谱,并分析其致DNA损伤修复相关差异基因表达改变,筛选该毒性作用产生过程中的关键基因,为研究六价铬毒性机制提供新的思路和理论依据。方法 采用Affymetrix 3′IVT基因芯片检测Cr（Ⅵ）急性暴露16HBE细胞诱导的差异基因表达谱,运用生物信息学方法分析差异基因的相关生物学功能;进一步用Western blot蛋白电泳技术验证差异基因的蛋白表达水平。结果 Affymetrix 3′IVT基因芯片结果显示约200个基因表达变化大于2倍以上;生物信息学分析提示差异基因主要富集在DNA损伤与修复、转录与翻译等通路;DNA损伤修复通路中,FEN1、PCNA和APX1的mRNA表达水平均呈上升趋势,其中FEN1和PCNA基因的表达量均增加了约100%,差异有统计学意义（P<0.01）;Western blot结果显示FEN1、PCNA和APX1表达水平均呈上升趋势,与基因表达变化一致,其中FEN1的表达变化差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Cr（Ⅵ）急性暴露人支气管上皮细胞可激活DNA损伤修复信号通路,使DNA损伤修复基因FEN1表达上调,DNA损伤修复通路可能在Cr（VI）诱导16HBE细胞毒性中发挥重要作用。     

2型糖尿病患儿基因表达谱的改变及其发病机制

目的：探讨儿童2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发病机制,为其早期诊断和医治提供基因组 学证据。方法：从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的高通量基因表达 数据库(gene expression omnibus,GEO)中检索得到12例T2DM患儿和24例健康儿童的外周血基因芯片数据集,利用R 语言软件筛选出差异表达基因,并采用GenCLiP 2.0,STRING及Cytoscape等软件分析两组差异表达基因有关的生物学 功能、蛋白质相互作用网络、信号通路、基因-通路相互作用、关键基因的表达状况和预测价值评价。结果：共筛选 出79个差异表达基因,其中表达上调的有58个(73.42%),表达下调的有21个(26.58%),差异表达基因主要涉及防御反 应、对外刺激反应、炎症应答等分子功能和生物学过程,主要参与利什曼病、细胞因子及其受体的相互作用、Toll样 受体信号通路等;白细胞介素1β(interleukin 1 beta,IL-1β)、jun原癌基因(jun proto-oncogene,JUN)和IL-8是蛋白-蛋白 相互作用网络中典型子网络的3个重要链接节点;JUN和IL-1β基因是关键基因,其均与1L-17信号通路、Toll样受体信 号通路等有关;T2DM患儿外周血的JUN基因表达下降,IL-1β基因表达升高;JUN和IL-1β基因对儿童T2DM均具有一 定的诊断和预测价值。结论：T2DM患儿外周血的基因表达谱发生了明显改变,JUN和IL-1β基因与儿童T2DM关系密 切,IL-1β基因表达水平对儿童T2DM的预测效果较好。     

前列腺癌相关基因及功能的生物信息学分析

目的: 利用生物信息学方法和体外实验,寻找前列腺癌发生的关键基因。方法: 从GEO 数据库下载基因芯片数据 GSE60502,其中包括48例正常前列腺组织样本和47例前列腺癌组织样本。利用Morpheus(https:∥software.broadinstitute.org／morpheus／)在线工具分析前列腺癌组织和正常前列腺组织的差异表达基因,然后使用GCBI(https:∥www.GCBI.com.cn)在线进行差异表达基因的基因本体富集论(gene ontology,GO)分析、Pathway分析,对同时参与GO分析和Pathway分析的差异基因取交集,构建基因共表达网络和基因相互作用网络。最后通过CCK8实验进行验证。结果： 共筛选出6 903个表达差异的基因,差异最大的前15个基因中,有上调基因9个,下调基因6个,其中表达差异最大的基因为CRISP3。GO分析提示差异基因主要参与的分子生物学过程包括小分子代谢过程、信号转导、DNA依赖的转录过程、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节等。Pathway分析提示差异基因主要参与的通路包括PI3K-Akt信号通路、代谢途径、MAPK信号通路以及Wnt信号通路等。CACNA1A基因位于共表达网络的核心位置,而ADCY5、PIK3CB基因位于基因相互作用网络的核心位置。 体外CCK8实验证实下调CACNA1A表达可明显抑制前列腺癌细胞增殖能力。 结论： CRISP3、CACNA1A、ADCY5、PIK3CB基因可能是影响前列腺癌发生的关键基因。     

cDNA representational difference analysis of differentially expressed cDNA sequences in human nasopharyngeal carcinoma

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｅａｒｃｈｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃｏｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＮＰＣ）,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｃａｎｄｉ...