短穗鱼尾葵花粉泛过敏原profilin基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的克隆并表达短穗鱼尾葵花粉中泛变应原肌动蛋白抑制蛋白（profilin）。方法利用RT-PCR结合RACE技术克隆短穗鱼尾葵花粉中泛变应原profilin的全长基因,并进行序列分析。然后设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT-PCR获得整个短穗鱼尾葵花粉profilin的开放阅读框,将其与pET28a载体连接并转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,通过Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用Western-blot检测其IgE结合活性。结果克隆获得了短穗鱼尾葵花粉profilin的全长基因,由608个碱基组成,开放阅读框为396个碱基（包括终止密码子）,编码131个氨基酸。该序列编码的蛋白为小分子量酸性蛋白,等电点为4.52,相对分子质量约为14200。此序列已被GenBank收录,登陆号为EF173600。重组短穗鱼尾葵花粉profilin在大肠杆菌中高效的表达,进一步经Ni2＋亲和层析柱纯化后经Western-blot检测具有良好的免疫学活性。结论成功地克隆和表达了短穗鱼尾葵花粉profilin,为短穗鱼尾葵花粉过敏的诊断和免疫治疗奠定了基础。     

BSA-ELISA初步检测短穗鱼尾葵花粉特异性IgE

目的 对短穗鱼尾葵花粉粗浸液的主要变应原进行分析、鉴定.方法 通过SDS-PAGE分析短穗鱼尾葵花粉蛋白质组份.采用Westem blotting鉴定主要变应原,以短穗鱼尾葵花粉粗浸液包板,摸索出其包被浓度、血清稀释度和酶结合物浓度.采用BSA-ELISA法对短穗鱼尾葵花粉过敏患者血清进行初步检测,并与皮肤挑刺试验比较.结果 短穗鱼尾葵花粉粗浸液SDS-PAGE显示有30余条蛋白条带,其中主要蛋白条带有10条.Western blotting显示5例短穗鱼尾葵花粉过敏患者的混合血清能与其中3条蛋白条带起反应,分子量分别是26000、14000和12000Mr.BSA-ELISA检测短穗鱼尾葵花粉特异性IgE,最适粗浸液稀释度为1:100,血清稀释倍数为1:5,生物素化抗体为1:1000,辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(strepavidin-HRP)为1:1000.在此条件下BSA-ELISA与浸液皮试比较.检出结果与皮试阳性患者血清符合率为90%,与皮试阴性患者符合率为80%,与健康人对照检测符合率为100%.结论 本实验对短穗鱼尾葵花粉主要变应原进行了分离和鉴定,BSA-ELISA法测定结果与皮肤挑刺试验初步比较符合率较好.     

短穗鱼尾葵花粉总蛋白的双向电泳及分析

目的对短穗鱼尾葵花粉过敏原蛋白质组分进行双向电泳及其结果分析,构建短穗鱼尾葵花粉蛋白双向电泳图谱,明确短穗鱼尾葵花粉的过敏原蛋白组分的分布和构建蛋白质组学数据库。方法提取短穗鱼尾葵花粉的总蛋白,取上清液进行Bradford法定量总蛋白浓度,采用13 cm IPG胶条(p H 3~10)和12%的SDS-PAGE凝胶作为二项分离胶进行双向电泳(2D)分离,银染法分析其总蛋白组成,利用Image Master2D软件对2D胶进行检测和图像分析。结果双向电泳图谱共检测到516个短穗鱼尾葵花粉蛋白点,其蛋白相对分子质量在12~174 k D,主要在10~50 k D;等电点在p H 3~10,主要分布在p H 5~8。含量最多的蛋白质其相对分子质量和等电点分别为13 k D和p H 6.258 37。含量最低的蛋白质其相对分子质量和等电点分别为29 k D和p H 3.615 79。结论成功构建较为完整的短穗鱼尾葵花粉蛋白双向电泳图谱,为建立短穗鱼尾葵花粉蛋白质组学数据库及其过敏的诊断和治疗提供了依据。     

豚草花粉过敏原的分析、鉴定与纯化

目的：对豚草花粉变应原蛋白进行分析、鉴定与纯化。 方法：提取豚草花粉粗提液,SDS-PAGE分离其蛋白组份并测定分子量,Western-blotting鉴定其变应原组份,通过离子交换层析对花粉变应原进行初步纯化和免疫印迹鉴定。 结果：豚草花粉有30条蛋白带,其中主要条带有9条,70kDa、40kDa为其特异性变应原。经离子交换层析纯化出豚草花粉相对分子量为40 kDa的变应原主要分布在Ⅰ峰。 结论：豚草花粉粗提液中主要变应原为 70 kDa、40kDa蛋白组份。     

白花鬼针草花粉过敏原的分离鉴定与纯化

目的提取和分离纯化白花鬼针草花粉主要过敏原,并鉴定主要过敏原的致敏性。方法提取白花鬼针草花粉蛋白粗提液,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离粗提液蛋白组分并测定其分子质量,经离子交换层析法分离纯化几类主要的蛋白,Western blotting分别检测其与花粉过敏患者血清IgE结合情况及10位正常人阴性混合血清结合情况,对比鉴定每种主要蛋白质致敏原的致敏性。结果 SDS-PAGE结果示:在12.5~120ku之间广泛分布了20余条蛋白条带,其中主带7条,分子质量在35~70ku和10~15ku的区带蛋白含量最为丰富,余下的范围内还有约10余条次带。Westen-blotting检测示:白花鬼针草花粉变应原的致敏性强,与花粉过敏患者血清特异性IgE结合大。离子交换层析出6类主要变应原蛋白,其分子质量分别为70、65、54、49、39及33ku;阴性对照组Westen-blotting在70ku处有弱显色。结论白花鬼针草花粉的主要过敏原为70、65、54、49、39及33ku;70ku变应原致敏性最强。     

梧桐花粉主要变反原的分离纯化

以离子交换和凝胶过滤层析对梧桐花粉变应原进行分离和纯化,采用生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附分析法（BSA-ELISA）测定其抗原活性,得到两个具高活性的单一变应原组分PT13和PT53。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得它们的分子质量分别为20ku和18ku。     

杨树花粉变应原的提取及纯化

本文通过对杨树花粉变应原的纯化过程,作为治疗花粉症的各种花粉变应原的纯化方法推行探索。杨树花粉经过脱脂、提取、分离和葡聚糖G—25柱层析纯化,经紫外吸收光谱进行分组,冷冻干燥贮存,各组分经过免疫双扩散和临床33例杨树花粉粗浸出液皮内试验为阳性的病人对照证明有活性的组分,然后进行聚丙烯酰胺电泳证实为一纯品,同时以正常人血清对照测得分子量约为6.7万左右。     

河虾中主要过敏原组分鉴定及分离纯化

目的鉴定并分离纯化河虾中引起过敏反应的主要蛋白组分。方法河虾蛋白浸液皮下注射建立小鼠过敏模型,获得高效价特异性IgE血清用于免疫印迹分析。用饱和硫酸铵分段盐析和DEAE离子交换层析纯化目的蛋白。dot-ELISA及竞争ELISA检测纯化目的蛋白的过敏原活性。结果河虾蛋白浸液皮下注射成功建立了虾过敏小鼠模型。免疫印迹分析显示虾中有一分子量36kD的蛋白组分为主要过敏原。用硫酸铵分级沉淀和DEAE离子交换层析的方法成功分离到目的蛋白。dot-ELISA证明目的蛋白能与特异性IgE反应。竞争ELISA检测纯化目的蛋白与河虾蛋白浸液竞争结合特异性IgE的活性,最大竞争抑制率可达60％。结论本实验成功鉴定并分离到河虾中一分子量为36kD的主要过敏原组分,为过敏原的分析研究提供了一套比较完整的方法。     

葎草花粉变应原的纯化及免疫特性分析

目的 纯化葎草花粉变应原并分析其免疫学活性.方法 粗制葎草花粉提取液经Sephadex G-75Sephacryl S-200HR层析柱纯化,分段收集各组份.SDS-PAGE检测各组分蛋白相对分子质量,ELISA抑制实验及免疫印迹实验分析各组分蛋白质对特异性IgG和IgE的抑制率及与患者血清的反应率.结果 浓缩粗制葎草花粉提取液经SephadexG-75层析柱纯化,得到两个峰,第一峰富含蛋白质,第二峰含有大量色素,蛋白含量甚微,弃之;收集第一峰及其谷段洗脱液(P液),经Sephacryl S-200HR层析柱纯化,分离出4个组份,即第一峰(P1)、谷段(V)、第二峰(P2)和末段(E).电泳结果显示纯化后的蓓草花粉含20多种蛋白质条带,相对分子质量区带为5.0×103～97.4×103,P1段主要是相对分子质量为43×103～97.4×103的蛋白质,P2段和V段主要是相对分子质量为5.0X103～43×103的蛋白质,E段主要是相对分子质量为5.0×103以下的蛋白质;ELISA抑制实验结果显示P1、V、P2、E对sIgG抑制率分别为68%、70%、95%,5%,对sIgE抑制率分别为25%、64%、71%、11%;免疫印迹实验结果显示P1、V、P2、E与患者血清sIgG的反应率分别为65.63%、78.13%、87.50%、6.25%,与患者血清sIgE的反应率分别为25.00%、71.88%、84.38%、15.63%.结论 葎草花粉舍20多种蛋白质成分,相对分子质量在5×103～43×103之间的蛋白质变应原性和免疫原性均较强,为主要变应原;相对分子质量在43×103～94.7×103的蛋白质免疫原性强而变应原性弱,为次要变应原.     

王棕花粉变应原的分析与鉴定

目的对我国南方常见的棕榈科植物王棕花粉(Roystonea regia pollen)变应原蛋白进行分离、分析与鉴定,为标准化变应原疫苗的研制提供基础。方法取常规方法制备的王棕花粉浸出液,采用SDS-PAGE分离王棕花粉蛋白质组分,测定其相对分子量,同时用10例对王棕花粉过敏的患者血清作Western-blot鉴定其变应原及主要变应原成分。结果SDS-PAGE显示王棕花粉有10条可辨蛋白带,其中主要条带有8条,分别为100000、66000、38000、36000、29000、30000、24000、16000和14000Mr,Western-blot结果表明,10例王棕花粉过敏患者血清全部呈阳性反应,有66000、24000、16000和14000Mr共4条致敏条带,其中分子量在16000和14000Mr的蛋白为主要变应原。结论王棕花粉变应原的分析与鉴定为临床王棕花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

昆明市城区皮肤过敏花粉的调查研究

目的探讨昆明城区皮肤过敏患者花粉过敏原与空气中主要气传花粉的相关性,为过敏性疾病的防治提供科学依据.方法采用皮内试验检测96例昆明城区皮肤过敏患者的过敏花粉,同时采用Durham重量法连续收集昆明市城区气传花粉;用光学显微镜鉴定并统计花粉种类、数量.结果芸苔属花粉致敏阳性率最高,为39.5%,桤属和松属花粉分别位居第2和第3,致敏阳性率分别为35.4%和34.4%.全年搜集花粉共36555粒,松花粉在空气中含量最多,桤属花粉位居第2,禾本科、蔷薇科花粉分别居第3和第4.并在2～4月及9～11月形成两个花粉飘散高峰期.结论昆明城区皮肤过敏花粉主要是芸苔属、桤属和松属花粉,空气中含量多的花粉是松花粉、桤属和禾本科花粉有相关性.     

紫红笛鲷过敏原的提取、分离及其免疫学特性鉴定

目的对紫红笛鲷过敏原进行提取、分离及免疫学特性鉴定。方法新鲜紫红笛鲷经预处理后用PBS缓冲液制备总蛋白粗浸液,SDS-PAGE分析紫红笛鲷总蛋白的组成,免疫印迹(Western-blotting)分析紫红笛鲷过敏原,通过离子交换层析对总蛋白粗浸液进行分离并鉴定不同组份的免疫学特性。结果紫红笛鲷可溶性蛋白粗提液SDS-PAGE显示有20条蛋白条带,对鱼过敏病人的阳性混合血清能与其中7个条带反应,分子量分别是42000,36000,30000,27000,25000,17000和12000Mr。离子交换层析后分子量为42000、36000、12000Mr的阳性过敏原蛋白具有免疫学活性。结论本实验对紫红笛鲷过敏原进行了提取、分离和免疫学特性鉴定,离子交换层析技术可以用于紫红笛鲷过敏原蛋白的分离纯化,为紫红笛鲷过敏原的进一步研究和鱼类食品过敏的防治奠定了理论基础。     

缓症链球菌致热性外毒素蛋白的生化性质

目的研究缓症链球菌外毒素蛋白的分子量、等电点、氨基酸组成及N-末端序列。方法将纯化的毒素蛋白用SDS-PAGE电泳,据低分子量标准蛋白质算出其相对分子质量;以微型聚丙烯酰胺等电聚焦(miniIEF)法进行此毒素蛋白的等点电测定;采用电印迹将SDS-PAGE电泳胶上的毒素蛋白转移到PVDF膜上,用Beckman344HPLC仪测定外毒素蛋白的氨基酸组成;用自动化蛋白质序列仪测定缓症链球菌外毒素N-末端氨基酸序列。结果缓症链球菌外毒素蛋白的相对分子质量为34000;测定毒素蛋白的等点电为6.2,是一种偏酸性蛋白;外毒素蛋白由17种氨基酸组成,其中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、门冬氨酸、赖氨酸、缬氨酸等氨基酸含量较高;缓症链球菌外毒素蛋白N-末端氨基酸序列为VSNLSRGMGA,本毒素N-末端氨基酸序列与β溶血链球菌外毒素蛋白(SPEA、SPEB、SEPC)N-     

家蚕蚕蛹变应原的鉴定、分离与纯化

目的鉴定、分离和纯化大造(Dazao)品系家蚕(Bombyxmori)的蚕蛹粗提液中的变应原蛋白质组分,为家蚕变应原的蛋白质组学和功能基因组学深入研究奠定基础。方法采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blotting,鉴定了家蚕蚕蛹粗浸液中变应原蛋白质分子,并通过阴离子交换和凝胶过滤层析分别对家蚕蚕蛹变应原蛋白质进行初步纯化。结果在家蚕蚕蛹粗浸液中含有表观分子量分别为80000及30000的蚕蛹变应原;从家蚕蛹全虫粗提液中初步分离到分子量为30000的蛹变应原蛋白组分。结论分离得到的家蚕蚕蛹变应原蛋白组分可用于系统研究家蚕过敏原蛋白分子的蛋白质组学和功能基因组学。