实时RT-PCR基因表达相对定量REST(C)软件分析与2(-△△CT)法比较

目的 利用实时RT-PCR技术建立一种简便、准确的基因表达相对定量方法.方法 以正常的人支气管上皮细胞株(16HBE)cDNA为模板5倍系列稀释,分别作DNA聚合酶K(POLK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因标准曲线.以不同剂量反式二羟环氧笨并芘(anti-BPDE)诱导的16HBE、anti-BPDE转化的16HBE及肺癌细胞株(H1299)cDNA为模板,进行实时定量RT-PCR.以GAPDH基因作为内参照.进行POLK基因表达相对定量.实验数据分别采用2(-△△CT)法及REST(C)软件分析.结果 5倍系列稀释法制作的标准曲线,呈现较好的线型关系(Rsq 0.997).POLK及GAPDH基因扩增效率分别为117.5%和103.5%.采用2(-△△CT)法计算出的表达比值均比REST(C)软件分析高.结论 实时RT-PCR技术结合REST(C)软件分析是一种简便、准确的基因表达相对定量分析手段.     

实时RT-PCR基因表达相对定量REST~软件分析与2~((-ΔΔCT))法比较

目的利用实时RT-PCR技术建立一种简便、准确的基因表达相对定量方法。方法以正常的人支气管上皮细胞株(16HBE)cDNA为模板5倍系列稀释,分别作DNA聚合酶K(POLK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因标准曲线。以不同剂量反式二羟环氧笨并芘(anti-BPDE)诱导的16HBE、anti-BPDE转化的16HBE及肺癌细胞株(H1299)cDNA为模板,进行实时定量RT-PCR。以GAPDH基因作为内参照,进行POLK基因表达相对定量。实验数据分别采用2(-ΔΔCT)法及REST软件分析。结果5倍系列稀释法制作的标准曲线,呈现较好的线型关系(Rsq0.997)。POLK及GAPDH基因扩增效率分别为117.5%和103.5%。采用2(-ΔΔCT)法计算出的表达比值均比REST软件分析高。结论实时RT-PCR技术结合REST软件分析是一种简便、准确的基因表达相对定量分析手段。     

实时荧光定量PCR检测人肝癌组织皮层肌动蛋白基因

目的建立实时荧光定量PCR检测皮层肌动蛋白基因表达水平的方法。方法提取人肝癌组织总RNA,RT—PCR扩增CTTN和GAPDH基因片段并分别构建两片段阳性表达载体。采用SYBR Green I实时荧光定量PCR绘制两基因拷贝数标准曲线,实测人肝癌标本并进行方法学评价。结果成功构建pMD18-T（＋）／CTTN和pMD18-T（＋）／GAPDH重组质粒。CTTN和GAPDH基因模板拷贝数分别在1．6×10^3-1．6×10^7和1．6×10^4-1．6×10^7之间时标准曲线有良好线性关系,R^2分别为0．996和0．985。由Ct值统计两基因组内变异系数分别为0．11％～2．25％和0．75％-3．63％;组间变异系数分别为0．83％～1．48％和0．47％～1．36％。组间无统计学差异（P〉0．05）。结论成功建立实时荧光定量PCR检测人肝癌组织CTTN基因的方法,为研究人肝癌组织CTTN基因表达水平奠定了方法学基础。     

BCR/ABL融合基因和转录因子FoxO3a在初发和急变慢性粒细胞白血病患者中的表达变化

目的:观察慢性粒细胞白血病(CML)初发和急变患者外周血BCR/ABL融合基因和转录因子FoxO3a的表达变化及其意义.方法:利用EVA Green建立实时荧光RT-PCR检测BCR/ABL、FoxO3a和GAPDH的方法,检测25例CML初发和25例CML急变患者的外周血样本中BCR/ABL融合基因和FoxO3a的表达,以及30例正常人外周血样本中FoxO3a的表达,以GAPDH为内参基因,各组基因表达水平的差异采用△△CT相对定量法.结果:CML急变患者外周血BCR/ABL融合基因的表达水平是初发患者的4.72倍,正常人外周血样本中FoxO3a的表达水平分别是CML初发和急变患者的143.39倍和8.18倍.结论:BCR/ABL融合基因的高表达与转录因子FoxO3a的低表达可能与CML不同阶段的病理过程相关联.     

分子信标实时定量PCR法检测胃癌中Survivin基因mRNA的表达

目的 采用分子信标实时定量PCR方法检测胃癌样本中Survivin基因mRNA的表达量，并分析其与临床资料之间的关系。方法 设计Survivin基因特异性分子信标探针和引物，以cDNA克隆重组质粒为标准品，建立Survivin基因实时定量检测方法；并检测胃癌样本中Survivin基因mRNA的模板拷贝数。结果 Survivin基因mRNA分子信标实时定量检测方法的线性范围为10^3-10^10拷贝数，批间变异为28．16％，批内变异为13．34％，灵敏度为42个拷贝数，平均回收率为109．83％；胃癌组织、癌旁组织和正常组织以及胃良性病变组织间比较，mRNA模板拷贝数差异有显著性（P〈0．05）；胃癌样本中mRNA模板拷贝数与淋巴结转移和2年生存期以及病理类型相关（P〈0．05）。结论 成功建立Survivin基因分子信标实时定量检测方法。胃癌中该基因表达的模板拷贝数可作为预测淋巴结转移、评价预后的一个重要指标。     

结直肠癌组织定量RT-PCR分析中内参基因的选择

目的:筛选适用于结直肠癌组织样本的内源性参照基因?方法:以10例结直肠癌患者组织总RNA为研究材料,采用实时定量RT-PCR检测GAPDH?ACTINB?UBC?HRPT1和18S rRNA这5个候选内参基因的表达量,应用geNorm和NormFinder两种软件分析选择最佳内参基因?结果:geNorm软件发现GAPDH与ACTINB的M值相对最小,为最佳内参基因组合,18S rRNA的M值最大,稳定度最低;而NormFinder软件分析认为GAPDH表达稳定性最佳,UBC次之?结论:适用于结直肠癌组织样本RT-PCR实验的内参基因为GAPDH,最佳组合为GAPDH与ACTINB,而18S rRNA及HRPT1不是合适的内参基因?     

OGGl基因表达的半定量RT-PCR检测方法的建立

目的培养的犬肾细胞（MDCK）内8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（OGGl）基因表达的半定量RT-PCR检测体系的建立。方法培养MDCK细胞后提取总RNA,经优化进行RT-PCR反应,检测细胞内OGGl基因的表达。扩增产物经测序同GenBank中OGGl基因序列比对验证产物的准确性,条带经ImageJ软件分析并与内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）相比,对体系的重复性进行分析。结果扩增产物证实与GenBank中该细胞的OGGl基因序列一致;重复性测定发现,MDCK细胞OGGl与GAPDH灰度值比值的均值为（0．84±0．025）,CV值为2．99％。结论本方法的准确性、重复性均较好,可用于半定量检测培养细胞尤其是MDCK细胞内OGGlmRNA的表达量。     

热化疗对结肠癌LOVO细胞胞嘧啶脱氨酶基因表达的影响

目的：探讨温热疗法对转染胞嘧啶脱氨酶基因的基因表达有无影响。方法：脂质体法将质粒GICEACDNa转染结肠癌LOVO细胞,G418筛选抗体克隆并扩增,给予前药5-氟胞嘧啶（5-FC）进行热化疗;以beta—actin为内参照用实时荧光定量PCR检测热化疗前后CD基因表达量有无变化。结果：实时荧光定量PCR（Real-TimeRT—PCR）检测得到热化疗前CD基因表达的ct值29．53土1．1974,beta—actinct值20．82±2．7385;热化疗后CD基因表达的ct值30．285±1．201,beta—actinct值21．225±2．237;行△△Ct法进行相对定量比较无明显差异（P〉0．05,t=1．4521,v=38）。结论：温热疗法对转染G1CEACDNa的LOVO细胞CD基因的表达无明显影响。     

实时荧光定量RT-PCR检测急性白血病中Bmi-1基因mRNA的表达及意义

[目的]建立荧光实时定量RT—PCR（FQRT—PCR）检测Bmi—1基因mRNA的方法并研究该基因在急性白血病细胞中表达的意义。[方法]根据Genbank提供的序列,设计目的基因Bmi-1及内参基因GAPDH的扩增引物,将Bmi-1及GAPDHRT—PCR扩增片段克隆入载体pMDl8-Tsimple,经测序鉴定正确后,进行纯化、定量及系列稀释,应用SYBRGreenI荧光染料,建立检测Bmi-1mRNA的FQRT—PCR方法,并对其线性及特异性进行评价。应用此方法检测21例急性白血病及10例健康人外周抗凝血中Bmi-1mRNA的表达水平。【结果]该方法的线性范围为1．0×10^3-1．0×10^8eopies／txL,相关系数为-1．00,熔解曲线分析扩增产物显示单-的峰,熔解温度（Tm）为80．4℃。急性白血病患者的相对表达量为0．56±0．12,健康对照组中Bmi-1mRNA的相对表达量为0．19±0．08,两者的表达差异有统计学意义（P〈0．05）。[结论]实时荧光定量RT—PCR方法检测Bmi-1基因表达,具有高敏感性和高特异性等优点,可作为进-步研究Bmi-1基因的方法。Bmi-1基因参与急性白血病的发生,可能是一种新的肿瘤标志物。     

B细胞激活因子受体家族基因表达与原发性胆汁性肝硬化相关性研究

目的探讨B细胞激活因子（BAFF）受体家族基因表达水平与原发性胆汁性肝硬化（PBC）的相关性。方法以18SrRNA为内参基因,通过靶基因与内参基因循环阈值之差,建立实时荧光逆转录聚合酶链反应（FQ—RT-PCR）相对定量方法,检测30例正常人和30例PBC患者外周血单个核细胞B细胞成熟抗原（BCMA）,穿膜蛋白活化物（TACI）及B细胞激活因子受体（BAFF—R）基因的相对表达量,并分析其与免疫球蛋白IgM、碱性磷酸酶（AIJP）及γ-谷氨酰转肽酶（GGT）的相关性。结果PBC患者外周血单个核细胞BCMA mRNA是正常对照组的8．6倍,差异有统计学意义（P〈0．05）;TACI mRNA显著低于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;而BAFF—R mRNA比正常对照组稍降低,差异无统计学意义（P〉0．05）。BCMA的△Ct值与IgM、GGT和ALP有相关性（P〈0．01）;TACI的△ct值与IgM有相关性（P〈0．05）,与GGT、ALP无相关性（均P〉0．05）;BAFF—R与IgM、GGT和ALP均无相关性（均P〉0．05）。结论PBC患者外周血单个核细胞BCMA mRNA表达水平显著升高,TACI基因表达明显降低,提示PBC发病机制与体液免疫增强、免疫耐受打破有关,且BCMA可能与PBC的疾病进程有关。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法，测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477bp的片段，将该片段克隆到pGEMT载体上，构建pGEM-SIV gag477质粒。该质粒经大量扩增纯化后定量，10倍系列稀释后，做出标准曲线，作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Kit，该标准品可精确定量到10copies／μL。结论制备的pGEM-SIV gag477质粒外标准品纯度高，SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高，稳定性好，可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA载量。     

双黄连抑制流感病毒甲_1型基因的研究

目的建立实时荧光定量RT-PCR检测流感病毒甲1型多聚酶蛋白（PA）基因,了解双黄连作用病毒的效应。方法采用实时荧光定量RT-PCR法标准曲线测药物抑制甲1型PA病毒基因效应。结果以实时荧光RT-PCR法,重复测7次取平均值,对照组病毒基因为3.62×10^6±0.90拷贝数/mg,试验组病毒基因为4.57×10^5±1.23拷贝数/mg。发现病毒对照组基因明显高于试验组（P〈0.001）。结论提示双黄连可抑制流感病毒甲1型基因。     

Pax-8基因敲除小鼠心脏中Fgf-6基因表达的上调及其意义

目的探讨先天性心脏病相关基因转录因子Pax-8的下游基因以及Pax-8基因下调引起心脏形态改变的机制。方法分别提取Pax-8基因敲除小鼠纯合子（Pax-8 KO^-/-）和杂合子（Pax-8 KO^4/-）的心脏总RNA,利用含31802个小鼠基因的基因芯片检测Pax-8 KO^-/-和Pax-8 KO^-/-小鼠的基因表达水平,找出差异表达的基因,并经荧光实时定量PCR技术初步筛选出转录因子Pax-8的下游基因。结果基因芯片检测发现,Pax-8 KO^-/-小鼠较Pax-8 KO^＋／-小鼠有25个基因表达下调,另有17个基因表达上调,差异基因涉及细胞周期及信号转导的调节因子、直接参与代谢的酶以及核转录因子等。定量RT-PCR证实,Pax-8 KO^-/-小鼠Fgf-6基因的表达水平较Pax-8 KO^＋/-小鼠及野生型（Pax-8^＋/＋）小鼠分别上调1.13倍和1．67倍,差异均较显著（P〈0.01）。结论Fgf-6基因是转录因子Pax-8的下游基因,可能在心脏的发育过程中发挥着重要作用。     

新的高血压相关基因-HSP70．2的实验研究

目的探讨自发性高血压大鼠新的致病相关基因。方法使用基因芯片技术初步筛选自发性高血压大鼠SHR和正常血压大鼠WKY二级肠系膜动脉和肾脏组织中表达水平不同的基因,再用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和定量RT-PCR排除假阳性候选基因。结果在SHR组中基因芯片发现19个上调基因,另外发现19个基因表达下调。RT-PCR和定量RT-PCR证实HSP70．2基因在SHR组中表达上调2．1倍(P<0．01),而内参照GAPDH在两组的差异无统计学意义(P>0．05)。结论HSP70．2基因和高血压相关,深入研究HSP70．2基因及其功能为进一步了解高血压病的分子机制提供新的思路和线索。     

Pax-8基因敲除小鼠心脏中NR4A1基因表达上调

目的：寻找先天性心脏病室间隔缺损相关基因——转录因子Pax-8保护细胞凋亡的途径。方法：提取Pax-8基因敲除小鼠纯合子（Pax-8 KO-/-）和杂合子（Pax-8 KO＋/-）的心脏总RNA,利用小鼠基因的基因芯片检测两组小鼠基因表达水平,找出差异表达的基因,并经半定量RT-PCR和荧光实时定量PCR技术初步筛选出转录因子Pax-8的下游基因。结果：基因芯片检测发现,与Pax-8 KO＋/-组相比,在Pax-8 KO-/-小鼠中有25个基因表达下调,17个基因表达上调。用半定量RT-PCR验证发现,nuclear receptor sub-family4,group A,member 1（NR4A1）基因在Pax-8 KO-/-组上调。定量RT-PCR亦证实在Pax-8 KO-/-组NR4A1基因的表达水平较Pax-8 KO＋/-组及Pax-8＋/＋（野生型）组分别上调1.53倍和4.79倍（P〈0.01）。结论：NR4A1基因受Pax-8基因调控,在Pax-8保护细胞凋亡途径中发挥作用。     

建立SYBR Green实时RT-PCR定量检测大鼠I型胶原mRNA水平方法

目的：基于双链嵌合荧光染料SYBR Green Ⅰ,建立一种快速、灵敏的检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法．方法：提取大鼠肝脏总RNA,RT-PCR扩增Ⅰ型胶原基因部分片段,将其克隆入pMD18-T载体用作参比品．基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料建立检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平方法．其中对一系列连续稀释的参比品进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性．结果：重组质粒构建成功,经测序鉴定,目的片段已插入pMD18-T载体内．所建立的实时RT-PCR方法的最低检测限度为1个拷贝／反应,在每反应10^0～10^7拷贝范围内,CT值（C代表cycle,T代表threshold;CT值指荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数）与起始模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0．991．结论：所建立的基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料的大鼠Ⅰ型胶原PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于进一步的各种组织的大量样本检测．     

实时荧光RT—PCR定量检测BRMS1基因表达

目的建立一种实时荧光RT—PCR定量检测乳腺组织中BRMS1 mRNA表达水平的方法。方法采明逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增目的基因片段,并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,计算出待测样本中BRMS1 mRNA含量,并以BRMS1 mRNA与GAPDHmRNA的比值作为BRMs1 mRNA的表达水平。结果实时荧光RT—PCR检测BRMS1及GAPDH的线性范围为4&#215;10^2-4&#215;10^8拷贝／μl。批内和批间变异系数分别为3．9％-4．6％和4．8％-5．5％。BRMS1 mRNA表达范围为0—1．65．结论实时荧光定量检测BRMS1 mRNA含量的方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。     

实时荧光定量PCR检测REST基因在小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨REST基因在小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义。方法应用实时荧光定量PCR对30例小细胞肺癌组织及癌旁组织中REST进行检测。结果REST在小细胞肺癌组织中的表达水平0．596比正常肺组织0．949明显降低（P〈0．05）,小细胞肺癌组织中REST的表达与肿瘤的分化程度及侵袭性有关（P〈0．05）。结论REST在小细胞肺癌组织中有低表达,可能参与小细胞肺癌的发病,可能有助于小细胞肺癌的早期诊断、治疗及预后。     

三种荧光染料 SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量 PCR应用中的比较

目的：探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real－time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0．98（除1个样品为0．97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0．8～1．0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2／3样品＞1．2,而后两种染料为0．9～1．2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。     

不同引物及数据分析方法对定量PCR结果的影响

目的:研究不同引物及数据分析方法对实时荧光定量PCR SYBR Green染料法检测基因表达差异结果分析的影响.方法:通过Primer Express 2.0软件对目的基因CCNDI、C-JUN分别设计4对不同引物进行SYBR Green染料法定量PCR扩增.并分别使用2-△△CT法、Pfaffl法及相对标准曲线法计算肺癌紫杉醇敏感细胞株及耐药细胞株问日的基因的表达差异.分析不同引物和数据计算方法对实验结果的影响.结果:统计学分析表明,引物的扩增效率对定量PCR结果分析有显著影响.不同引物特异性扩增得到的样本间表达倍数有显著差异(P<0.05).3种计算方法中,Pfaffl法与相对标准曲线法无统计学差异(P>0.05),而2-△△CT法与其他2种方法均有显著差异(P<0.05).结论:引物的选择对于定量PCR结果有显著影响;Pfaffl法是更准确,更合理的相对定量计算方法.